劉暢 殷華 莊以彬 劉濤（中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

纈草-4，7（11）-二烯在大腸桿菌中的生物合成

劉暢 殷華 莊以彬 劉濤
（中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

纈草-4，7（11）-二烯是一種雙環(huán)倍半萜烯類化合物，具有鎮(zhèn)靜、減緩壓力、抗焦慮的作用，可用來治療注意力缺陷多動癥（ADHD）等精神疾病。旨在實現(xiàn)纈草-4，7（11）-二烯在大腸桿菌中的從頭合成，通過在大腸桿菌BL21（DE3）過表達(dá)酵母源，甲羥戊酸途徑中催化乙酰輔酶A合成焦磷酸法尼基（FPP）的8個相關(guān)基因及來源于纈草屬植物（Valeriana officinalis）的纈草-4，7（11）-二烯合酶（VoTPS）基因；并采用水相和有機相雙相發(fā)酵的方法，通過GC-MS在有機相中檢測到了纈草-4，7（11）-二烯，實現(xiàn)了大腸桿菌中從頭合成纈草-4，7（11）-二烯。并對IPTG濃度、蛋白誘導(dǎo)溫度和選擇不同的有機相等方面進行初步優(yōu)化后，確定發(fā)酵條件為：蛋白誘導(dǎo)溫度20℃、IPTG的濃度為0.1 mmol/L，有機相為正十二烷。

大腸桿菌；纈草-4，7（11）-二烯；生物合成；纈草-4，7（11）-二烯合酶（VoTPS）

纈 草-4，7（11）-二 烯［valerian -4，7（11）-diene］是一種可揮發(fā)性的倍半萜烯類化合物，具有高度的鎮(zhèn)靜作用［1］。其主要存在于甘松屬植物（Nardostachys chinensis）及纈草屬植物（Valeriana officinalis）的根部中［2］，這些植物的根部提取物常被古希臘、古羅馬及古代亞洲國家用作鎮(zhèn)靜劑及抗焦慮藥物［3］。纈草的根部提取物纈草油中主要含有單萜、倍半萜、環(huán)烯醚萜衍生物、生物堿如獼猴桃堿等，其中所含的纈草-4，7（11）-二烯的衍生物纈草烯酸也有鎮(zhèn)靜作用［4-7］。甘松屬植物提取的甘松精油一直以來常被芳香療法使用，可緩解日常壓力帶來的身體紊亂癥狀，如失眠、消化不良等［8］。在甘松精油中富含纈草-4，7（11）-二烯，其鎮(zhèn)靜作用已經(jīng)在實驗鼠身上得到證實［9］。常用的鎮(zhèn)靜劑主要是抗焦慮和精神抑制藥，具有易產(chǎn)生藥物依賴的副作用［10，11］。纈草-4，7（11）-二烯作為植物提取成分，由于其在常溫下的揮發(fā)性可使用吸入式給藥的方式，很有希望發(fā)展成為更小副作用的治療藥劑，用來治療注意力缺陷多動癥（ADHD）等精神疾病。目前，纈草-4，7（11）-二烯主要通過化學(xué)方法來合成，如以纈草烯酸為原料，通過還原、溴化等步驟實現(xiàn)合成［12］。然而，這種化學(xué)合成的方法原料成本高，易造成環(huán)境污染。利用微生物合成萜類的方法將會有效避免化學(xué)合成中復(fù)雜條件的控制以及環(huán)境污染等問題［13］。從纈草屬植物的根中鑒定纈草-4，7（11）-二烯合酶基因（VoTPS）功能，并在酵母中表達(dá)，在實現(xiàn)纈草-4，7（11）-二烯的合成之前已有報道［1］。大腸桿菌由于其遺傳背景清晰，遺傳操作技術(shù)簡單，易于大規(guī)?；后w發(fā)酵生產(chǎn)，作為天然化合物的異源合成宿主越來越受到重視。之前已經(jīng)有報道在大腸桿菌中成功實現(xiàn)萜類物質(zhì)紫衫烯、香葉醇、木香烴內(nèi)酯等化合物的合成［14-17］。纈草-4，7（11）-二烯在大腸桿菌中合成尚未見報道。本研究在大腸桿菌中增強焦磷酸法尼基合成的基礎(chǔ)上，采用質(zhì)粒pET28a過表達(dá)來源于纈草屬植物（Valeriana officinalis）的纈草-4，7（11）-二烯合酶（VoTPS）基因，進行纈草-4，7（11）-二烯在大腸桿菌中異源合成研究，并進行液體發(fā)酵及萃取條件的初步探索，以期實現(xiàn)纈草-4，7（11）-二烯在大腸桿菌中的高效合成。本研究所構(gòu)建合成途徑如圖1所示。

圖1 纈草-4，7（11）-二烯合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α及BL21（DE3）由本實驗室保存，DH5α用于質(zhì)粒的擴增及基因克隆，BL21（DE3）用于蛋白的過表達(dá)及合成纈草-4，7（11）-二烯。質(zhì)粒pET28a購于Novagen公司，質(zhì)粒 pBbA5c-M-M［pBbA5c-MevT（CO）-MBIS（CO，ispA）］由Jay Keasling實驗室構(gòu)建并贈與。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 Phusion超保真DNA聚合酶購自New England Biolabs公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、Nco I購自Fermentas公司；T4連接酶購自TaKaRa Biotechnology公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自北京索萊寶生物科技有限公司；正十二烷、正癸烷、正己烷購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，用于質(zhì)粒的構(gòu)建、擴增、種子液的準(zhǔn)備。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨16 g/L，NaCl 5 g/L，甘油2%（W/V），用于蛋白質(zhì)的過表達(dá)，及發(fā)酵生產(chǎn)纈草-4，7（11）-二烯。適量的抗生素：氯霉素25 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）：濃縮膠（4 mL）：H2O 2.7 mL，30%丙烯酰胺 0.67 mL，1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.5 mL，10% SDS 0.04 mL，10%過硫酸銨 0.04 mL，TEMED 0.004 mL；分離膠（10 mL）：H2O 3.3 mL，30%丙烯酰胺4 mL，1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）2.5 mL，10% SDS 0.1 mL，10%過硫酸銨 0.1 mL，TEMED 0.004 mL。

1.2 方法

1.2.1 基因擴增 VoTPS（GenBank accession number：JQ437840）來自纈草屬植物（Valeriana officinalis），由上海捷瑞公司合成，為了在大腸桿菌中使用進行了密碼子優(yōu)化，用VoTPSsyn來表示。合成的VoTPSsyn基因片段被克隆到DEV載體，由捷瑞公司構(gòu)建成載體DEV-VoTPS。用此載體作為PCR模板；PCR引 物 為 VoTPS-NcoI5FP：5'-CCCccatggaatcttgtctgag cttttctagtc-3'（下劃線為Nco I酶切位點），VoTPSHindⅢ3RP：5'-CATGaagcttggtaccccgcggttaatacggaactg-3'（下劃線為Hind Ⅲ酶切位點）。PCR參數(shù)：95℃ 2 min；95℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 1.5 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠電泳回收目的片段。

1.2.2 質(zhì)粒及重組菌構(gòu)建 以限制性內(nèi)切酶和Nco I和Hind Ⅲ對pET28a質(zhì)粒和VoTPSsyn分別進行酶切；通過凝膠電泳回收載體及基因片段；以載體與基因片段摩爾數(shù)比為1∶3進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得質(zhì)粒pET28a-VoTPS。將質(zhì)粒pBbA5c-M-M轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（DE3）/MM。將質(zhì)粒pET28a-VoTPS與pBbA5c-M-M共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（DE3）/MMV。將pET28a和pET28a-VoTPS分別轉(zhuǎn)入BL21中，獲得重組菌BL21（DE3）/空與獲得重組菌BL21（DE3）/V。

1.2.3 SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá) 分別挑取BL21（DE3）/空與BL21（DE3）/V菌株單克隆于5 mL液體LB中，37℃培養(yǎng)12 h；按體積比1∶100 轉(zhuǎn)接至50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600為0.7-1.0，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于30℃進行蛋白誘導(dǎo)6-8 h，收集發(fā)酵液2 mL，12 000 r/min離心10 min；加入200 μL的5×loading buffer，沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，上樣量5 μL。

1.2.4 重組菌發(fā)酵培養(yǎng) 挑取BL21/MMV菌株單克隆于5 mL液體LB中，37℃培養(yǎng)12 h；按體積比為1∶100轉(zhuǎn)接至50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.7-1.0，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于30℃進行蛋白誘導(dǎo)，再加入5 mL的正十二烷進行雙相培養(yǎng)基發(fā)酵48-60 h。

1.2.5 纈草-4，7（11）-二烯GC-MS分析鑒定 收集發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，取正十二烷層進行檢測。GC-MS檢測系統(tǒng)是安捷倫氣相色譜儀7890A；檢測條件為：安捷倫色譜柱19091S-433，30 m×250 μm×0.25 μm；起始溫度設(shè)定為40℃，保留時間2 min，以10℃/min的線性增長速率升溫到250℃，保留時間5 min；進樣口溫度為250℃，進樣量1 μL。檢測有5 min的溶劑延遲。

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化 蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：按1.2.4所述方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，其中蛋白誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置20℃、30℃和37℃；IPTG濃度優(yōu)化：按1.2.4中所述方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，其中IPTG終濃度分別0.1、0.5和1 mmol/L；有機相的選擇：按1.2.4中所述方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，其中加入的5 mL有機相分別為正十二烷、正癸烷、正己烷。以優(yōu)化后的條件進行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后取有機相進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 載體pET28a-VoTPS的構(gòu)建及驗證

擴增得到VoTPSsyn片段大小為1.7 kb（圖2-A）。重組載體pET28a-VoTPS用Hind Ⅲ和Nco I酶切驗證，得到大小為1.7 kb和5.3 kb兩條帶（圖2-B），與理論大小一致，并送金唯智測序公司進行了DNA測序驗證。質(zhì)粒pET28a-VoTPS如圖2-C所示。

圖2 載體pET28a-VoTPS構(gòu)建

2.2 SDS-PAGE檢測纈草-4，7（11）-二烯合酶表達(dá)

BL21（DE3）/空與BL21（DE3）/V菌株按照1.2.3的方法發(fā)酵并誘導(dǎo)蛋白，制備樣品，進行蛋白膠電泳，染色，脫色后的SDS-PAGE如圖3所示。

2.3 纈草-4，7（11）-二烯工程菌的構(gòu)建

質(zhì)粒載體pBbA5c-M-M［pBbA5c-MevT（CO）-MBIS（CO，ispA）］內(nèi)含有的8個基因，在大腸桿菌中過表達(dá)后，可增強乙酰輔酶A經(jīng)甲羥戊酸途徑轉(zhuǎn)變成焦磷酸法尼基；第一部分使乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變成甲羥戊酸的3個基因為：大腸桿菌來源的乙酰乙酰輔酶A合酶基因（atoB），酵母來源的羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）合酶基因（HMGS）和氨基端被截短的羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因（HMGR）。第二部分使甲羥戊酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻沽姿岱峄?個基因為：來自酵母的甲羥戊酸激酶基因（MK）、磷酸甲羥戊酸激酶基因（PMK）、磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因（PMD），來自大腸桿菌的異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因（idi）和焦磷酸法尼基合酶基因（ispA）。

圖3 BL21（DE3）/空與BL21（DE3）/V的SDS-PAGE檢測圖

將載體pET28a-VoTPS與pBbA5c-M-M共轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）中，獲得纈草-4，7（11）-二烯工程菌株BL21（DE3）/MMV。pBbA5c-M-M轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）中，獲得產(chǎn)焦磷酸法尼基工程菌株BL21（DE3）/MM，作為BL21（DE3）/MMV的對照。

2.4 發(fā)酵液正十二烷層中纈草-4，7（11）-二烯GC-MS檢測及鑒定

對重組菌BL21（DE3）/MMV及BL21（DE3）/ MM進行發(fā)酵培養(yǎng)，分別取60 h的發(fā)酵液正十二烷層進行GC-MS檢測，圖4顯示，在15.101 min處有新化合物的產(chǎn)生。纈草-4，7（11）-二烯分子量為204，GC-MS檢測結(jié)果顯示15.101 min主要碎片峰也為204，與已經(jīng)報道的纈草-4，7（11）-二烯質(zhì)譜圖作對照，確定該峰對應(yīng)的化合物為纈草-4，7（11）-二烯。

圖4 工程菌發(fā)酵液正十二烷層GC-MS

2.5 蛋白誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度和有機相的選取對產(chǎn)量的影響

為進一步提高纈草-4，7（11）-二烯的產(chǎn)量，選擇更合適的發(fā)酵條件，本研究對蛋白誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和有機相的選取進行了單因素優(yōu)化篩選。當(dāng)?shù)鞍渍T導(dǎo)溫度為20℃時，纈草-4，7（11）-二烯GC-MS響應(yīng)信號的產(chǎn)物峰最面積最大為30℃的200多倍且前體FPP幾乎轉(zhuǎn)化完全，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃時，幾乎沒有檢測到產(chǎn)物的生成（圖5-A）；當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmol/L時，纈草-4，7（11）-二烯GC-MS響應(yīng)信號的產(chǎn)物峰面積最大，并且隨著IPTG濃度增大，產(chǎn)物量減少（圖5-B）；當(dāng)有機相為十二烷時，纈草-4，7（11）-二烯GC-MS響應(yīng)信號的產(chǎn)物峰面積最大，且相較于正癸烷萃取出的副產(chǎn)物較少。在加入正己烷的一組中菌體細(xì)胞生長停滯進而死亡，正己烷幾乎揮發(fā)完全，無法進行檢測（圖5-C）。

圖5 纈草-4，7（11）-二烯發(fā)酵條件初步優(yōu)化

3 討論

本研究在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)了纈草-4，7（11）-二烯合酶（VoTPS）基因及合成FPP的酵母源的8個基因，實現(xiàn)了在大腸桿菌中從頭生物合成纈草-4，7（11）-二烯，并初步確定了合適發(fā)酵的條件。由于纈草-4，7（11）-二烯具有揮發(fā)性，使用水相及有機相的雙相培養(yǎng)基進行發(fā)酵，可在有機相正十二烷層檢測到纈草-4，7（11）-二烯生成。有機相十二烷對產(chǎn)物有吸附作用，可減少揮發(fā)，有利于產(chǎn)物的檢測；與之對照的未加十二烷的單水相發(fā)酵液中使用高效液相色譜（HPLC）并未檢測到纈草-4，7（11）-二烯生成，也說明了雙相發(fā)酵的必要性。但目前對有機相中的纈草-4，7（11）-二烯后續(xù)的分離純化條件及定量［19］還需進行摸索。

VoTPS基因來源于纈草屬植物，本研究中僅對其DNA序列進行密碼子的優(yōu)化，為了使蛋白在大腸桿菌中更好地異源表達(dá)，進行了誘導(dǎo)劑IPTG濃度和蛋白誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化，初步確定了更合適的蛋白誘導(dǎo)條件，即蛋白誘導(dǎo)溫度為20℃、IPTG的濃度為0.1 mmol/L，未來工作中還可以通過提高蛋白的可溶性等方面來提高蛋白的表達(dá)及活性［20］，從而進一步提高其產(chǎn)量。另外選擇了不同的有機相作為萃取劑，萃取效果最好的為正十二烷，并且萃取出的副產(chǎn)物較少。當(dāng)加入的有機相為正己烷時，菌體生長停滯進而死亡，推測可能正己烷對菌體細(xì)胞具有毒性，發(fā)酵結(jié)束后正己烷幾乎揮發(fā)完全，所以正己烷不適合做雙相發(fā)酵的有機相；后續(xù)還可以進行發(fā)酵培養(yǎng)基水相成分的優(yōu)化［21］，繼續(xù)篩選不影響對菌體生長且更易吸附纈草-4，7（11）-二烯的有機相。

纈草-4，7（11）-二烯的衍生物纈草烯酸（valerenic acid）也具有與纈草-4，7（11）-二烯相似的抗焦慮的藥用價值［22］，其作用靶點和作用方式研究的更為透徹［23，24］。在纈草屬植物（Valeriana officinalis）中，纈草烯酸的合成路徑及相關(guān)的酶尚未鑒定清楚，但推測纈草烯酸是由纈草-4，7（11）-二烯經(jīng)過氧化合成的［1］。本研究也曾嘗試在重組菌BL21（DE3）/MMV的基礎(chǔ)上表達(dá)來自菊苣屬（Cichorium intybus）的吉瑪烯A氧化酶（germacrene A oxidase） 基 因CiGAO和 來 自 蒿 屬（Artemisia annua）的細(xì)胞色素P450還原酶基因AaCPR［25，26］，希望在纈草-4，7（11）-二烯的基礎(chǔ)上繼續(xù)合成纈草烯酸，但并未在發(fā)酵液中檢測到纈草烯酸的生成。在后續(xù)的研究中從纈草屬植物中發(fā)掘合成纈草烯酸的氧化酶也是一個重要的研究方向。

4 結(jié)論

本研究在大腸桿菌中表達(dá)了酵母及纈草屬植物來源的9個外源基因，構(gòu)建了纈草-4，7（11）-二烯生物合成途徑，使用氣相色譜檢測并鑒定了產(chǎn)物纈草-4，7（11）-二烯的生成。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Biosynthesis of Valerena-4，7（11）-diene in an Engineered Escherichia coli Strain

LIU Chang YIN Hua ZHUANG Yi-bin LIU Tao
（Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Valerena-4，7（11）-diene is a bicyclic sesquiterpene and shows particularly profound sedative，stress reducing and anxiolytic effects，and it could be used to treat attention deficit hyperactivity disorder（ADHD）and other mental illness. To achieve the de novo biosynthesis of valerena-4，7（11）-diene in Escherichia coli，eight genes of Saccharomyces cerevisiae involved in converting acetyl-CoA into farnesyl diphosphate（FPP）from mevalonate pathway and the valerena-4，7（11）-diene synthase（VoTPS）gene from Valeriana officinalis were co-overexpressed in BL21（DE3）. Adopting the bipolar fermentation method of water phase and organic phase，the valerian-4，7（11）-diene was detected in organic phase by GC-MS，indicating that the synthesis of valerian-4，7（11）-diene was achieved initially in the E. coli. After primarily optimizing the IPTG concentration，the temperature of protein induction and choice of varied organic phases，the fermentation conditions were determined as follows：protein induced temperature was 20℃，the concentration of IPTG was 0.1 mmol/L，and organic phase was dodecane.

Escherichia coli；valerian-4，7（11）-diene；biosynthesis；valerian-4，7（11）-diene synthase（VoTPS）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.014

2016-10-10

國家自然科學(xué)基金資助項目（31400026）

劉暢，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)；E-mail：liu_chang@tib.cas.cn

殷華，女，博士，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)；E-mail：yin_h@tib.cas.cn