王 華, 王志紅

合肥市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科, 合肥 230000

大鼠慢性束縛應(yīng)激后腸道病理及其菌群變化

王 華, 王志紅*

合肥市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科, 合肥 230000

基于慢性束縛應(yīng)激法建立大鼠慢性應(yīng)激模型，結(jié)合蘇木精-伊紅染色和腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)-PCR技術(shù)觀察大鼠腸道組織病理及菌群變化規(guī)律。選取10只健康雄性sprague-dawley (SD)大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組5只。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，模型組采用束縛筒每天束縛應(yīng)激4 h，連續(xù)造模30 d，造模前后記錄大鼠的體重并于造模后進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估，采用脫臼法處死并收集大鼠腸道組織及其內(nèi)容物，包被切片后進(jìn)行HE染色，腸道內(nèi)容物初步分離后提取基因組DNA并采用ERIC-PCR檢測(cè)菌群變化規(guī)律。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，應(yīng)激模型組大鼠體重、穿越次數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)均顯著降低，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)、糖水偏愛(ài)顯著降低；造模后大鼠腸道微絨毛結(jié)構(gòu)破損嚴(yán)重，細(xì)胞核輕微固縮且深染，腸道菌群變化明顯，出現(xiàn)了多個(gè)特征性變化條帶。采用慢性束縛應(yīng)激法并結(jié)合行為學(xué)評(píng)估成功建立了大鼠慢性應(yīng)激模型，結(jié)合病理學(xué)檢測(cè)和腸道菌群表達(dá)譜變化為基于慢性應(yīng)激相關(guān)疾病的研究提供了重要參考，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

大鼠慢性束縛應(yīng)激模型；行為學(xué)評(píng)估；腸道組織；腸道菌群；變化

以往的研究揭示了應(yīng)激對(duì)機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)[7]、免疫系統(tǒng)[8]和胃腸道系統(tǒng)[9]等具有明顯的調(diào)控作用，初期的反應(yīng)調(diào)控機(jī)體的代償作用，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體分泌保護(hù)因子維持機(jī)體基本平衡，后期的反應(yīng)將造成機(jī)體的代償紊亂，出現(xiàn)嚴(yán)重的應(yīng)激性疾病。當(dāng)機(jī)體處于長(zhǎng)期的壓力應(yīng)激下，壓力信號(hào)通過(guò)機(jī)體的交感和副交感神經(jīng)傳導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致腸道出現(xiàn)不正常的生理改變而改變腸道菌群生活的環(huán)境，最終導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生顯著性改變[10,11]。本研究結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道研究慢性束縛應(yīng)激后大鼠的行為學(xué)變化、腸道病理學(xué)及菌群變化，以期從腸道菌群的角度為慢性應(yīng)激性損傷機(jī)理的研究提供新的研究思路和方法，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取10只成年雄性SD(sprague-dawley)大鼠，體重200～220 g，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組5只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)一周：自然光照，室溫22±2℃，自由攝取食物和水，每日定時(shí)更換飼料，通風(fēng)良好，排除其他應(yīng)激因素干擾。

1.2 方法

1.2.1 大鼠慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型制備 上述適應(yīng)性飼養(yǎng)的大鼠置于束縛筒中，每天束縛應(yīng)激4 h，連續(xù)應(yīng)激處理30 d。大鼠束縛期間禁食禁水，束縛結(jié)束后恢復(fù)自由飲水。其中，束縛筒用于限制大鼠的活動(dòng)范圍，對(duì)軀體和胃腸道等無(wú)壓迫，對(duì)其呼吸無(wú)抑制。束縛筒內(nèi)置一個(gè)移動(dòng)插片控制大鼠的活動(dòng)空間，調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的程度。

1.2.2 慢性束縛應(yīng)激大鼠行為學(xué)評(píng)估 ①曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)需要在安靜、暗光環(huán)境下進(jìn)行，行為測(cè)定于造模前和造模后各進(jìn)行1次。將大鼠放置曠場(chǎng)箱中，每次測(cè)定5 min，包括穿越格數(shù)(以穿越底面積塊數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)得分)、直立次數(shù)(為垂直運(yùn)動(dòng)得分)及理毛次數(shù)，記錄各組數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

②強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)前，分別將大鼠置于強(qiáng)迫游泳缸內(nèi)進(jìn)行預(yù)適應(yīng)游泳15 min，然后用毛巾擦干，24 h后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳6 min，計(jì)算大鼠后4 min在水面漂浮的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，記錄各組數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不動(dòng)時(shí)間判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)，四肢有輕微動(dòng)作以保持在水面即為不動(dòng)。

以天津市和平區(qū)、河西區(qū)、河?xùn)|區(qū)、南開(kāi)區(qū)、河北區(qū)、紅橋區(qū)6個(gè)區(qū)的養(yǎng)老機(jī)構(gòu)作為調(diào)研對(duì)象，每區(qū)隨機(jī)抽取8家養(yǎng)老機(jī)構(gòu)，共發(fā)放問(wèn)卷48份，回收有效問(wèn)卷46份，有效回收率95.8%。

③糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)。糖水消耗實(shí)驗(yàn)前，將大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)(1只/籠)，分別給予等體積的1%蔗糖水2瓶(200 mL/瓶)進(jìn)行糖水預(yù)適應(yīng)訓(xùn)練24 h。然后于造模禁水24 h后的第30 d，分別給予等體積的1%蔗糖水和純水各1瓶(200 mL/瓶)，1 h后稱量剩余液體的體積，計(jì)算大鼠的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗和糖水偏愛(ài)(糖水偏愛(ài)=糖水消耗/總液體消耗×100%)。記錄各組數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 樣品收集及處理 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，將大鼠脫臼處死，分別收集回腸、盲腸、結(jié)腸組織及其內(nèi)容物，組織樣本經(jīng)生理鹽水清洗后置于4%多聚甲醛固定備用，組織內(nèi)容物收集凍存于-80℃低溫冰箱待進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.4 HE染色 采用脫臼法處死大鼠，分別收集回腸、盲腸、結(jié)腸組織及其內(nèi)容物，組織樣本經(jīng)生理鹽水清洗后投入預(yù)先配好的固定液中(4%多聚甲醛)固定及切片，切片厚3～4 μm。脫水后進(jìn)行HE染色，蘇木精染色5 min，自來(lái)水沖洗多余染液；1%鹽酸乙醇(70%乙醇配制)分化15 s左右，鏡檢待細(xì)胞核和核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，自來(lái)水沖洗30 min，蒸餾水沖洗2 min；0.5%伊紅溶液染色5 min，使細(xì)胞核著色；梯度乙醇各脫水3 min：70%→85%→95%→100%；二甲苯I和II透明10 min后中性樹(shù)膠封片，采集圖片并進(jìn)行分析。分別選取每只大鼠胃部、回腸、盲腸、結(jié)腸較好的切片各1張，進(jìn)行40倍、100倍、200 倍光鏡下觀測(cè)拍照保存。

1.2.5 腸道組織內(nèi)容物基因組DNA提取 按照基因組DNA提取試劑盒所述步驟進(jìn)行回腸、盲腸、結(jié)腸等腸道組織內(nèi)容物基因組DNA提?。悍Q取180～200 mg組織內(nèi)容物置于2 mL EP管，加入1.4 mL GSL緩沖液，間歇振蕩混勻1 min，70℃水浴5 min；渦旋混勻15 s，13 000 r/min室溫離心1 min，吸取上清液至一新的2 mL EP管，加入抑制劑吸附片，室溫孵育1 min，13 000 r/min室溫離心3 min；吸取上清液至新的1.5 mL EP管并重復(fù)加入抑制劑吸附片并離心；吸取200 μL上清液至新的1.5 mL EP管并加入15 μL蛋白酶K，進(jìn)而加入200 μL GB緩沖液渦旋混勻15 s，70℃水浴5 min；加入200 μL無(wú)水乙醇并渦旋混勻，并將所有液體轉(zhuǎn)移至CR2吸附柱，12 000 r/min室溫離心30 s，棄去離心液；加入500 μL GD緩沖液，12 000 r/min室溫離心30 s，棄去離心液；加入700 μL PW漂洗液，12 000 r/min室溫離心30 s，棄去離心液；加入500 μL PW漂洗液，12 000 r/min室溫離心30 s，棄去離心液；將CR2吸附柱置于新的收集管，12 000 r/min室溫離心2 min，棄去收集管并室溫放置10 min；再將CR2吸附柱置于新的收集管，并于CR2吸附柱膜中心位置加入50 μL TB洗脫液，室溫放置2～5 min，12 000 r/min室溫離心2 min，收集離心液-20℃冰箱保存。

1.2.6 ERIC-PCR檢測(cè) 按照文獻(xiàn)報(bào)道的ERIC-PCR引物序列(ERIC-1: 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC-2: 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)進(jìn)行化學(xué)合成并稀釋備用。以上述定量的基因組DNA為模板，按照如下體系加樣：1 μL基因組DNA模板、0.125 μL Ex-Taq(5 U/μL)、2.5 μL 10×Ex-TaqBuffer、2 μL dNTP、0.5 μL ERIC-1、0.5 μL ERIC-2，ddH2O定容至25 μL。加樣完成后進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增，具體步驟為：95℃預(yù)變性7 min； 90℃ 30 s, 52℃ 1 min, 65℃ 8 min, 30個(gè)循環(huán);65℃ 16 min,4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%(w/V)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，凝膠成像儀采集圖片后進(jìn)行分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 所有的統(tǒng)計(jì)過(guò)程均用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差均值(Mean±SE)表示。采用Kolmogorov-Smirnov Z法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Student’st-test檢驗(yàn)比較兩組間差異，P<0.05水平有顯著差異認(rèn)定結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性束縛應(yīng)激后大鼠體重變化

如下圖1所示，比較慢性束縛應(yīng)激方法處理前后大鼠體重變化發(fā)現(xiàn)，造模前模型組大鼠的體重與對(duì)照組相比不存在顯著差異，造模后模型組大鼠的體重顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明慢性束縛應(yīng)激影響了大鼠的體重變化。

2.2 慢性束縛應(yīng)激后大鼠曠場(chǎng)穿越次數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)變化

如圖2所示，慢性束縛應(yīng)激模型組大鼠的曠場(chǎng)穿越次數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)；模型組大鼠的曠場(chǎng)直立次數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)；模型組大鼠的曠場(chǎng)理毛次數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)；模型組大鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明大鼠的行為學(xué)發(fā)生了明顯的變化，出現(xiàn)了明顯抑郁傾向。

圖1 造模前后大鼠體重變化Fig.1 Analysis of rat body weight change before or after modeling.注:“**”表示同一處理組與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)。

圖2 大鼠慢性束縛應(yīng)激后行為學(xué)變化Fig.2 Analysis of rat behavior changes after chronic constraint stress.注:“**”表示同一處理組與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 慢性束縛應(yīng)激后大鼠糖水偏愛(ài)變化

如圖3所示，與對(duì)照組相比，慢性束縛應(yīng)激模型組大鼠的糖水偏愛(ài)性明顯降低近30%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明慢性束縛應(yīng)激后大鼠出現(xiàn)了厭食等抑郁癥狀。

圖3 大鼠慢性束縛應(yīng)激后糖水偏愛(ài)Fig.3 Analysis of rat scurose preference after chronic constraint stress.注：“**”表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.4 慢性束縛應(yīng)激后大鼠腸道組織形態(tài)變化

如圖4(彩圖見(jiàn)圖版二)所示，與對(duì)照組相比，急性應(yīng)激后回腸組織形態(tài)結(jié)果破壞明顯，微絨毛等斷裂，細(xì)胞局部溶解，細(xì)胞核皺縮變形并深染；盲腸組織形態(tài)結(jié)果破壞明顯，微絨毛等斷裂，細(xì)胞局部溶解，細(xì)胞核皺縮變形并深染；結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)果破壞明顯，微絨毛等斷裂，細(xì)胞局部溶解，細(xì)胞核皺縮變形并深染，說(shuō)明慢性束縛應(yīng)激導(dǎo)致大鼠消化道出現(xiàn)了驗(yàn)證的病理性損傷。

2.5 慢性束縛應(yīng)激后大鼠腸道菌群變化

如圖5中ERIC-PCR鑒定結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，大鼠回腸組織250～500 bp處的條帶和1 000～2 000 bp處的條帶在慢性束縛應(yīng)激處理后消失；大鼠盲腸組織中特征性條帶較多，慢性束縛應(yīng)激處理后在250～500 bp和2 000 bp處出現(xiàn)明顯特征條帶，大于2 000 bp處的條帶在應(yīng)激后消失；大鼠結(jié)腸組織在應(yīng)激后大于2 000 bp的條帶消失，在250～500 bp之間出現(xiàn)明顯特征條帶。說(shuō)明慢性束縛應(yīng)激嚴(yán)重破壞了大鼠的腸道菌群平衡。

圖4 HE染色檢測(cè)慢性束縛應(yīng)激后大鼠回腸、結(jié)腸、盲腸組織病理變化Fig.4 The pathological change assay of the stomach, ileum, cecum and colon in acute stress rats using HE staining.(彩圖見(jiàn)圖版二)

3 討論

為了研究慢性應(yīng)激對(duì)機(jī)體病理及腸道菌群的影響，本研究采用慢性束縛應(yīng)激法成功建立了大鼠慢性束縛應(yīng)激模型，束縛期間禁食禁水，束縛后恢復(fù)自由飲水，每天束縛4 h，持續(xù)30 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激后大鼠的體重和對(duì)照組相比明顯降低，曠場(chǎng)穿越次數(shù)、直立次數(shù)和理毛次數(shù)顯著降低，強(qiáng)迫游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)，糖水偏好顯著降低，大鼠出現(xiàn)抑郁癥狀。腸道病理結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激后大鼠的回腸、盲腸、結(jié)腸組織粘膜及微絨毛等嚴(yán)重破壞，細(xì)胞變形，細(xì)胞核深染。

圖5 ERIC-PCR檢測(cè)慢性束縛應(yīng)激后大鼠回腸、盲腸、結(jié)腸菌群變化Fig.5 The change of intestinal flora profile of the stomach, ileum, cecum and colon in acute stress rat by ERIC-PCR.

人類腸道細(xì)菌數(shù)量是人體自身細(xì)胞數(shù)量的10倍，其基因數(shù)量是人體的100倍，生理狀態(tài)下，腸道微生物的組成、功能與宿主之間存在動(dòng)態(tài)平衡，即腸道穩(wěn)態(tài)。數(shù)目龐大、種類多樣的微生物組成了復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，顯著調(diào)節(jié)消化道免疫、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、能量代謝和腸道生物屏障功能[12,13]。由于不同宿主的微生物可能會(huì)在其他宿主體內(nèi)引起不良反應(yīng)。一旦平衡被各種內(nèi)外因素打破，其生存環(huán)境改變，正常的免疫和代謝等功能紊亂，出現(xiàn)各種臨床癥狀稱為菌群失調(diào)。當(dāng)宿主的飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣和生理發(fā)育等發(fā)生變化時(shí)，體內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化[14,15]。本文ERIC-PCR結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激后大鼠胃腸道菌群發(fā)生了特征性變化，如回腸250～500 bp和1 000～2 000 bp的條帶消失，盲腸250～500 bp出現(xiàn)新條帶，結(jié)腸2 000 bp左右的條帶消失，250～500 bp出現(xiàn)新條帶，表明盲腸和結(jié)腸的腸道菌群種類較多，變化較快，在受到外界壓力刺激時(shí)最先受到影響且變化較明顯。然而，無(wú)論是對(duì)照組還是模型組，同組大鼠的腸道菌群的變化差異也比較大，腸道菌群的個(gè)體差異較大，受到外界因素的影響較多，后續(xù)我們將進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)增加樣品量，并判定應(yīng)激后優(yōu)勢(shì)菌落的變化。同時(shí)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)收集優(yōu)勢(shì)菌群條帶進(jìn)行主條帶分析，并判定慢性束縛應(yīng)激刺激下機(jī)體腸道菌群的變化規(guī)律。

本研究基于慢性束縛應(yīng)激法建立了大鼠的慢性束縛應(yīng)激模型，結(jié)合行為學(xué)評(píng)估及腸道組織病理和腸道內(nèi)容物菌群變化揭示了特征病理和特征變化菌群規(guī)律，為基于腸道菌群研究慢性應(yīng)激潛在作用規(guī)律的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

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Alteration of Rat Intestinal Pathology and Flora Based on the Chronic Stress Model

WANG Hua, WANG Zhihong*

DepartmentofGastroenterology,theSecondPeoplesHospitalofHefei,Hefei230000,China

To establish the rat chronic stress model using the chronic stress method, and further observe the variation rule of rat intestinal pathology and its flora based on HE staining and ERIC-PCR technique. A total of 10 healthy male SD rats were chosen, and randomly divided into two groups: Control group and model group, 5 rats in each group. Wherein, rats in control group were regular raised, and rats in model group were perform constraint stress for 4 hours everyday using a constraint tube for 30 days, and the rats body weight was recorded before or after modeling, and then performed the behavioral evaluation. In addition, rats were killed, and the intestinal tissues and contents were collected, and then sliced to stain by HE staining, and the genomic DNA was extracted to perform ERIC-PCR assay. Results showed that, compared to control, the body weight, the number of through, upright, grooming significantly decreased, the no moving time of forced swimming significantly prolonged, and sugar water preference significantly decreased. Furthermore, the microvilli of intestinal tract were seriously damaged, and nuclei mild contraction and deeply staining. The intestinal flora obviously changed, and several characteristic bands appeared. Rats chronic stress model was correctly established using chronic constraint stress methods and behavioral evaluation, and provided a significant reference on the study of the chronic stress associated diseases based on pathological assay and intestinal flora expression profile alteration, and exhibited a certain application value.

rats chronic constraint model; behavioral evaluation; intestinal tissue; intestinal flora; alteration

2016-08-23; 接受日期：2016-10-13

合肥市科技局重點(diǎn)立項(xiàng)項(xiàng)目[合科(2011)25號(hào)]資助。

王華，醫(yī)師，研究方向?yàn)榉肿蛹?xì)胞生物學(xué)。E-mail：410908699@qq.com。*通信作者：王志紅，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)榉肿蛹?xì)胞生物學(xué)。 E-mail：410908699@qq.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.09