黃小平張宏玉雷剛王志美章智賀超廖江林,,?黃英金,,?

(1江西農(nóng)業(yè)大學作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室,南昌330045;2江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)應對氣候變化南昌市重點實驗室,南昌330045;?通訊聯(lián)系人,E-mail:jlliao514815＠163．com,yjhuang_cn＠126．com)

灌漿期夜間高溫脅迫下耐熱和熱敏感水稻籽粒的比較蛋白質組分析

黃小平1張宏玉2雷剛1王志美1章智1賀超1廖江林1,2,?黃英金1,2,?

(1江西農(nóng)業(yè)大學作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室,南昌330045;2江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)應對氣候變化南昌市重點實驗室,南昌330045;?通訊聯(lián)系人,E-mail:jlliao514815＠163．com,yjhuang_cn＠126．com)

【目的】為了闡明水稻灌漿期耐夜間高溫的分子機制,提高水稻耐熱性,鑒定了水稻近等基因系耐熱純系XN0437T與熱敏感純系XN0437S在灌漿期夜間高溫脅迫下的差異表達蛋白質?！痉椒ā坎捎猛霸苑椒ㄅ嘤?于開花期標記同一天揚花的穎花以保障所取穎花樣品的生育進程一致;于水稻灌漿初期(花后第8天)進行夜間高溫處理。高溫處理結束后剪取帶標記的穎花提取水稻籽?？偟鞍踪|,采用8-plex i TRAQ試劑盒進行蛋白質樣品的差異顯色標記,標記樣品采用高效液相系統(tǒng)進行質譜鑒定及定量分析?！窘Y果】鑒定并定量了3130個蛋白質,耐熱與熱敏感水稻純系間存在36個差異表達蛋白質。蛋白質功能注釋結果顯示,鑒定的36個差異表達蛋白質中僅14個蛋白質(占38．9%)注釋了功能,12個蛋白質(占33．3%)為推測性功能注釋,10個(占27．8%)為功能未知的蛋白質。已注釋功能的14個蛋白質中,5個蛋白質參與能量代謝,3個蛋白質參與物質轉運與代謝,2個蛋白質參與光合作用,3個蛋白質為響應逆境的鋅指蛋白質,1個蛋白質為響應逆境的熱激蛋白質?！窘Y論】灌漿期夜間高溫影響水稻籽粒細胞內參與能量代謝、物質轉運與代謝、光合作用等相關蛋白質的表達模式。水稻籽粒細胞中鋅指蛋白質Q67 TK9、Q10N88上調表達,鋅指蛋白質Q5YLY5下調表達,有利于提高水稻灌漿期對夜間高溫的耐熱性。

水稻;灌漿期;夜間高溫;蛋白質組學;iTRAQ技術

全球氣候變暖,尤其是夏季頻繁高溫對水稻等作物產(chǎn)量和品質的不利影響,已受到廣泛關注[1,2]。在全球氣溫升高的大趨勢下,夜間氣溫的升高幅度顯著大于白天。而且夜間平均氣溫每升高1℃可導致水稻減產(chǎn)10%,而白天氣溫的升高與水稻產(chǎn)量間無顯著相關性[3],表明夜間高溫是直接導致水稻減產(chǎn)的主要原因[4]。在我國,夏季高溫熱害主要發(fā)生在長江中下游地區(qū),尤其在7月份,該區(qū)域受西太平洋副熱帶高壓控制,天氣晴朗、太陽輻射強烈,極易出現(xiàn)高溫酷熱天氣[5,6]。該區(qū)域是我國雙季稻的主產(chǎn)區(qū),而且該區(qū)域雙季早稻的灌漿初期正值7月上、中旬。水稻灌漿初期(揚花后第8～14天)是籽粒胚乳細胞形成和充實的關鍵時期,期間遇高溫熱害會加快胚乳細胞的分化而增加畸形胚乳細胞的比例,結果不利于同化物向胚乳細胞的運輸和積累從而導致水稻籽粒的充實度下降、粒重降低[7]。同時,高溫影響水稻籽粒細胞內的酶活性,不利于籽粒儲藏物質的轉化和積累進而導致稻米品質變劣[8,9]。長江中下游地區(qū)的雙季早稻是其他作物難以替代的優(yōu)勢糧食作物,我國稻谷總產(chǎn)量的幾次大波動都與雙季早稻的減產(chǎn)密切相關。因此,研究水稻灌漿期耐夜間高溫的分子機制,加快選育對夜溫升高鈍感的優(yōu)良水稻新品種以保證我國稻谷產(chǎn)量和品質的穩(wěn)定,進而對保障國家的口糧安全具有重要意義。水稻灌漿期的耐熱性受多基因調控,其分子調控機制相對復雜[10,11]。明確哪些基因及其編碼的蛋白質參與調控水稻灌漿期耐熱性是解析其分子機制的先決內容。已有研究表明,灌漿期高溫抑制淀粉支解酶Ⅱb(BEⅡb)活性、增加直鏈淀粉支鏈長度而減少直鏈淀粉的長鏈數(shù)量[12];灌漿期高溫提高水稻胚乳細胞中焦磷酸化酶(AGPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)和淀粉分支酶(SBE)等與淀粉合成有關的酶活性[13]。在基因表達方面,灌漿期高溫抑制顆粒淀粉合成酶Ⅰ(GBSSⅠ)、顆粒淀粉合成酶Ⅱb(BEⅡb)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(包括AGPS2b, AGPS1和AGPL2)、ADP-葡萄糖轉運體等與淀粉合成相關基因以及丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)基因的表達[14,15];灌漿期高溫誘導α-淀粉酶(amylase)基因(包括Amy1A,Amy1C,Amy3 A,Amy3D和Amy3E)表達,加劇胚乳細胞內淀粉的水解而增大籽粒堊白面積[16]。在蛋白質表達方面,灌漿期高溫誘導18．1 k D和17．9 k D熱激蛋白質(HSP)、醇溶谷蛋白質(Prolamin)和谷蛋白質(Glutelin)表達,抑制顆粒淀粉合成酶(granule-boundstarch synthase)、類過敏原蛋白質(allergen-like protein)和延長因子1β(elongation factor 1β)的表達[14,17]。在調控途徑方面,灌漿期夜間高溫誘導線粒體跨膜電子傳遞相關基因上調表達[18],影響三羧酸循環(huán)(TCA)、氨基酸和多胺的生物合成途徑[19]。這些基因和蛋白質的鑒定及其表達模式的明確為進一步闡明水稻灌漿期耐熱的分子機制奠定了研究基礎。然而,水稻在遭遇灌漿期夜間高溫脅迫時,到底哪些基因和蛋白質的表達及其呈現(xiàn)何種表達模式,其有利于提高水稻對灌漿期夜間高溫的耐性,尚鮮見報道[18]。本研究以近等基因系的耐熱水稻純系XN0437T和熱敏感純系XN0437S為供試材料,利用i TRAQ(同位素標記相對和絕對定量,isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術和高效液相質譜檢測技術鑒定耐熱和熱敏感水稻純系在應答灌漿期夜間高溫過程中的差異表達蛋白質,明確哪些蛋白質的上調表達或下調表達有利于提高水稻灌漿期對夜間高溫的耐熱性,為進一步闡明水稻灌漿期耐夜間高溫的分子機制奠定研究基礎。

1 材料與方法

1．1 供試水稻材料

供試水稻材料為江西農(nóng)業(yè)大學早稻灌漿期耐熱抗早衰育種技術研究課題組選育的一對近等基因系,即耐熱純系XN0437T和熱敏感純系XN0437S。此對近等基因系源于協(xié)青早B/N22//協(xié)青早B的回交重組自交系,在江西南昌作為雙季早稻在常規(guī)栽培條件下種植,耐熱純系XN0437T和熱敏感純系XN0437S的株高分別為81．3 cm和81．0 cm,穗長分別為18．4 cm和18．1 cm,每穗總粒數(shù)分別為94．3粒和95．0粒,全生育期均為106 d。SSR分子標記檢測結果顯示此對近等基因系的基因組多態(tài)性僅為1．8%。兩水稻純系于水稻開花后第8天開始進行48 h(38.0±0．5)℃高溫處理后,在常溫條件(25.0±0．5)℃下恢復生長至成熟并調查其籽粒充實度。結果顯示耐熱水稻純系XN0437T(原名703T)的籽粒充實度為92．4%,熱敏感純系XN0437S(原名704S)的籽粒充實度為43．6%,籽粒充實度差異達到極顯著水平[20]。

1．2 供試水稻材料的培育、高溫處理及取樣

供試水稻材料的培育、高溫處理及取樣參照Liao等的方法進行[18]。水稻的培育采用桶栽的方法,水稻抽穗期、揚花期標記同一天抽穗且同一天開花的穎花以保證所取樣品的生長發(fā)育進程一致。水稻揚花后第8天開始在人工氣候室內進行高溫處理,夜間溫度設為38．0℃±0．5℃(高溫處理)和25.0℃±0．5℃(對照),處理和對照的白天溫度均設為(26．0±0．5)℃。暗期時長10 h、光期時長14 h,連續(xù)處理48 h。設置3次生物學重復。高溫處理結束時,取處理與對照的帶標記穎花各約5 g,采用錫箔紙包裹,置于液氮中速凍,并于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 水稻籽?？偟鞍踪|提取及質量檢測

取水稻籽粒樣品3 g,經(jīng)液氮研磨成粉末后,轉移到15 m L離心管中,加入蛋白質提取緩沖液(8 mol/L尿素,0．1%SDS,1 mmol/L PMSF,1 mmol/L DTT)于自動渦旋混合器上室溫振蕩提取3 h后,4℃、14 000 r/min下離心15 min,取上清液轉移至新的15 m L離心管中,加入6倍體積的預冷丙酮,-20℃下沉淀過夜。沉淀過夜樣品于4℃、14 000 r/min下離心15 min,去上清液,將沉淀于4℃真空干燥后獲得總蛋白質干粉,-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取蛋白質干粉50 mg,經(jīng)裂解液(含8 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,質量分數(shù)4%CHAPS,p H3～10體積分數(shù)0．5%兩性電解質,50 mmol/L DTT和1．0 mmol/L PMSF)超聲溶解后,于4℃、14 000 r/ min下離心15 min后,上清液(總蛋白質溶液)轉移至1．5 m L離心管。采用SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色法檢測總蛋白質的完整性,SDS-PAGE電泳參數(shù)與方法參照Liao等[21]。以牛血清白蛋白質為標準品,采用Bradford法測定蛋白質樣品濃度。

1．4 蛋白質酶解及iTRAQ標記

蛋白質樣品先經(jīng)還原和烷基化后,采用胰蛋白質酶酶解。每個樣品取100μg蛋白質,經(jīng)10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)于37℃溫浴1 h、55 mmol/L碘乙酰胺于室溫烷化1 h后,加入3．3μg胰蛋白質酶于37℃下消化12 h,消化結束時加入體積分數(shù)1%的蟻酸100μL終止酶解反應,真空抽干獲得蛋白質肽段干粉。蛋白質肽段干粉復溶于8 mol/L尿素(含0．1%SDS)和500 mmol/L三乙基碳酸氫銨的水溶液后,采用AB Sciex公司的8-plex i TRAQ試劑盒進行差異顯色標記。將試劑盒中8管標記試劑(113、114、115、116、117、118、119和121)經(jīng)50μL異丙醇稀釋后分別與相應的蛋白質肽段干粉復溶樣品混合,室溫放置1 h,各管中加入100μL去離子水使標記物失活,混合8組樣品,凍干備用。

隨機取3次高溫處理重復中的2次重復進行i TRAQ分析。耐熱水稻純系的2個對照重復分別命名為TC1和TC2,2個夜間高溫脅迫重復分別命名為TT1和TT2,并用iTRAQ試劑113、114、115、116依次進行標記;熱敏感水稻純系的2個對照重復分別命名為SC1和SC2,2個夜間高溫脅迫重復分別命名為ST1和ST2,并用iTRAQ試劑117、118、119、121依次進行標記。

1．5 iTRAQ標記樣品的強陽離子交換柱分級及質譜檢測

iTRAQ標記的8個樣品等量混合后采用C18強陽離子柱進行樣品分級。經(jīng)強陽離子色譜柱平衡緩沖液A(含p H 2.55、5 mmol/L KH2PO4,體積比為20%的乙腈、H3PO4)平衡25 min后,取標記樣品混合物300μL,用強陽離子色譜柱平衡緩沖液B (含p H 2.75、5 mmol/L KH2PO4,體積比為20%的乙腈,600 mmol/L KCl,H3PO4)稀釋7倍,正磷酸調p H值至2.5,離心取上清液進行梯度洗脫,每1 min收集1管樣品洗脫液,洗脫液流速為0.2 ml/ min。線性洗脫程序如下:0-3 min,緩沖液B的體積分數(shù)由0%升至5%;3-21 min,緩沖液B的體積分數(shù)由5%升至20%;21-27 min,緩沖液B的體積分數(shù)由20%升至30%;27-33min,緩沖液B的體積分數(shù)由30%升至100%。梯度洗脫結束后,根據(jù)色譜圖的峰形和時間合并連續(xù)的多肽含量較少的樣品,共形成20個組分用于肽段的質譜檢測。

質譜檢測采用Thermo Scientific公司生產(chǎn)的Q Exactive質譜儀,高效液相系統(tǒng)為戴安NCS3500系統(tǒng)。液相色譜A相為體積分數(shù)為99.9%的dd H2O和0.1%的甲酸,B相為體積分數(shù)為99.9%的乙腈、0.1%的甲酸。液相色譜洗脫液流速為300 n L/min,液相色譜線性梯度洗脫程序如下:0-5 min,B相體積分數(shù)保持3%不變;5-6 min,B相體積分數(shù)由3%升至5%;6-36 min,B相體積分數(shù)由5%升至20%;36-46 min,B相體積分數(shù)由20%升至30%;46-50 min,B相體積分數(shù)由30%升至80%,并在之后5 min內B相體積分數(shù)保持不變;55 -55.5 min,B相體積分數(shù)由80%降至3%,并在之后19.5 min內B相體積百分數(shù)保持3%不變。檢測質譜全掃描范圍m/z＝350～1800,全掃描中選擇離子強度前20位的母離子用標準碰撞能為30 eV的HCD模式碎裂后,進行二級質譜序列測定,以報告離子的比例進行定量。

1．6 蛋白質定量及功能注釋

將質譜鑒定結果導入Proteome Discoverer軟件,篩選選擇肽段可信度高(Peptide Confidence＝high)的肽段,并由軟件根據(jù)同一特異肽段(Unique Peptide)在各樣本中的報告離子峰的面積比值計算蛋白質的表達量。利用Proteome Discoverer軟件搜索Uniport數(shù)據(jù)庫(http://ww w．uniprot．org/),注釋蛋白質的功能。

1．7 蛋白質編碼基因的GO功能和KEGG通路的顯著富集分析

質譜數(shù)據(jù)經(jīng)Proteome Discoverer軟件搜索Uniport數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質后,按照蛋白質編碼基因ID、利用KOBAS軟件搜索在線GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫(http://geneontology．org/),采用Qvalue方法進行FDR校正,從而注釋蛋白質編碼基因產(chǎn)物屬性和蛋白質編碼基因參與的通路并統(tǒng)計顯著富集的通路。

1．8 差異表達蛋白質分析

根據(jù)軟件Proteome Discoverer計數(shù)獲得的蛋白質表達量,分2步進行差異表達蛋白質分析。首先,依據(jù)蛋白質表達量分析耐熱純系與熱敏感純系各自的夜間高溫脅迫與對照的差異表達蛋白質(組內分析)。若蛋白質在夜間高溫脅迫中的表達量與其在對照中的表達量的比值大于1.5倍,則定義為組內上調1.5倍的表達蛋白質;上述比值小于0.667(1/1.5),則定義為組內下調1.5倍的表達蛋白質。然后,利用組內分析結果比較耐熱和熱敏感純系之間差異表達蛋白質(組間分析)。以下兩種情況均定義為耐熱純系與熱敏感純系間的差異表達蛋白質:1)相同表達模式的差異蛋白質:在2個水稻純系中均呈現(xiàn)相同的上調或下調表達模式,且耐熱純系與熱敏感純系之間的上調或下調表達量的比值大于1.5倍或小于0.667(1/1.5)倍的蛋白質;2)不同表達模式的差異蛋白質,在2個水稻純系中呈現(xiàn)不同的表達模式,即在耐熱純系中上調表達而在熱敏感純系中下調表達的蛋白質,或在耐熱純系中下調表達而在熱敏感純系中上調表達的蛋白質。

1．9 蛋白質編碼基因的mRNA表達量驗證

為了驗證iTRAQ數(shù)據(jù)的可靠性,在不同功能分類中選擇了7個有代表性的差異表達蛋白質,根據(jù)其編碼基因在Gen Bank的EST數(shù)據(jù)庫(w ww．ncbi．nlm．nih．gov/dbEST)中mRNA序列,利用NCBI在線設計軟件primer-BLAST設計引物,采用熒光定量PCR方法檢測差異表達蛋白質編碼基因在水稻應答灌漿期夜間高溫的表達量變化。

熒光定量PCR的水稻籽粒樣品來自“1．2供試水稻材料的培育、高溫處理及取樣”的3次夜間高溫處理重復,樣品的總RNA提取和RNA反轉錄合成cDNA第一鏈、qPCR和表達量計算參照文獻[18]和[22]的方法進行。

2 結果與分析

2．1 蛋白質的鑒定及定量

利用i TRAQ標記技術和液相色譜串聯(lián)質譜檢測技術,供試的8個樣品共檢測到肽段次數(shù)為83 254次。通過軟件Proteome Discoverer過濾,得到了16 437條高可信度(Peptide Confidence＝high)的肽段,其中可用于蛋白質定量的特異肽段為12 911條?？尚烹亩魏吞禺愲亩谓?jīng)Uniport數(shù)據(jù)庫搜索,最終鑒定并定量了3130個蛋白質。

蛋白質的表達量的差異分析結果顯示,耐熱水稻純系中上調1.5倍的蛋白質有61個,下調1.5倍的蛋白質有20個(圖1)。熱敏感水稻純系中上調1.5倍的蛋白質有38個,下調1.5倍的蛋白質有18個。其中,在耐熱純系和熱敏感純系中均上調表達的蛋白質有17個,均下調表達的蛋白質有8個。

2．2 GO功能和KEGG通路的顯著富集結果

圖1 耐熱純系與熱敏感純系的應答夜間高溫的蛋白質數(shù)量Fig．1．Protein amount from the heat-tolerant line and heat-sensitive line responding to high night temperature．

蛋白質編碼基因的GO功能(A)和KEGG通路(B)的顯著富集結果如圖2所示。蛋白質編碼基因的GO顯著富集結果顯示(圖2-A),質譜鑒定蛋白質的GO功能產(chǎn)物屬性顯著富集(-logP值≥1.5)在生物學過程(Biological process)的萜類化合物生物合成過程(GO ID＝0016114:Terpenoid biosynthetic process)、類異戊二烯生物合成過程(GO ID＝0008299:Isoprenoid biosynthetic process)、單羧酸生物合成過程(GO ID＝0072330和0032787: Monocarboxylic acid biosynthetic process)、有機含羥基化合物生物合成過程(GO ID＝1901617和1901615:Organic hydroxy compound biosynthetic process)、有機酸生物合成過程(GO ID＝0016053: Organic acid biosynthetic process)、羧酸生物合成過程(GO ID＝0046394:Carboxylic acid biosyntheticprocess)、單一有機體生物合成過程(GOID＝0044711:Single-organism biosynthetic process)、脂質生物合成過程(GO ID＝0008610:Lipid biosynthetic process)和小分子生物合成過程(GO ID＝0044283:Small molecule biosynthetic process);其次,GO功能產(chǎn)物屬性顯著富集(-logP值≥1.5)在細胞組分(Cellular component)的酶抑制劑活性(GO ID＝0004857:Enzyme inhibitor activity)、肽鏈內切酶抑制劑活性(GO ID＝004866:Endopeptidase inhibitor activity)、肽酶調節(jié)因子活性(GO ID＝0061134:Peptidase regulator activity)、肽酶抑制因子活性(GO ID＝0030414:Peptidase inhibitor activity)、肽鏈內切酶調節(jié)因子活性(GO ID＝0061135:Endopeptidase regulator activity)、絲氨酸蛋白質酶抑制劑活性(GO ID＝0004867:Serinetype endopeptidase inhibitor activity)、分子功能調節(jié)因子(GO ID＝0098772:Molecular function regulator)和酶調節(jié)因子活性(GO ID＝0030234:Enzyme regulator activity)。蛋白質編碼基因的KEGG通路顯著富集結果顯示(圖2-B),質譜鑒定蛋白質的KEGG通路顯著富集(-logP值≥4)在內質網(wǎng)蛋白質加工通路上(KEGG ID＝Osa04141: Protein processing in endoplasmic reticulum)。

2．3 差異表達蛋白質的功能注釋及其分類

依據(jù)1.7的差異表達蛋白質判定方法,耐熱水稻純系與熱敏感水稻純系之間存在36個差異表達蛋白質。這些差異表達蛋白質經(jīng)Uniport數(shù)據(jù)庫搜索,發(fā)現(xiàn)只有14個蛋白質(占38.9%)有功能注釋、還有12個蛋白質(占33.3%)具有推測性功能注釋,另有10個(占27.8%)為功能未知蛋白質。14個有功能注釋的蛋白質中(表1),有5個蛋白質(Q9FU69、Q7Y179、Q0IPF8、Q2R1N0和Q84T00)參與能量代謝;有3個蛋白質(Q8GTK2、Q7Y007和Q10BU2)參與物質轉運與代謝;有2個蛋白質(Q2R237和Q658I1)參與光合作用;另外4個蛋白質(Q67TK9、Q10N88、Q84Q72和Q5YLY5)為應答逆境的18.1 k D熱激蛋白質和鋅指蛋白質。

僅有推測性功能注釋及功能未知的22個差異表達蛋白質中,在2水稻純系中均呈現(xiàn)上調表達1.2倍以上的蛋白質有10個(Q6I587、Q7XI37、Q69MT6、Q338P8、Q7XI22、Q8 H8U1、Q94GQ6、Q0E3F2、Q6YUH8、Q6ES31),均呈現(xiàn)下調表達1.2倍以上的蛋白質有2個(Q7XQ85、Q0E225);在耐熱水稻純系中上調表達1.2倍以上而在熱敏感水稻純系中下調表達1.2倍以上的蛋白質有8個(Q6ZJ47、Q6ZCC9、Q6ZCP8、Q53M16、Q9LWS6、C7JA46、Q0E0B4、Q7XVN6),在耐熱水稻純系中下調表達1.2倍以上而在熱敏感水稻純系中上調表達1.2倍以上的蛋白質有2個(Q0DTK3、Q5N9C8)。

2．4 差異表達蛋白質的mRNA表達模式驗證

有代表性的7個差異表達蛋白質及其編碼基因的m RNA表達模式如圖3所示。通過iTRAQ差異標記結合蛋白質譜分析獲得的蛋白質表達模式與熒光定量PCR中的m RNA表達模式的趨勢基本一致,表明通過i TRAQ差異標記結合高效液相色譜技術鑒定并定量的蛋白質組其結果可靠。

3 討論

圖2 差異表達蛋白質編碼基因的GO功能(A)和KEGG通路(B)顯著富集結果Fig．2．Significant enrichment results of Gene Ontology(A)and Kyoto Encyclopedia of Genes(B)．

iTRAQ差異標記具有在同一個體系中同時標記多個(4或6或8個)樣品的優(yōu)點,不僅可以增加后續(xù)質譜分析的樣品通量,而且可以減少蛋白質色譜分析過程中的定量誤差[23]。本研究通過iTRAQ差異標記和液相質譜技術鑒定并定量了耐熱與熱敏感水稻近等基因系籽粒中的3130個蛋白質。這些蛋白質中,在耐熱與熱敏感水稻純系中相對表達量超過1.5倍的蛋白質分別有81個和56個;進一步比較這些蛋白質在2個水稻純系之間的表達模式差異,結果發(fā)現(xiàn)耐熱與熱敏感水稻純系之間存在36個差異表達蛋白質。這些差異表達蛋白質經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索,發(fā)現(xiàn)僅14個蛋白質已注釋功能,其余蛋白質只注釋了推測性功能或功能未知。這14個已注釋功能的蛋白質中(表1),有5個蛋白質參與能量代謝, 3個蛋白質參與物質轉運與代謝,2個蛋白質參與光合作用,4個為逆境應答蛋白質(18.1 k D熱激蛋白質和鋅指蛋白質)。

鋅指蛋白質是一類轉錄調控因子蛋白質,通過蛋白質的鋅、鐵中心與DNA結合從而調控基因的表達[24]。它們不僅在植物生長發(fā)育中起著重要的基因表達調控功能[25,26],而且在植物應答生物脅迫和非生物脅迫過程中扮演著非常重要的調控基因表達的角色[27-31]。Chen等[25]的研究報道鋅指蛋白質OsGZF1在水稻種胚發(fā)育過程中具有調控籽粒中谷蛋白質形成功能。Cao等分析了水稻的Cys2-His2(C2H2)鋅指蛋白質家族,發(fā)現(xiàn)其中的20個鋅指蛋白質參與調控水稻的生長發(fā)育,28個參與調控水稻的授粉受精,22個參與調控水稻的抗病性,而且鋅指蛋白質VRF1是水稻抗病的不可或缺的調控因子[32]。Huang等發(fā)現(xiàn)CHY鋅指蛋白質具有通過調控水稻葉片氣孔的開閉從而提高水稻抗旱性和耐鹽性的功能[27,32]。本研究通過比較耐熱與熱敏感水稻近等基因系的蛋白質組的表達模式,發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白質Q67TK9(Zinc knuckle containing proteinlike)和Q10N88(ARF GAP-like zinc finger-containing protein ZIGA2)在耐熱水稻純系中上調表達2.3倍以上,而在熱敏感水稻純系中無明顯表達變化(＜1.5倍);鋅指蛋白質Q5YLY5在耐熱與熱敏感水稻純系中均呈現(xiàn)下調表達,但是該蛋白質在耐熱水稻純系中下調表達了4.167倍,而在熱敏感水稻純系中僅下調表達1.56倍。表明鋅指蛋白質Q67TK9、Q10N88的上調表達,以及鋅指蛋白質Q 5 YLY 5的下調表達有利于提高水稻灌漿期對夜間高溫的耐熱性。

表1 耐熱純系與熱敏感純系的差異表達蛋白質的表達模式及其功能注釋Table 1．Expression model and functional illustration of the differentially expressed proteins between the heat-tolerant and the heat-sensitive lines．

圖3 差異表達蛋白質及其編碼基因的表達模式Fig．3．Expression pattern of the differentially expressed protein and its coding gene．

研究表明,籽粒ATP酶促進外源營養(yǎng)物質經(jīng)質外體和共質體的協(xié)同作用向淀粉胚乳的運輸,同時ATP酶還為胚乳細胞吸收并積累蛋白質,進一步發(fā)育成蛋白體提供動力[33,34]。本研究發(fā)現(xiàn),在耐熱和熱敏感水稻應答夜間高溫過程中,籽粒中與ATP合成過程相關的ATP合成酶亞基β(Q0IPF8、LOC_Os12g10570)和ATP酶家族蛋白質(Q84T00、LOC_Os03g58800)以及與物質運轉過程相關的羧肽酶(Q8GTK2、LOC_Os07g46350)、GDSL脂肪酶或?；饷讣易宓鞍踪|(Q7Y007、LOC_Os03g47940)和種子萌發(fā)蛋白質3-7 (Q10BU2、LOC_Os03g58980)均呈現(xiàn)差異表達模式。表明夜間高溫影響了ATP酶活性,進而阻礙了營養(yǎng)物質向淀粉胚乳的運轉和積累。

熱激蛋白質普遍存在于動植物細胞內,它們通過控制蛋白質的折疊和積累從而調控蛋白質表達的分子或分子伴侶[35]。據(jù)報道,干旱、高鹽和高溫等環(huán)境條件均可誘導熱激蛋白質表達[36-40]。前期研究中,我們通過蛋白質雙向電泳技術檢測了水稻應答灌漿期(白天+夜間)高溫的蛋白質組[17],發(fā)現(xiàn)18．1 kD熱激蛋白質和17．9 kD熱激蛋白質在耐熱與熱敏感水稻純系中均呈現(xiàn)上調表達,而且在熱敏感水稻純系中的上調表達倍數(shù)高于其在耐熱水稻純系中的上調表達倍數(shù)。本研究利用i TRAQ差異標記和液相質譜技術比較耐熱與熱敏感水稻近等基因系應答夜間高溫脅迫的蛋白質組差異,也檢測到了18．1 kD熱激蛋白質在夜間高溫脅迫與對照、耐熱與熱敏水稻純系中呈現(xiàn)差異表達,而且該蛋白質在熱敏感水稻純系中的上調表達倍數(shù)(2．975倍)高于其在耐熱純系中的上調表達倍數(shù)(1．906倍)。此外,本研究中還檢測到17．9 k D熱激蛋白質(Q84Q77)在耐熱水稻純系及熱敏感水稻純系中均上調表達,在耐熱水稻純系中上調了1．829倍、在熱敏感水稻純系中上調了2．292倍,但該蛋白質在2個水稻純系間的表達倍數(shù)差異小于1．5倍。據(jù)此認為18．1 kD熱激蛋白質的表達豐度似可以作為水稻對灌漿期夜間高溫耐熱性的評判指標。

4 結論

灌漿期夜間高溫影響水稻籽粒細胞內參與能量代謝、物質轉運與代謝、光合作用等相關蛋白質的表達模式。水稻籽粒細胞中鋅指蛋白質Q67TK9、Q10N88的上調表達,以及鋅指蛋白質Q5YLY5的下調表達,有利于提高水稻灌漿期對夜間高溫的耐熱性。

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Analysis on Comparative Proteomics of Rice Grain Between Heat-tolerant and Heat-sensitive Lines Under High Night Temperature Stress at Filling Stage

HUANG Xiaoping1,ZHANG Hongyu2,LEI Gang1,WANG Zhimei1,ZHANG Zhi1,HE Chao1, LIAO Jianglin1,2,?,HUANG Yingjin1,2,?
(1Key Laboratory of Crop Physiology,Ecology and Genetic Breeding,Ministry of Education,Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045;2 Key Laboratory of Agriculture Responding to Climate Change,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045;?Corresponding author,E-mail:jlliao514815＠163．com;yjhuang_cn＠126．com)

【Objective】To understand molecular mechanism of rice tolerance to high night temperature at filling stage, we identify the differentially expressed proteins(DEPs)and screen the proteins involving in regulating the heat-tolerance in rice．【Method】The heat-tolerant rice line XN0437T and the heat-sensitive rice line XN0437S originated from a near-genetic lines were used as plant materials．Rice was pot-cultivated under traditional management．To ensure that only grain samples with uniform growth were used for proteomes analysis,rice panicle bloomed on the same date were labeled with same markers and spikelets flowering on the same date on the labeled panicle were further labeled．On the 8th day after flowering,rice plants with same label were transferred to chambers for high night temperature treatment．Rice grains with same label were harvested and total proteins of the grain samples were extracted after high temperature treatment．The 8-plex iTRAQ kits combined with the LC-MS/MS technology were used to analyze the DEPs between the heat-tolerant and heat-sensitive lines．【Result】After protein’s databases searching and differentially expressed proteins analysis,3130 proteins were finally identified and 36 proteins showed differential expression levels between the heat-tolerant and heat-sensitive line．For the 36 DEPs,14 proteins(38．9%) had functional annotation,12(33．3%)had putative function,and 10(33．3%)were functional unknown proteins．The 14 function-known proteins were involved in energy metabolism(five proteins),transport and metabolism(three proteins),photosynthesis(two proteins)and defense response(four proteins)．【Conclusion】High night temperature impacts the expressed patterns of the proteins involved in energy metabolism,matter transport and metabolism, photosynthesis and defense response in rice at filling stage．We suggested that up-regulated expression of the zinc finger proteins(Q67TK9 and Q10N88),and down-regulated expression of the zinc finger protein(Q5YLY5)in rice grain could enhance the heat-tolerance in rice．

rice;filling stage;high night temperature;proteomics;iTRAQ technique

Q948.112+.2;S511.01

A

1001-7216(2017)01-0013-10

2016-06-24;修改稿收到日期:2016-09-17。

江西省青年科學基金重點資助項目(20133 ACB21004);國家自然科學基金資助項目(31260315,31471467)。