李法君

(山東省濰坊科技學(xué)院 262700)

微RNA(microRNA，miRNA) 是一類長度為19～25個(gè)核苷酸(nt)(一般為22個(gè))的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。通常，miRNA能與靶基因的mRNA序列部分或完全配對，在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制mRNA翻譯或誘導(dǎo)mRNA剪切降解。作為21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)之一，miRNA參與了動(dòng)植物體內(nèi)許多生化過程。迄今，人們已能通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從生物體中獲取大量的miRNA信息。然而，達(dá)成人類對miRNA生物學(xué)功能的利用還有賴于對其靶基因調(diào)控的實(shí)現(xiàn)。因此，如何確定miRNA的靶基因已經(jīng)成為當(dāng)前亟待解決的課題。傳統(tǒng)miRNA靶基因的確定一般是通過生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測[1]，但是該方法無法區(qū)分預(yù)測靶基因的真?zhèn)危鶞y得的結(jié)果必須經(jīng)實(shí)驗(yàn)去偽存真，這就極大地影響了靶基因的探索效率[2]；在一些特殊情況下，miRNA與靶基因間存在較高錯(cuò)配，該預(yù)測方法可能會(huì)丟失許多真實(shí)的靶基因。因此，生物信息學(xué)預(yù)測并不能全面、快速、真實(shí)地鑒定miRNA的靶基因。動(dòng)物體中miRNA多通過與靶基因的3′-端的非翻譯區(qū)結(jié)合來抑制翻譯的進(jìn)行。與之不同，植物體中的miRNA則是通過剪切的方式將目標(biāo)mRNA降解。因此，降解組測序(degradome sequencing)技術(shù)就成為確定植物miRNA靶基因的有力工具。

1 降解組測序技術(shù)

降解組測序技術(shù)又稱為大規(guī)模平行末端分析(parallel analysis of RNA ends，PARE)，是一種新的鑒定miRNA靶基因的實(shí)驗(yàn)方法。它綜合了高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)分析兩者的優(yōu)勢，對植物體中由 miRNA 介導(dǎo)而產(chǎn)生的mRNA降解片段進(jìn)行深度測序分析，從而高效、準(zhǔn)確地篩選出與之相對應(yīng)的靶基因。降解組測序技術(shù)包括兩個(gè)主要環(huán)節(jié)，即降解組文庫的構(gòu)建與測序以及數(shù)據(jù)分析?；驹韀2，3]如下：植物體內(nèi)絕大多數(shù)的miRNA通過剪切作用來調(diào)控靶基因的表達(dá)，剪切位點(diǎn)通常發(fā)生在miRNA與mRNA互補(bǔ)的第10或第11位核苷酸上。靶基因經(jīng)過剪切后被分為兩個(gè)部分，即5′-端剪切片段和3′-端剪切片段，其中3′-端剪切片段包括自由的5′-端單磷酸和3′-端poly(A)尾巴。RNA連接酶利用5′-端單磷酸將3′-端剪切片段與特定的5′-端接頭序列連接，形成一新的單鏈RNA序列。利用oligo(dt)引物將該新的單鏈RNA序列反轉(zhuǎn)錄成cDNA序列，用PCR技術(shù)將其擴(kuò)增，并利用限制性內(nèi)切酶Mme I對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，從而得到長度為20～21 nt的片段。將這些片段與3′-端雙鏈DNA接頭連接并繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終得到一個(gè)包含miRNA的靶基因3′-端剪切片段的文庫(降解組文庫)。隨后對該文庫進(jìn)行高通量測序，并從測得的序列中去除接頭序列，便可獲得目的序列。利用CleaveLand、starBase、SeqTar、SoMART 和PAREsnip等分析軟件對所測序列進(jìn)行深入比對，可以直觀地發(fā)現(xiàn)在mRNA序列的某個(gè)位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)波峰，而此處正是候選的miRNA剪切位點(diǎn)。其后在波峰的上、下游各選取15 nt的核苷酸序列，這樣就得到一個(gè)大約30 nt的序列。將該序列反向互補(bǔ)并與測序物種的miRNA數(shù)據(jù)庫比對，符合要求的匹配即為潛在miRNA的靶基因。

2 降解組測序技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 miRNA生成機(jī)制的調(diào)控 研究表明，初級miRNA(pri-miRNA)經(jīng)過剪切便成為成熟的miRNA。在此過程中，有些pri-miRNA可被自身成熟的miRNA剪切加工，且大多數(shù)切割位點(diǎn)并不發(fā)生在10～11nt處，其中的分子機(jī)制還不完全明確。Meng等[4]通過對水稻的降解組數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，miR-161和miR-445d可以對自身的前體序列進(jìn)行切割。原因可能在于，miRNA和前體序列之間通過這種反饋機(jī)制來調(diào)控miRNA的表達(dá)，從而與靶基因的表達(dá)相一致，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。雖然miRNA在生物體內(nèi)的生成機(jī)制已有大量的研究報(bào)道，但尚有許多具體的環(huán)節(jié)不清楚。降解組測序技術(shù)將有助于從一個(gè)新的視角詮釋miRNA的生物學(xué)生成機(jī)制。

2.2 miRNA靶基因的確定 2008年，German等[5]最先在擬南芥中運(yùn)用降解組測序技術(shù)確定了miRNA的靶基因。在100個(gè)已經(jīng)在擬南芥中證實(shí)的miRNA靶基因中，分別在野生型(WT)和xrn4突變型擬南芥花組織的降解組中檢測到了94個(gè)和98個(gè)靶基因，初步證實(shí)了降解組測序在篩選miRNA基因方面的高效性；而在124個(gè)尚未確定的靶基因中，在WT和xrn4降解組中分別發(fā)現(xiàn)了31個(gè)和42個(gè)。為了確定上述基因是否真的是miRNA的靶基因，進(jìn)而從中選取13個(gè)未確定基因用傳統(tǒng)的RACE方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示其中的12個(gè)是miRNA的靶基因。Liu等[6]在不同發(fā)育時(shí)期的玉米穗中，通過降解組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)102個(gè)miRNA存在141個(gè)靶基因。上述結(jié)果表明，相比以前的生物信息學(xué)預(yù)測，降解組測序技術(shù)能高效準(zhǔn)確地鑒定miRNA的靶基因。

2.3 miRNA家族靶基因具體位點(diǎn)的確定 miRNA功能具有高度的保守性，同一個(gè)miRNA家族的不同miRNA個(gè)體可能會(huì)作用于相同的靶基因，但具體的作用位點(diǎn)可能不盡相同。MADS-box 基因是一類在植物中廣泛存在的同源異型基因，參與調(diào)控花和果實(shí)發(fā)育及成熟的多個(gè)過程。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，MADS-box 基因的表達(dá)受miR-444家族的調(diào)控。miR-444家族包括miR-444-b.1、miR-444-b.2和miR-444-c.2等多個(gè)亞型。Li等[7]在水稻中通過降解組測序技術(shù)表明，雖然不同miR-444亞型切割的基因相同，但是其切割后產(chǎn)生的序列片段數(shù)目卻不同，原因在于不同亞型的切割位點(diǎn)不同。由miR-444-b.2/c.2介導(dǎo)的對Os02g36924靶基因(MADS-box基因的亞型之一)C1位點(diǎn)的切割所產(chǎn)生的序列片段數(shù)量最多，而miR-444-b.1在該基因C2位點(diǎn)上的切割豐度卻遠(yuǎn)低于C1位點(diǎn)。這一結(jié)果清楚地表明：降解組測序在確定miRNA家族靶基因具體切割位點(diǎn)方面具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢。

2.4 抗逆性研究 近來，降解組測序技術(shù)也被用在植物的抗逆性研究中。Wang等[8]通過構(gòu)建谷子干旱脅迫的miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫，發(fā)現(xiàn)了81個(gè)保守的和72個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA序列。進(jìn)一步的降解組測序分析表明，它們所對應(yīng)的靶基因分別為56和26個(gè)，為研究谷子在干旱脅迫下的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。Chen等[9]在低氮脅迫的楊樹中發(fā)現(xiàn)60個(gè)miRNAs(39個(gè)保守的，13個(gè)非保守的和8個(gè)新發(fā)現(xiàn)的)分別調(diào)控64個(gè)靶基因的表達(dá)，為研究楊樹的低氮脅迫提供了基本的miRNA數(shù)據(jù)。此外，科研人員還運(yùn)用降解組測序研究了大麥的干旱脅迫、小麥的寒冷脅迫、玉米的低氮脅迫和胡楊的鹽堿脅迫等相關(guān)抗逆性過程。

2.5 生長發(fā)育研究 miRNA在生物體的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Song等[10]通過構(gòu)建大豆種子不同發(fā)育時(shí)期miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫和降解組文庫發(fā)現(xiàn)，207個(gè)注釋的和26個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA的靶基因分別為145個(gè)和25個(gè)。其中新發(fā)現(xiàn)的miRNA Soy-25的靶基因?yàn)槌聊种埔蜃?基因，揭示大豆種子發(fā)育過程中的miRNA生物合成受反饋調(diào)控。由此可見，降解組測序?yàn)殛U明大豆的種子發(fā)育機(jī)制提供了有力的技術(shù)支持?，F(xiàn)在降解組測序已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物生長發(fā)育過程的研究，如草莓的果實(shí)衰老、龍眼的胚胎發(fā)育、棉花的體胚發(fā)育、葡萄的開花結(jié)果和西紅柿的果實(shí)成熟等。

3 展望

隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，植物體內(nèi)不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的mRNA序列相繼得以明確。因此，基因組學(xué)中有關(guān)基因功能的研究勢必將從單個(gè)基因功能的確定過渡到調(diào)控機(jī)制的研究。作為真核生物中普遍存在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，miRNA主要通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來實(shí)施自己的生物學(xué)功能。因此，靶基因的鑒定就顯得格外重要。作為一項(xiàng)新興的技術(shù)，降解組測序技術(shù)為準(zhǔn)確鑒定miRNA的靶基因提供了一個(gè)有效的技術(shù)平臺(tái)，已經(jīng)在植物中得以應(yīng)用，并取得了眾多的科研成果。有趣的是，近來降解組測序技術(shù)也被應(yīng)用于動(dòng)物體miRNA靶基因的確定。Park等[11]在模式動(dòng)物線蟲中運(yùn)用此技術(shù)證實(shí)，miR-249的靶基因?yàn)閆K637.6的轉(zhuǎn)錄本。Yang等[12]在日本囊對蝦中運(yùn)用降解組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-1和let-7的靶基因分別為核酸內(nèi)切逆轉(zhuǎn)錄酶基因和跨膜蛋白14C-like基因。由此可見，降解組測序?qū)τ趧?dòng)物體miRNA靶基因的確定也具有一定的意義。相信隨著不同物種miRNA序列的逐漸豐富，降解組測序?qū)?huì)發(fā)揮更大的作用，兩者的有機(jī)結(jié)合將有助于解析生物體的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而為研究基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定理論基礎(chǔ)。