王得恩，陳充抒2，王宏宇，馬永華，徐 春

他克莫司對(duì)大鼠肝臟蛋白磷酸酶2A表達(dá)的影響

王得恩1，陳充抒2，王宏宇1，馬永華1，徐 春1

目的 通過(guò)建立他克莫司（FK-506）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，探討FK-506對(duì)大鼠肝臟蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A, PP2A）表達(dá)的影響。方法 將40只雄性SD大鼠（體重80～100 g/只）隨機(jī)分成FK-506組和對(duì)照組，每組20只。FK-506組給予FK-506灌胃，劑量為4 mg/（kg·d）；對(duì)照組給予等量飲用水。每月測(cè)量大鼠的空腹血糖及FK-506血藥濃度，連續(xù)測(cè)量5個(gè)月。5個(gè)月后空腹?fàn)顟B(tài)下乙醚麻醉處死大鼠，心尖穿刺取血測(cè)量大鼠空腹血清胰島素水平，并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）和胰島素敏感指數(shù)（insulin secretion index，ISI），用免疫組化方法檢測(cè)大鼠肝臟組織中PP2A的表達(dá)。使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 給藥3個(gè)月后FK-506組血糖平均濃度為（8.07±0.84） mmol/L，有80%（16/20）的大鼠血糖濃度大于7 mmol/L，高于對(duì)照組的（5.27±0.38）mmol/L；5個(gè)月后 FK-506組所有大鼠血糖濃度大于7 mmol/L。FK-506組大鼠的HOMA-IR高于對(duì)照組（t=47.80, P＜0.05），ISI低于對(duì)照組（t=37.70, P＜0.05）。FK-506組的PP2A在肝組織細(xì)胞漿內(nèi)的表達(dá)水平高于對(duì)照組（χ2=19.80, P＜0.05）。結(jié)論 FK-506可成功誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型。在FK-506誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝臟中，PP2A 表達(dá)明顯增高,這可能是FK-506升糖的作用機(jī)制之一。

他克莫司；器官移植后糖尿?。坏鞍琢姿崦?A；大鼠；胰島素抵抗

器官移植術(shù)是終末期疾病比較有效的治療方法，隨著外科學(xué)、異體配型技術(shù)、免疫抑制藥的發(fā)展，器官移植受者長(zhǎng)期存活得以實(shí)現(xiàn)，移植后糖尿?。╬ost transplantation diabetes mellitus，PTDM）是器官移植后的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年增加。移植后免疫抑制藥為PTDM的危險(xiǎn)因素之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素和鈣調(diào)磷酸酶抑制藥可以引起血糖的升高[1,2]，他克莫司（FK-506）是一種鈣調(diào)磷酸酶抑制藥，其升血糖作用機(jī)制尚不清楚。

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A, PP2A）是一類Ser/Thr蛋白磷酸酶抑制藥，通過(guò)去磷酸化作用使已經(jīng)磷酸化的激酶脫磷酸化，影響多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)。本研究模擬移植術(shù)后患者正常用藥途徑及用藥量，使用移植術(shù)后患者最常用的免疫抑制藥物FK-506作為誘導(dǎo)劑，建立大鼠的糖尿病模型，用免疫組化方法觀察FK-506組與對(duì)照組大鼠肝臟PP2A的表達(dá)水平，探討PP2A在FK-506誘導(dǎo)型糖尿病中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物材料 無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)的雄性SD大鼠40只，個(gè)體健康、鼠齡相仿，體重為80～100 g/只，出生后未做特殊處置，自然實(shí)驗(yàn)室環(huán)境生長(zhǎng)，購(gòu)自中國(guó)軍事科學(xué)院醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京） 2005-0006]。

1.2 試劑材料 FK-506膠囊：規(guī)格為1 mg/粒，安斯泰來(lái)制藥有限公司；放免胰島素檢測(cè)試劑盒：上海生物制品研究所；二步法EnVisionTM試劑盒：Dako生物公司（批號(hào)：K400511）；PP2A 試劑：CST公司（批號(hào)：2038）。

1.3 分組及給藥 將40只大鼠隨機(jī)分為兩組：FK-506組和對(duì)照組，每組20只，兩組的平均體重依次為（89.65±4.91）g、（89.60±4.50）g，體重組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.34, P=0.97），有可比性。

FK-506組給藥劑量為4 mg/（kg·d），對(duì)照組給予等量日常飲用水，兩組大鼠均在禁食禁水8 h后，經(jīng)胃管灌胃給藥，1 h后喂食。每月測(cè)空腹血糖和FK-506濃度，5個(gè)月后乙醚麻醉處死大鼠，心尖取血分離出血漿于－70℃冰箱（Thermo公司）中保存，大鼠肝臟和胰腺組織放于4%多聚甲醛中保存。

1.4 放免法測(cè)定大鼠血清胰島素水平 穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估（homeostasis model assessment，HOMA）指數(shù)計(jì)算方法：計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（insulin secretion index, ISI）和HOMA胰島素抵抗指數(shù)（ HOMA insulin resistance index, HOMA-IR）。計(jì)算公式：ISI=1/空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）×空 腹 胰 島 素（fasting serum lisulin，F(xiàn)INS）；HOMA－IR=FBG×FINS/22.5。

1.5 化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血漿中FK-506的濃度 FK-506組大鼠尾靜脈取血，以3000 r/min離心15 min得到血清標(biāo)本，與特異抗體混合，加入標(biāo)記的FK-506作為酶競(jìng)爭(zhēng)物，并與微珠上的FK-506藥物抗體進(jìn)行結(jié)合，接種采用磁場(chǎng)促使微珠分離，清洗后再將預(yù)激法和激發(fā)劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出FK-506的濃度。

1.6 免疫組化方法分析肝臟組織中PP2A蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果分析：（1）將每一視野下陽(yáng)性細(xì)胞按照百分比（%）分為5級(jí)。0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1分為陽(yáng)性±s描述，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)與率描述。（1）兩組大鼠的體重、血糖水平、ISI和HOMA-IR的比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組血糖比較的檢驗(yàn)水準(zhǔn)調(diào)整為0.05/6，以P＜0.008為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（2）兩組大鼠PP2A表達(dá)強(qiáng)度比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FK-506血藥濃度的測(cè)定 每月末對(duì)FK-506組大鼠尾靜脈取血，監(jiān)測(cè)每個(gè)月血藥濃度：第1個(gè)月（7.71±0.30） ng/ml，第2個(gè)月（8.40±0.48）ng/ml，第3個(gè)月（8.87±0.26）ng/ml，第4個(gè)月（8.91±0.18）ng/ml，第5個(gè)月（9.07±0.24）ng/ml。FK-506組大鼠平均5個(gè)月FK-506血藥濃度維持在（8.59±0.59）ng/mL，與人體抗排異治療所要求的血藥濃度一致。

2.2 血糖水平的測(cè)定 空腹（禁食禁水8 h以上）大鼠尾靜脈取血，測(cè)定大鼠的血糖水平。實(shí)驗(yàn)前兩組平均血糖水平無(wú)差異（t=0.56, P=0.58）。第3個(gè)月，F(xiàn)K-506組大鼠血糖平均濃度為（8.07±0.84）mmol/L ，且有80%（16/20）大鼠血糖濃度＞7.0 mmol/L；第5個(gè)月，F(xiàn)K-506組所有大鼠血糖濃度＞7.0 mmol/L，糖尿病模型誘導(dǎo)成功。同期，對(duì)照組所有大鼠的血糖濃度＜7.0 mmol/L。用藥前及用藥后兩組血糖情況見(jiàn)表1。

2.3 HOMA-IR及ISI 用藥5個(gè)月后，F(xiàn)K-506組大鼠的HOMA-IR高于對(duì)照組[（4.82±0.10） vs （3.24±0.11），t=47.80，P＜0.05]，ISI低于對(duì)照組[（0.092±0.002） vs（0.137±0.005），t=37.70，P＜0.05]。

2.4 大鼠肝臟PP2A 表達(dá)水平 用藥5個(gè)月后，對(duì)大鼠肝臟標(biāo)本行免疫組化染色。顯微鏡下與對(duì)照組大鼠比較，F(xiàn)K506組大鼠肝臟細(xì)胞被著為棕褐色（圖1、圖2）。測(cè)定PP2A的表達(dá)水平，F(xiàn)K-506組大鼠肝臟標(biāo)本中PP2A陽(yáng)性率為80%（16/20），對(duì)照組PP2A陽(yáng)性率為10%（2/20），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.80，P＜0.05）。細(xì)胞≤10%； 2分為陽(yáng)性細(xì)胞11%～50%； 3分為陽(yáng)性細(xì)胞51%～75%；4分為陽(yáng)性細(xì)胞＞75%。（2）將每個(gè)細(xì)胞的著色強(qiáng)度分為4級(jí)：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。（3）標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞百分比積分×顏色的強(qiáng)度積分＞3分可確定為陽(yáng)性。

1.7 大鼠糖尿病模型建立標(biāo)準(zhǔn) 大鼠尾部靜脈取血，監(jiān)測(cè)尾靜脈平均血糖水平＞7.0 mmol/L。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用x

表1 兩組大鼠用藥期間每個(gè)月末血糖水平的比較

圖1 對(duì)照組肝臟組織PP2A的表達(dá)（免疫組化染色×100）

圖2 FK-506組肝臟組織PP2A的表達(dá)（免疫組化染色×100）

3 討 論

FK-506作為第二代神經(jīng)鈣蛋白抑制藥（calcineurin inhibitor, CNI）的代表性藥物，屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,通過(guò)作用于T細(xì)胞而發(fā)揮免疫抑制作用。由于FK-506比其他CNI類藥物免疫抑制效用更強(qiáng)且更安全，被廣泛應(yīng)用于器官移植領(lǐng)域及非移植領(lǐng)域，逐漸成為最常用的免疫抑制藥物。長(zhǎng)期使用FK-506可引起糖代謝紊亂，甚至引起PTDM。實(shí)驗(yàn)證實(shí)FK-506可以對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生直接損害作用[3]。FK-506處理過(guò)的胰島β細(xì)胞及動(dòng)物模型胰島β細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞漿等都發(fā)生改變，甚至出現(xiàn)胰島β細(xì)胞凋亡。本研究將FK-506組的大鼠血液藥物濃度控制在6～10 μg/L之間，這是目前臨床維持免疫抑制作用最有效藥物濃度，同時(shí)研究者觀察到FK-506大鼠空腹血糖水平上升，HOMA-IR上升，而ISI下降，最終完成了FK-506誘導(dǎo)的糖尿病模型的建立。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)K-506誘導(dǎo)的糖尿病模型中：空腹血糖升高，空腹胰島素水平升高，C-肽濃度上升，ISI下降、HOMA-IR上升，確定PTDM患者存在IR[3-5]。導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生IR的原因主要有肥胖、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、微量元素缺乏、丙型肝炎等。有研究認(rèn)為，在上述各種原因?qū)е碌腎R中均存在PP2A的作用，在高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠IR模型中，內(nèi)臟脂肪細(xì)胞內(nèi)PP2A的表達(dá)明顯增加，該研究認(rèn)為PP2A表達(dá)增加，導(dǎo)致信號(hào)通路磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶（phosphatidylinositol 3 kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt）途徑被抑制，其中具體表現(xiàn)為Akt蛋白激酶磷酸化水平下降使大鼠磷酸化-絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（phospho-protein serine threonine kinase，P-Akt）減少，引起IR[6-9]。PP2A家族的主要成員參與了炎性因子對(duì)胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的Ser307磷酸化位點(diǎn)的影響,降低了Akt的磷酸化水平，抑制了胰島素信號(hào)通路[7]。Yan等[8]證明了轉(zhuǎn)錄因子FOXO1（forkhead box protein O1）活化核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子是PP2A，氧化應(yīng)激時(shí)胰島β細(xì)胞中的PP2A與FOXO1的核內(nèi)趨向激活相關(guān)，在2型糖尿病小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，血糖增高的同時(shí)，胰島β細(xì)胞中的PP2A和細(xì)胞核的FOXO1水平都有所升高。而FOXO1活化和核內(nèi)聚集是氧化應(yīng)激發(fā)生IR的關(guān)鍵。Galbo等[9]認(rèn)為，游離脂肪酸可增加PP2A的活性，而選擇性改變胰島素在肝臟葡萄糖代謝中的活性，線粒體功能障礙引起內(nèi)臟組織中游離脂肪酸增多。因此，可推測(cè)線粒體功能異常引起PP2A活性增加使P-Akt下降，葡萄糖合成激酶（glycogen synthase kinase-3 α，Gsk-3α）激活抑制糖原合成酶并促使糖的異生。研究人員發(fā)現(xiàn)，丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）促進(jìn)PP2A表達(dá)，抑制胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，作為HCV誘發(fā)糖尿病的機(jī)制之一[10-12]。綜上所述，PP2A活性增加是導(dǎo)致IR的重要環(huán)節(jié)。本研究由FK-506誘導(dǎo)糖尿病模型，并選取糖代謝的主要器官肝臟作為研究對(duì)象，分析了PP2A在肝臟組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，糖尿病大鼠的肝臟中PP2A的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示PP2A在FK-506引起胰島素抵抗中發(fā)揮一定的作用。

IR發(fā)生在胰島素與胰島素受體結(jié)合以后的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要有兩條：一條是通過(guò)PI3K-Akt途徑，另一條是通過(guò)蛋白活化絲裂原激活蛋白酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑。PI3K-/Akt途徑在IR中占據(jù)重要的位置，而MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑在IR發(fā)生中并非主要作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制MAPK通路后，葡萄糖的利用和糖原合成均未受到明顯影響，而PP2A參與胰島素信號(hào)通路中多個(gè)信號(hào)分子的去磷酸化[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)FK-506導(dǎo)致大鼠肝臟組織PP2A的表達(dá)增加，這可能是FK-506升糖機(jī)制之一。

FK-506可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生糖尿病，在FK-506誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的肝臟中，PP2A 表達(dá)明顯增高。FK-506通過(guò)增加PP2A的表達(dá)水平，干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路，可能是FK-506引起胰島素抵抗的機(jī)制之一。

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（2016-09-14收稿 2016-12-14修回）

（本文編輯 羅發(fā)菊）

Effect of tacrolimus in the expression of protein p-hosphatase 2A in liver tissue

WANG De'en1, CHEN Chongshu2, WANG Hongyu1, MA Yonghua1, and XU Chun1. 1. Department of Endocrinology, 2. Department of Pharmacology, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China

XU Chun, E-mail: wjxuchun@soho.com

Objective This study aimed to establish whether tacrolimus (FK-506) induced diabetes in rats, and analyze the effect of FK-506 on the expression of protein phosphatase 2A (PP2A) in liver tissue of the rats. Methods 40 male SD rats (80-100 g) were randomly divided into FK-506 group and control group. The rats in FK-506 group were administrated with tacrolimus 4 mg/kg daily. The rats in control group were given the same amount of normal drinking water daily. Rat body weights, fasting blood glucose concentration and blood concentration of tacrolimus were measured monthly. After 5 months all rats were euthanized by ether anesthesia. Fasting serum insulin levels of the rats were determined by puncture of cardiac apex, and then homeostasis model assessment-insulin resistance index (HOMA-IR) and insulin secretion index (ISI) were calculated. The expressions of PP2A in liver tissue of the rats were determined by immunohistochemical method. Software of SPSS 17.0 was used for statistical analysis. Results Three months after feeding of FK-506, the average concentration of blood glucose in FK-506 group was (8.07±0.84) mmol/L, in which blood glucose concentrations of 80% of the rats was greater than 7 mmol/L, and were higher as compared with control group (5.27±0.38) mmol/L; blood glucose concentration of all the rats in group FK-506 were greater than 7 mmol/L five months after feeding of FK-506. The HOMA-IR in FK-506 group was significantly higher than in control group (t=47.80, P＜0.05) and ISI was significantly lower than the control group (t=37.70, P＜0.05). The expression of PP2A in liver tissue in FK-506 group was higher than in control group (χ2=19.80, P＜0.05). Conclusions FK-506 can induce diabetes in rats. The expressions of PP2A in liver tissues of diabetic rats induced by FK-506 were increased, which may be due to the hyperglycemic effects of tacrolimus.

tacrolimus; post-transplantation diabetes mellitus; protein phosphatase2A; rat; insulin resistance

R587.1

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.02.006

武警總醫(yī)院科研項(xiàng)目（WZ20130303）

100039 北京，武警總醫(yī)院：1.內(nèi)分泌科, 2. 藥劑科

徐 春，E-mail：wjxuchun@soho.com