張慧，吳圣勇，王曉青，雷仲仁

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2北京市植物保護(hù)站，北京 100029）

球孢白僵菌對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴蛋白質(zhì)及游離氨基酸的影響

張慧1，吳圣勇1，王曉青2，雷仲仁1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2北京市植物保護(hù)站，北京 100029）

【目的】球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種重要的昆蟲(chóng)病原真菌，在毀滅性害蟲(chóng)蔥蠅（Delia antiqua）的防治上具有重大潛力。研究旨在明確球孢白僵菌侵染蔥蠅成蟲(chóng)后，血淋巴中蛋白質(zhì)和游離氨基酸的變化及其致病的關(guān)系，揭示球孢白僵菌對(duì)蔥蠅的生理調(diào)控機(jī)制?！痉椒ā炕谇蜴甙捉┚鷮?duì)蔥蠅成蟲(chóng)的室內(nèi)生物測(cè)定的研究基礎(chǔ)，使用菌株 GZGY-1-3，采用點(diǎn)滴法，用濃度為 1×108個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液處理蔥蠅初羽化成蟲(chóng)，采用BCA法及高效液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測(cè)定球孢白僵菌侵染不同時(shí)間（12、24、36、48、60和72 h）后，侵染組與對(duì)照組蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中蛋白質(zhì)總量及20種游離氨基酸含量；分析不同處理時(shí)間蛋白質(zhì)和游離氨基酸總量和重要氨基酸的含量變化?！窘Y(jié)果】球孢白僵菌侵染12—36 h，侵染組與對(duì)照組血淋巴蛋白濃度變化趨勢(shì)相近，均呈先下降后小幅度上升趨勢(shì)。但侵染組血淋巴中蛋白含量高于對(duì)照組，侵染24 h后，侵染組血淋巴內(nèi)蛋白質(zhì)是對(duì)照組的1.20倍；侵染48 h后，侵染組中蛋白含量下降到最低，僅為對(duì)照組的0.83倍。侵染60—72 h，血淋巴蛋白含量升高。蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中共檢測(cè)出20種游離氨基酸。侵染12—36 h，蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中游離氨基酸總量下降；侵染36 h，游離氨基酸總量下降到最低，僅為對(duì)照組的0.63倍；侵染48—60 h，游離氨基酸總量持續(xù)上升；侵染60 h后，游離氨基酸總量上升到最高，為對(duì)照組的2.01倍；感染72 h，游離氨基酸總量下降。侵染后，血淋巴內(nèi)游離氨基酸種類沒(méi)有變化，各種游離氨基酸的含量波動(dòng)差異較大。球孢白僵菌對(duì)血淋巴重要氨基酸的含量變化有顯著影響?！窘Y(jié)論】球孢白僵菌的侵染引起蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中蛋白質(zhì)和游離氨基酸的一系列變化，嚴(yán)重阻礙了蔥蠅成蟲(chóng)的正常生理活動(dòng)，在蔥蠅生物防治中具有應(yīng)用潛力。

蔥蠅；球孢白僵菌；血淋巴；蛋白質(zhì)；游離氨基酸

0 引言

【研究意義】 蔥蠅（Delia antiqua）主要危害百合科蔥屬作物，是一種毀滅性的害蟲(chóng)[1]。廣泛分布于北半球溫帶地區(qū)，如中國(guó)北方大部分區(qū)域以及北美的西部地區(qū)[2-3]。目前蔥蠅對(duì)常用化學(xué)藥劑如對(duì)擬菊酯類、毒死蜱等產(chǎn)生了抗性[4]。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種重要的廣譜性昆蟲(chóng)病原真菌，也是當(dāng)前研究和應(yīng)用最多的蟲(chóng)生真菌之一[5]，對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)有很好的防治效果[6-7]。昆蟲(chóng)蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)和游離氨基酸是寄主生存及球孢白僵菌增殖的限制因子[8-9]。球孢白僵菌在成蟲(chóng)血淋巴中的不斷增殖，會(huì)引起蔥蠅蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的動(dòng)態(tài)變化，因此明確球孢白僵菌侵染不同時(shí)間后蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中蛋白質(zhì)及游離氨基酸總量及重要氨基酸的含量變化，探索球孢白僵菌對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)的致病機(jī)理，對(duì)提高球孢白僵菌在蔥蠅生物防治中的作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲(chóng)病原真菌依靠血淋巴中的游離氨基酸不斷增殖，并觸發(fā)寄主昆蟲(chóng)的免疫防御，免疫蛋白和防御酶類的大量合成造成血淋巴中游離氨基酸的含量降低，但由于昆蟲(chóng)病原真菌的入侵，造成其他組織和血細(xì)胞等合成和分泌的蛋白質(zhì)和酶類進(jìn)入蟲(chóng)體血淋巴中[10]。關(guān)于昆蟲(chóng)病原真菌侵染寄主后引起寄主體內(nèi)蛋白質(zhì)與游離氨基酸含量變化已有一些報(bào)道，薛皎亮等[11]采用分光光度法測(cè)定了油松毛蟲(chóng)（Dentrolimus tabulaeformis）3—5齡幼蟲(chóng)被病原物白僵菌感染后，其體內(nèi)蛋白含量的變化，結(jié)果表明被白僵菌感染1—8 d蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量持續(xù)下降，而未感染的則變化不大；張仙紅等[12]對(duì)菜青蟲(chóng)（Pieris rapae）感染玫煙色擬青霉后血淋巴蛋白質(zhì)含量分析顯示，感病的3、4齡菜青蟲(chóng)血淋巴中蛋白質(zhì)含量明顯低于同期未感染的幼蟲(chóng)；RAHUTHA等[13]研究發(fā)現(xiàn)家蠶（Bombyx mori）感染球孢白僵菌后1—3 d，蛋白含量呈先上升后下降的趨勢(shì)；王龍江等[14]對(duì)感染球孢白僵菌后紅火蟻（Solenopsis invicta）體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的變化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示球孢白僵菌感染能顯著降低紅火蟻各蟲(chóng)態(tài)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量；李會(huì)平等[15]對(duì)桑天牛（Apriona germari）幼蟲(chóng)感染球孢白僵菌后蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)處理 2 d時(shí)桑天牛幼蟲(chóng)血淋巴內(nèi)蛋白質(zhì)含量明顯升高，5 d后體內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)持續(xù)下降，直至昆蟲(chóng)死亡。感染后1 d游離氨基酸含量下降，感染4 d蟲(chóng)體內(nèi)游離氨基酸含量逐漸上升；付麗君等[10]通過(guò)高效液相色譜（HPLC）對(duì)感染球孢白僵菌的小菜蛾（Plutella xylostella）血淋巴游離氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明染菌后小菜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)氨基酸含量明顯低于對(duì)照組，并且各處理組間各種游離氨基酸在量上存在一定差異；王達(dá)等用高效液相色譜法對(duì)光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）和桑天牛幼蟲(chóng)血淋巴游離氨基酸含量進(jìn)行了分析，氨基酸總量的變化呈先下降后上升的趨勢(shì)[16-17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國(guó)內(nèi)外對(duì)球孢白僵菌在蔥蠅上的應(yīng)用研究較少，且多集中在高毒力菌株的篩選。對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)感染球孢白僵菌后血淋巴中蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的變化未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確蔥蠅成蟲(chóng)感染球孢白僵菌后血淋巴中蛋白質(zhì)和游離氨基酸的變化，分析血淋巴中蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量變化與球孢白僵菌侵染致病的關(guān)系，以及重要氨基酸在侵染防御過(guò)程中的作用，評(píng)估球孢白僵菌在蔥蠅防治中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2015年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試蟲(chóng)源與菌種

蔥蠅于 2014年采自北京飛虎隊(duì)綠色生態(tài)韭菜防控示范基地，成蟲(chóng)飼養(yǎng)于30 cm×30 cm×30 cm的紗網(wǎng)養(yǎng)蟲(chóng)籠中，分別在脫脂棉中添加清水、牛奶、10%—15%的蜂蜜水，分別放入直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，置于養(yǎng)蟲(chóng)籠中，供成蟲(chóng)取食；幼蟲(chóng)使用半人工飼料飼養(yǎng)[18]。在恒溫培養(yǎng)箱（SANYO MLR-351H）中連續(xù)繼代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（22±1）℃，相對(duì)濕度（65±5）%，光周期L﹕D=16 h﹕8 h。供試成蟲(chóng)為連續(xù)飼養(yǎng)8代的初羽化成蟲(chóng)。

球孢白僵菌菌株 GZGY-1-3分離自被感染的亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）幼蟲(chóng)蟲(chóng)體，保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）（No. 9254），該菌株經(jīng)過(guò)毒力測(cè)定對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)有高效致病力，1×108個(gè)孢子/mL的濃度下，致死中時(shí)（LT50）為3.32 d，致死中濃度（LC50）為（2.07±0.06）×105個(gè)孢子/mL。

1.2 菌株培養(yǎng)與孢子懸浮液配制

用接種環(huán)挑取4℃保存的GZGY-1-3菌株，接種于產(chǎn)孢培養(yǎng)基，于26℃恒溫培養(yǎng)箱（GXZ-9240A）光周期L﹕D=12 h﹕12 h培養(yǎng)7 d，活化備用。試驗(yàn)前挑取活化培養(yǎng)14 d內(nèi)的成熟的孢子，與0.05%的吐溫80無(wú)菌水混合，并用玻璃組織研磨器研磨均勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制濃度為1×108個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，用于測(cè)定。

1.3 孢子接觸感染

取當(dāng)日羽化的成蟲(chóng)，用恒定CO2氣流使其麻醉，用微量移液器取 5 μL孢子懸浮液點(diǎn)滴于成蟲(chóng)前翅與身體的結(jié)合處，放入有紗網(wǎng)養(yǎng)蟲(chóng)籠中飼養(yǎng)（飼養(yǎng)方式同1.1）。對(duì)照組用0.05%的吐溫80無(wú)菌水點(diǎn)滴。

1.4 蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴收集

血淋巴的收集采用雙管離心法[19]。分別于侵染12、24、36、48、60、72 h取侵染組蔥蠅成蟲(chóng)，用蒸餾水沖洗3—4次，濾紙吸干，在冰浴條件下剪去雙翅，雙管離心，每管10頭成蟲(chóng)，在4℃、500 r/min下離心10 min，每個(gè)處理約80頭成蟲(chóng)（試驗(yàn)測(cè)得每頭成蟲(chóng)血淋巴體積約為0.416 μL），用微量進(jìn)樣器吸取收集血淋巴液30 μL于干凈離心管中，迅速向血淋巴液中加入60 μL 3%的磺基水楊酸溶液（以上處理均在冰浴下進(jìn)行）于4℃、12 000 r/min下離心15 min，取上清液保存于-20℃冰箱中，7 d內(nèi)上機(jī)分析。對(duì)照組血淋巴收集方式和侵染組相同。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)樣品。

1.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用南京建成生物科技公司的總蛋白定量測(cè)定試劑盒（BCA法）[20]，參照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.6 游離氨基酸含量測(cè)定

取標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)、待測(cè)樣本 50 μL加50 μL蛋白沉淀劑，混勻后4℃、13 200 r/min下離心4 min。取上清10 μL，加50 μL標(biāo)記緩沖液混勻，瞬時(shí)離心。再加20 μL衍生液混勻、瞬時(shí)離心后置55℃恒溫衍生15 min。衍生后樣本置冰箱冷卻后混勻瞬離，取50 μL上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。儀器：高效液相色譜-四級(jí)桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀 HPLC-MS/MS API3200 Q-TRAP。色譜條件：色譜柱MSLab 45+AAC18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：A水相：水（1‰甲酸） B有機(jī)相：乙腈（1‰甲酸）0—37℃梯度洗脫。柱溫50℃，流速1 mL·min-1時(shí)檢測(cè)，進(jìn)樣量為5 μL。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)蛋白質(zhì)含量與游離氨基酸含量進(jìn)行Tukey HSD統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示方式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）。采用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果

2.1 球孢白僵菌侵染對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴蛋白質(zhì)含量的影響

蔥蠅成蟲(chóng)感染球孢白僵菌后，侵染后12—36 h，侵染組與對(duì)照組的蛋白含量的變化趨勢(shì)相近，均呈先下降后小幅度上升的趨勢(shì)，但侵染組蛋白含量顯著高于對(duì)照組；48—60 h，則顯著低于對(duì)照組；侵染后72 h，蛋白含量又上升。不同處理時(shí)間的侵染與未侵染的蔥蠅血淋巴的蛋白含量均存在顯著性差異（F=264.996；df=35,11；P＜0.05）。侵染24 h后，血淋巴內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照組含量的1.20倍，侵染48 h后，蛋白質(zhì)含量下降到最低，僅為對(duì)照組蛋白含量的0.83倍（圖1）。

2.2 球孢白僵菌侵染對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴游離氨基酸總量的影響

蔥蠅成蟲(chóng)感染球孢白僵菌后，侵染組與對(duì)照組游離氨基酸總量變化趨勢(shì)差異較大。處理組中游離氨基酸總量波動(dòng)較大。不同處理時(shí)間下侵染與未侵染的蔥蠅血淋巴中游離氨基酸總量均存在顯著差異（F=1458.34；df=35,11；P＜0.05）。侵染36 h后，游離氨基酸總量下降至最低，僅為對(duì)照組的0.63倍；侵染60 h后，游離氨基酸總量達(dá)到最高，是對(duì)照組含量的2.01倍（圖2）。

圖1 蔥蠅感染球孢白僵菌后血淋巴蛋白質(zhì)含量的變化Fig. 1 Changes of the content of protein in haemolymph of D. antiqua adult infected with B. bassiana

2.3 球孢白僵菌侵染對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴必需氨基酸和非必需氨基酸總量的影響

圖 2 蔥蠅感染球孢白僵菌后血淋巴游離氨基酸總量的變化Fig. 2 Changes of the content of total free amino acid in haemolymph of D. antiqua adult infected with B. bassiana

蔥蠅血淋巴中的必需氨基酸和非必需氨基酸的含量大體一致，并且兩者含量的變化和游離氨基酸總量的含量變化一致。圖3-A中，侵染組中必需氨基酸變化幅度較大，侵染36 h后，必需氨基酸含量下降到最低，僅為對(duì)照組的0.61倍。侵染60 h后，必需氨基酸含量達(dá)到最高，是對(duì)照組含量的2.08倍。圖3-B中，侵染36 h后，非必需氨基酸含量下降到最低，僅為對(duì)照組的0.57倍；侵染60 h后，非必需氨基酸總量達(dá)到最高，是對(duì)照組的1.94倍；但在侵染72 h時(shí)，侵染組與對(duì)照組的非必需氨基酸的含量基本相同。

圖3 蔥蠅感染球孢白僵菌后血淋巴必需氨基酸（A）與非必需氨基酸（B）總量的變化Fig. 3 Changes of the content of essential amino-acid (A) and non-essential amino-acid (B) in haemolymph of D. antiqua adult infected with B. bassiana

2.4 蔥蠅成蟲(chóng)體內(nèi)重要氨基酸含量變化

含硫氨基酸中，侵染組中甲硫氨酸呈先下降后上升然后又下降的趨勢(shì)，24、36及72 h侵染組甲硫氨酸的含量低于對(duì)照組，36 h下降到最低水平，僅為對(duì)照組的0.28倍。半胱氨酸是蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中的稀有氨基酸，侵染組中半胱氨酸的含量基本沒(méi)有變化，在72 h含量略有上升。而對(duì)照組中半胱氨酸的含量的變化較大，并且始終高于侵染組的半胱氨酸含量（表1）。

表1 球孢白僵菌對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴含硫氨基酸濃度的影響Table 1 Influence of B. bassiana on content of sulfur-containing amino acid in haemolymph of D. antiqua adult (μg·mL-1)

其他的重要氨基酸中，侵染組中脯氨酸的變化與游離氨基酸總量的變化趨勢(shì)相同，但侵染組血淋巴中脯氨酸的含量波動(dòng)較大，而對(duì)照組在36—72 h后脯氨酸含量基本沒(méi)有變化。侵染組中精氨酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，始終高于對(duì)照組的精氨酸含量，侵染36 h后，精氨酸含量下降至最低，為對(duì)照組的1.04倍；侵染60 h后，精氨酸含量上升至最大值，為對(duì)照組的3.62倍。侵染組中蘇氨酸的含量變化與游離氨基酸總量的變化趨勢(shì)相同，侵染36 h后，蘇氨酸含量下降至最低，為對(duì)照組的0.54倍；侵染48 h，上升至最大值，為對(duì)照組的 1.39倍。侵染組中色氨酸的含量變化與游離氨基酸總量的含量變化相同。36 h下降至最低，為對(duì)照組的0.42倍；60 h上升至最大值，為對(duì)照組的 1.72倍。侵染組谷氨酰胺的變化趨勢(shì)與游離氨基酸總量的變化趨勢(shì)相同，但是侵染組血淋巴中谷氨酰胺的含量始終高于對(duì)照組，侵染48 h后，谷氨酰胺的含量達(dá)最大值，為對(duì)照組血淋巴中谷氨酰胺含量的2.08倍（表2）。

3 討論

昆蟲(chóng)血淋巴是昆蟲(chóng)代謝的重要場(chǎng)所，也是代謝過(guò)程中各種物質(zhì)儲(chǔ)存和交換的場(chǎng)所[21]，在昆蟲(chóng)的防御、抗凍、免疫、損傷應(yīng)答等方面起重要作用。昆蟲(chóng)為維持其正常的生命活動(dòng)，其血淋巴中的蛋白質(zhì)、游離氨基酸等重要代謝物必須維持在一個(gè)較為恒定的水平。通過(guò)對(duì)感病昆蟲(chóng)血淋巴蛋白和游離氨基酸的研究可以了解球孢白僵菌在寄主蟲(chóng)體內(nèi)增殖時(shí)寄主昆蟲(chóng)生理生化可能存在的變化。

表2 球孢白僵菌對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴其他重要氨基酸濃度的影響Table 2 Influence of B. bassiana on content of other important free amino acids in haemolymph of D. antiqua adult (μg·mL-1)

由于初羽化成蟲(chóng)的取食飛行、成蟲(chóng)性成熟及交配等行為，對(duì)照組血淋巴中蛋白和游離氨基酸含量存在幅度變化[22]，羽化12—24 h，成蟲(chóng)大量取食并消化吸收，大量游離氨基酸在血淋巴中累積，在羽化后36—60 h，由于成蟲(chóng)在性腺發(fā)育、求偶和交配過(guò)程及卵黃發(fā)生和卵黃蛋白合成中消耗大量蛋白質(zhì)和游離氨基酸等物質(zhì)，血淋巴中蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量均下降，這與筆者觀察到成蟲(chóng)在羽化36 h后開(kāi)始交配，6 d后開(kāi)始產(chǎn)卵的結(jié)果相符。

球孢白僵菌侵染會(huì)影響蔥蠅成蟲(chóng)的蛋白質(zhì)代謝。感染后12—36 h，血淋巴中蛋白含量高于對(duì)照組，這是由于球孢白僵菌的侵入會(huì)觸發(fā)昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量免疫蛋白，如抗菌蛋白（肽）和相關(guān)防御酶（超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）等），引起蔥蠅血淋巴中蛋白含量增加。感染48 h后，由于球孢白僵菌的增殖和生長(zhǎng)，消耗血淋巴中大量的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且由于蔥蠅自身免疫調(diào)節(jié)功能的逐步喪失和球孢白僵菌體外分泌酶以及昆蟲(chóng)水解酶類的破壞等原因，血淋巴中的蛋白質(zhì)大量降解，導(dǎo)致蛋白含量下降；感染60—72 h，由于組織解離釋放大量蛋白質(zhì)，同時(shí)由于蔥蠅對(duì)食物消化和吸收功能降低甚至喪失，使血淋巴中蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制而滯留，從而導(dǎo)致血淋巴蛋白含量升高。這與李會(huì)平等[15]對(duì)白僵菌侵染桑天牛幼蟲(chóng)后，蛋白含量先上升后持續(xù)下降的結(jié)果存在差異，但是與其在電泳試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)侵染后期新的蛋白質(zhì)條帶產(chǎn)生結(jié)果吻合。

昆蟲(chóng)血淋巴中含有大量的游離氨基酸，一些學(xué)者曾報(bào)道昆蟲(chóng)被病原物侵染以及重要外界條件如CO2影響后，其血淋巴中游離氨基酸總量呈先下降后上升的變化趨勢(shì)[23-24]。蔥蠅成蟲(chóng)被球孢白僵菌侵染后，血淋巴中游離氨基酸總量的變化趨勢(shì)為先下降后上升最后下降。侵染12—36 h，蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中游離氨基酸總量下降，主要是由于球孢白僵菌侵入后利用昆蟲(chóng)血淋巴中的游離氨基酸進(jìn)行增殖，同時(shí)免疫蛋白和防御酶類的合成大量消耗了血淋巴中的游離氨基酸；侵染36—60 h，游離氨基酸總量持續(xù)上升，是因?yàn)槊庖哒{(diào)節(jié)能力下降，對(duì)游離氨基酸的利用降低，同時(shí)球孢白僵菌的侵入導(dǎo)致組織解體，大量蛋白質(zhì)降解為游離氨基酸；感染72 h，游離氨基酸含量下降，主要是由于球孢白僵菌在蟲(chóng)體內(nèi)的大量增殖消耗大量游離氨基酸，直至成蟲(chóng)死亡?？傮w上，游離氨基酸含量的變化總是朝著有利于球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育增殖致病的方向進(jìn)行。這也與上述血淋巴中蛋白質(zhì)含量變化相吻合。

蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中檢測(cè)出20種游離氨基酸，表明其血淋巴成分具備球孢白僵菌大量繁殖的條件[25]。其中必需氨基酸與非必需氨基酸的含量變化和游離氨基酸總量的變化大致相同，且兩者含量大體相同。球孢白僵菌的侵染對(duì)其影響是同步的。本研究也發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌的侵染沒(méi)有改變蔥蠅血淋巴中游離氨基酸的種類，但是對(duì)各類游離氨基酸含量變化的影響相對(duì)較大。

含硫氨基酸中甲硫氨酸和半胱氨酸具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。含硫氨基酸可以形成許多重要的衍生物，最具代表性的是谷胱甘肽，從而間接參與細(xì)胞內(nèi)氧自由基的解毒反應(yīng)，在防治過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞的損傷中具有重要作用[26]。甲硫氨酸是昆蟲(chóng)產(chǎn)卵必需的氨基酸。甲硫氨酸在整個(gè)侵染過(guò)程中，略有上升，然后降至最低，表明球孢白僵菌的侵染阻礙了蟲(chóng)體對(duì)甲硫氨酸的利用，對(duì)蔥蠅成蟲(chóng)的繁殖產(chǎn)生不利影響，這與筆者研究白僵菌侵染蔥蠅后明顯降低了其產(chǎn)卵和繁殖能力的結(jié)果一致。半胱氨酸是蔥蠅成蟲(chóng)血淋巴中的稀有氨基酸，是昆蟲(chóng)體內(nèi)抗真菌肽的重要組成成分[27]。侵染組中半胱氨酸的含量始終低于對(duì)照組的半胱氨酸含量；侵染前期，球孢白僵菌的侵入觸發(fā)蔥蠅的免疫反應(yīng)，大量抗真菌肽的合成消耗了大量的半胱氨酸。侵染后期真菌的大量增殖，大量消耗了血淋巴中的半胱氨酸。

脯氨酸是昆蟲(chóng)的主要能源物質(zhì)，具有參與滲透壓的調(diào)節(jié)，穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢(shì)和提高抗逆性的作用[28]。侵染組蔥蠅血淋巴中脯氨酸的含量變化和游離氨基酸總量的變化相同，但是低于對(duì)照組的脯氨酸含量，表明球孢白僵菌的入侵破壞了蔥蠅成蟲(chóng)的正常生理代謝，脯氨酸的正常生理作用受到抑制。精氨酸是微生物免疫反應(yīng)的效應(yīng)因子，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、繁殖和氮平衡有重要影響[29]，精氨酸是合成生物活性物質(zhì)NO的底物，NO通過(guò)多種途徑直接或者間接地調(diào)控免疫反應(yīng)。侵染組中精氨酸含量呈先降低后上升的趨勢(shì)。侵染36 h后，精氨酸含量降至最低，大量用于免疫蛋白、酶及NO的合成，參與免疫反應(yīng)；侵染48—72 h，蔥蠅的免疫系統(tǒng)崩潰，相關(guān)酶與蛋白的合成受阻，精氨酸不能有效利用，在血淋巴中滯留。蘇氨酸是免疫蛋白中含量最為豐富的一種必需氨基酸，也是免疫蛋白分子合成的第一限制性氨基酸，其對(duì)免疫的影響主要表現(xiàn)在體液免疫[30]。侵染12—36 h，蟲(chóng)體內(nèi)相關(guān)免疫蛋白和酶的產(chǎn)生，造成蘇氨酸含量下降，侵染48 h后，免疫系統(tǒng)的崩潰，導(dǎo)致蘇氨酸滯留。色氨酸是一種重要的芳香族氨基酸，通過(guò)分解產(chǎn)生中間代謝物，生成自由基清潔劑和抗氧化劑，在體液免疫中發(fā)揮重要作用[31]。球孢白僵菌的侵入引起免疫反應(yīng)，色氨酸參與免疫蛋白的產(chǎn)生和自由基的清除，導(dǎo)致含量降低，隨著球孢白僵菌的大量增殖，免疫失衡，大量色氨酸富集。谷氨酰胺對(duì)氮素代謝中氨基的傳遞有重要作用，含量上升表明組織分解相當(dāng)劇烈。谷氨酰胺含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且始終高于對(duì)照組谷氨酰胺含量。侵染0—36 h，谷氨酰胺參與免疫反應(yīng)，含量下降；谷氨酰胺的上升表示蟲(chóng)體內(nèi)組織分解非常劇烈，白僵菌的侵染導(dǎo)致蟲(chóng)體的大量組織和器官的分解，這與本試驗(yàn)中侵染后成蟲(chóng)脂質(zhì)含量持續(xù)下降相吻合。

4 結(jié)論

球孢白僵菌侵染蔥蠅成蟲(chóng)后，血淋巴中的蛋白質(zhì)和氨基酸含量發(fā)生系列變化，有利于球孢白僵菌的侵染致病，球孢白僵菌在蔥蠅的生物防治中有應(yīng)用的潛力。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Changes in the Contents of Proteins and Free Amino Acid in Haemolymph of Delia antique Adult Infected by Beauveria bassiana

ZHANG Hui1, WU ShengYong1, WANG XiaoQing2, LEI ZhongRen1
(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2Plant Protection Station of Beijing, Beijing 100029)

【Objective】Beauveria bassiana is an important biological agent for control of Delia antiqua. The objective of this study is to assess the changes of proteins and free amino acid in haemolymph of D. antiqua adult infected by B. bassiana at different times, understand the relationship between the contents of proteins and free amino acids and the infection of B. bassiana.【Method】Based on the result of dose-response bioassay against D. antiqua adults infected by B. bassiana, individual newly enclosed D. antiqua adults were inoculated with 5 μL 1×108conidia/mL conidial suspension of the GZGY-1-3 strain by micro-drop method. Then the contents of proteins and free amino acid of at different times (12, 24, 36, 48, 60 and 72 h) were measured in infected and uninfected D. antiqua adult using BCA and HPLC-MS/MS. Finally, the relationship between the infection and the contents of the keyfree amino acid was analyzed. 【Result】 The content of proteins declined first and then increased at 12-36 h. The treatment group and control group showed similar changes. However the contents of proteins of the treatment group were higher than the control group. The content of proteins increased to the maximum in 24 h after inoculation, was 1.20 times greater than the control group. The content of proteins of the treatment group declined to the minimum at 48 h, was only 0.83 lower times than the control group, and increased at 60-72 h. The results of amino acids analysis showed that there were no different of free amino acid between the treatment and control groups of D. antiqua adult. The content of free amino acids decreased in 12-36 h, increased in 48-60 h and decreased in 72 h again after inoculation. The content of free amino acids declined to the minimum in 36 h after inoculation, was 0.63 times lower than the control group and increased to the maximum in 60 h after inoculation, was 2.01 times greater than the control group. After infection, there was no change in the type of free amino acids in the haemolymph, free amino acid content of various fluctuations was quite different. The infection of B. bassiana had significant influence on the contents of important amino acids in the haemolymph.【Conclusion】 The B. bassiana invaded into the insect body affected the balance of the proteins and amino acids in the haemolymph. It seriously hampered the normal physiological activity of the D. antiqua adult. The results of the experiment indicated that B. bassiana strains could effectively control D. antiqua adult.

Delia antique; Beauveria bassiana; haemolymph; protein; free amino acid

2016-06-13；接受日期：2016-08-18

國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-25-B-07）、韭菜安全生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究及科技示范基地建設(shè)（Z151100001215009）

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