富巖，楊小楠，魏開華，富俞淞，云文琦，鄭博崴，劉丹，于在林

具創(chuàng)新分子結(jié)構(gòu)的更優(yōu)長效性重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白的表達(dá)、制備和特性研究

富巖，楊小楠，魏開華，富俞淞，云文琦，鄭博崴，劉丹，于在林

目的研究作為藥物級別重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白的生產(chǎn)制備工藝；開展詳盡的融合蛋白理化特性研究；提出作為長效創(chuàng)新藥物的質(zhì)量基礎(chǔ)和技術(shù)指標(biāo)。

方法利用基因工程技術(shù)構(gòu)建 1 個能穩(wěn)定表達(dá)全新分子結(jié)構(gòu)和更優(yōu)長效性的重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（rHSA/EPO）的基因工程 CHO 細(xì)胞株；研究建立懸浮、無血清培養(yǎng)基，批次化、可線性放大的規(guī)模化生產(chǎn)工藝，并就分離純化的融合蛋白進(jìn)行詳盡的理化特性分析。

結(jié)果獲得的 rHSA/EPO 蛋白質(zhì)單體純度達(dá)到 97% 以上；經(jīng)不同作用位點(diǎn)蛋白酶水解的 rHSA/EPO 產(chǎn)物通過MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋譜和 Nano LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜檢測得到總序列覆蓋率 100%；N-端氨基酸序列前 15 個氨基酸與理論序列相符；rHSA/EPO 為糖基化蛋白，定位了糖基化位點(diǎn)；原液中融合蛋白的質(zhì)譜分子量測定值為 93 kD；酶深度脫糖后的質(zhì)譜分子量測定結(jié)果為84205 D，與理論分子量 84849.52 D 值相近；融合蛋白含有 1 個自由巰基，表明僅有 1 個游離半胱氨酸存在；經(jīng)圓二色光譜分析比對表明,HSA 和 EPO 各自的空間二級構(gòu)象未變；毛細(xì)管電泳測定有多個電荷異構(gòu)體范圍在 pI 5.1 ～5.8，等電聚焦獲得的等電點(diǎn)值（pI）約為 pI 4.9；紫外光譜呈現(xiàn)典型蛋白質(zhì)光譜特征；原料藥中的細(xì)菌內(nèi)毒素、宿主蛋白質(zhì)、外源性 DNA 的殘留量均符合藥物原料藥的要求。免疫學(xué)鑒別為陽性；小鼠體內(nèi)生物比活性測定結(jié)果值為 0.9 × 105IU/mg；體外 UT7 細(xì)胞法與小鼠體內(nèi)生物活性測定較大差異，但體內(nèi)與體外生物活性測定方法可用于不同試驗(yàn)?zāi)康?，且相互間也具有一定的相關(guān)系數(shù)。

結(jié)論理化特性研究獲得較為全面的藥學(xué)數(shù)據(jù)，其結(jié)果可作為指導(dǎo)“注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（CHO細(xì)胞）”原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和制造檢定規(guī)程的基礎(chǔ)，并顯示出原創(chuàng)的 rHSA/EPO（之間無連接肽）具有創(chuàng)新性，符合作為藥物的更優(yōu)分子結(jié)構(gòu)要求。

白蛋白類； 紅細(xì)胞生成素； CHO 細(xì)胞；重組融合蛋白質(zhì)類

慢性腎病患者（腎衰、尿毒癥尤其是進(jìn)行透析的晚期患者）因其腎臟無法生成足量紅細(xì)胞生成素，常常會罹患貧血癥；接受化療的癌癥患者亦可能罹患貧血癥而迫使他們終止化療。重組促紅素藥物可預(yù)防或改善由手術(shù)引起的失血性貧血癥，從而提升慢性腎科及腫瘤科患者的生活質(zhì)量，減少手術(shù)患者輸血的需求，在臨床上具有極大價值[1]。促紅素（erythropoietin，EPO）是第一個被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的造血生長因子。促紅素屬含唾液酸的酸性糖蛋白，它可與紅細(xì)胞前體細(xì)胞表面的 EPO 受體結(jié)合，促進(jìn)其血紅蛋白的合成，使之增殖分化成紅細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)紅細(xì)胞和血紅蛋白的生理平衡[2]。EPO 是一個非種屬特異性的強(qiáng)有力造血生長因子，體外分析顯示，在 0.05 ～ 1 U/ml 的濃度時即具有劑量依賴效應(yīng)。根據(jù) EPO 的 cDNA 核苷酸序列推斷，其基因產(chǎn)物為一個含 193 個氨基酸的前體肽，其中前 27 個高度疏水性的氨基酸構(gòu)成分泌信號肽，成熟的 EPO 由 166 個氨基酸組成，分子內(nèi)有 2 個二硫鍵，3 個 N-糖基化位點(diǎn)和 1 個O-糖基化位點(diǎn)，其中 2 個二硫鍵在變性 EPO 復(fù)性并折疊成有生物活性構(gòu)型時是必不可少的。從再生障礙性貧血患者的尿中提純的天然 EPO 的相對分子量為 34 000，而由 CHO 細(xì)胞表達(dá)的重組人EPO 的相對分子量為 30 400，其成分約 60% 為蛋白質(zhì)，40% 為碳水化合物[3-5]。去唾液酸或去糖基化不影響 EPO 的體外生物活性，但卻縮短了其體內(nèi)的半衰期，并使其在體內(nèi)迅速喪失活性。因此，糖基化對保持 EPO 的生物活性十分重要，只有在真核細(xì)胞中得到表達(dá)的 EPO 在體內(nèi)才能維持較好的生物學(xué)活性。美國的 Amgen 公司先后開展了重組人促紅素在 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)制備和藥物研究[6-8]。

人促紅素蛋白質(zhì)藥物的長效化也受到廣泛的關(guān)注。于在林首次公開了構(gòu)建在人血清白蛋白和促紅素蛋白質(zhì)之間不設(shè)有連接肽的 rHSA/EPO 分子結(jié)構(gòu)后[9-10]，又有 2 個文獻(xiàn)公開報(bào)道構(gòu)建重組人血清白蛋白-促紅素融合蛋白的研究結(jié)果，但都是在人血清白蛋白與促紅素蛋白質(zhì)之間設(shè)有一個氨基酸長度不等的連接肽，構(gòu)成白蛋白-促紅素融合蛋白[11-13]。本文將報(bào)道利用 CHO 細(xì)胞表達(dá)和制備“不設(shè)有連接肽”的重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白，并就其理化特性來確定 rHSA/EPO 原料藥（原液）的質(zhì)量指標(biāo)，作為創(chuàng)新藥長效“注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白”的制造和檢定規(guī)程的依據(jù)。關(guān)于 rHSA/EPO 已經(jīng)完成的在不同動物模型開展的藥效學(xué)研究、藥理學(xué)研究、毒理學(xué)研究、藥代、毒代、生殖毒性研究等藥效學(xué)和安全性評價結(jié)果等成藥性研究將另文報(bào)道[14]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 本研究中使用的化學(xué)試劑均為分析級或藥用級；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、聚合酶、胰蛋白酶、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、DNA和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品等均購自美國 Promaga 公司；CHO-K1 細(xì)胞來自美國 ATCC；pcDNA3.1 載體質(zhì)粒 DNA、G418 抗生素、Lipofectin 脂質(zhì)體和CHO 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基購自美國 Invitrogen 公司；規(guī)模化生物反應(yīng)器生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基購自北京清大天一生物技術(shù)有限公司；各種分離純化介質(zhì)填料均來自美國 GE Healthcare 公司；兩性電解質(zhì)購自美國 Ampholyte 公司；等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 Bio-Rad 公司；人血清白蛋白特異鼠單克隆抗體購自美國 Sigma 公司；特異識別人促紅素的兔抗體購自 R&D 公司和武漢博士德公司；重組人促紅素生物學(xué)活性測定標(biāo)準(zhǔn)品、CHO 細(xì)胞宿主 DNA國家標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國食品藥品檢定研究院；CHO 細(xì)胞宿主蛋白檢測試劑盒為美國 Cygnus 公司產(chǎn)品；Dig-DNA 標(biāo)記試劑盒為美國 Roche 公司產(chǎn)品；細(xì)菌內(nèi)毒素檢測鱟試劑為中國湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品；改進(jìn)型 Lowry蛋白含量檢測試劑盒為美國 Pierce 公司產(chǎn)品；糖蛋白染色試劑盒為美國 Thermo 公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 高效液相色譜儀 LC-10Avp Plus 為日本島津公司產(chǎn)品；烷基硅烷鍵合硅膠填充柱購自美國 Agilent 公司（C-18、C-4）；色譜柱 TSK-GEL G2000SWXL（7.8 mm × 300 mm）購自日本 Tosoh公司；CEInfinite C01 型毛細(xì)管電泳儀、WCID-FC毛細(xì)管柱（100 μm × 5 cm，有效長度 5 cm）和 HR AESlyte 3-10 為美國 AES 公司；microTOF-Q II質(zhì)譜儀購自德國布魯克公司；UltiMate3000 納升液相色譜購自美國 Dionex 公司；ABI-4700 MALDI-TOF/TOF 和 AB4800 MALDI TOF/TOF購自美國 AB 公司；全自動控制 120 L 不銹鋼生物反應(yīng)器系統(tǒng)為 MERCK-Millipore 中國公司制造；連續(xù)流離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品。預(yù)過濾器（ViresolveA1HC 濾器）和納米級膜過濾器（ViresolvePro 濾器，納米濾膜 3.1 cm2）為Merck-Millpore 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 高效表達(dá) rHSA/EPO 的 CHO 細(xì)胞基因工程株的構(gòu)建 采用常規(guī)的基因克隆和 PCR 技術(shù)，人血清白蛋白基因和人促紅素成熟肽基因片段分別克隆自人胎肝或者人胎腎全 RNA 轉(zhuǎn)錄的cDNA 文庫。PCR 擴(kuò)增的 EPO 成熟肽 DNA 片段插入到帶有分泌肽的人血清白蛋白基因全 DNA序列的脊椎動物細(xì)胞轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pcDNA3.1-HSA 的Bsu36 I 和 Xho I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間。人促紅素成熟肽的 N 端與人血清白蛋白成熟肽的 C 端之間直接基因融合，獲得 pcDNA3.1-HSA/EPO 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。含有全融合蛋白基因序列的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與 CHO 細(xì)胞株發(fā)生基因組重組，將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的基因表達(dá)組盒重組在 CHO 細(xì)胞染色體上，在含有不同濃度的 G418 抗生素培養(yǎng)基中，挑選出最具有抗生素抗性的集落細(xì)胞群分別擴(kuò)增后，經(jīng)過免疫法確認(rèn)能夠高效表達(dá)分泌rHSA/EPO 的 CHO 細(xì)胞工程株。具體的 DNA 克隆程序和所用的合成 HSA 和 hEPO 的 DNA 引物序列參見文獻(xiàn)[9]。在 CHO 細(xì)胞生長擴(kuò)增時，CMV 啟動子也就同時啟動了 rHSA/EPO 基因的表達(dá)和融合蛋白的生產(chǎn)。rHSA/EPO 被直接分泌到CHO 細(xì)胞的人工合成無血清培養(yǎng)基的上清液中，呈現(xiàn)為可溶、蛋白質(zhì)空間構(gòu)造折疊正確、糖基化的大分子蛋白質(zhì)。

1.2.2 rHSA/EPO 規(guī)?；療o血清懸浮培養(yǎng)批次生產(chǎn)方法 高效表達(dá)和分泌 rHSA/EPO 的 CHO 細(xì)胞工程株是貼壁細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室馴化成為可懸浮生長的細(xì)胞形態(tài)。隨著 CHO 細(xì)胞工程株培養(yǎng)單位密度的增加，rHSA/EPO 的表達(dá)量呈線性增加，由此制備 rHSA/EPO 的原始細(xì)胞庫。原始細(xì)胞庫經(jīng)多代次傳代并確認(rèn)表達(dá)量仍然穩(wěn)定后，用于主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫的制備。rHSA/EPO 研究和生產(chǎn)用各種細(xì)胞庫制備和生長所用無血清培養(yǎng)液中均不添加和不含有任何抗生素、動物源蛋白質(zhì)、人源或者動物源血清組分。rHSA/EPO 的規(guī)?；a(chǎn)采用全自動控制 120 L 不銹鋼生物反應(yīng)器系統(tǒng)。1 支工作細(xì)胞庫細(xì)胞經(jīng)不超過 5 個代次的擴(kuò)增后，接種于含有 40 L 起始無血清培養(yǎng)基的 120 L生物細(xì)胞反應(yīng)器中。CHO 細(xì)胞工程株的生長和擴(kuò)增采用市售的無血清培養(yǎng)基或改進(jìn)優(yōu)化的人工配制無血清培養(yǎng)基進(jìn)行。擴(kuò)增生長的后期，需流加富集培養(yǎng)液以提高細(xì)胞單位密度。待細(xì)胞密度達(dá)（0.5 ～ 1.5）× 107個/ml、在罐培養(yǎng) 11 ～ 13 d 時收獲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液。經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)分離細(xì)胞和上清液。

1.2.3 rHSA/EPO 的分離純化 含 rHSA/EPO的細(xì)胞上清液經(jīng)酸調(diào)至 pH 3.4 ～ 3.5，維持 30 min后，用堿調(diào)至 pH 5 左右，經(jīng) 0.22 μm 濾器過濾后，按文獻(xiàn)[15]描述的方法經(jīng) Capto-MMC 介質(zhì)填料柱層析富集 rHSA/EPO 目的蛋白質(zhì)，純度達(dá)到90%，然后通過 Phenyl-S FF、Chelating Sepharose Fast Flow 等介質(zhì)填料柱層析進(jìn)一步富集和純化至95% 以上。精純的 rHSA/EPO 成為原液（原料藥）前的最后一步是通過預(yù)過濾器和納米級膜過濾器串聯(lián)過濾。過濾時間為 1 h，工藝安全系數(shù)為 3.3，壓力為 28 ～ 30 psi（約為 2 Pa）。根據(jù)需要也可再用超濾方法達(dá)到制劑所要求的原液蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 對 rHSA/EPO 原液中雜質(zhì)殘留量的分析

1.2.4.1 宿主蛋白殘留量分析 使用 CHO 細(xì)胞進(jìn)行 rHSA/EPO 的生產(chǎn)和制備過程中的宿主蛋白質(zhì)殘留量測定方法參照廠家提供的說明書進(jìn)行。

1.2.4.2 外源 DNA 殘留量分析 采用來自中檢院的國家標(biāo)準(zhǔn)品 CHO 細(xì)胞總 DNA，利用 Dig-DNA 標(biāo)記試劑盒來制備總 DNA 探針。rHSA/EPO 原液中殘留的外源性 DNA 經(jīng)變性為單鏈 DNA 吸附于固相膜上，在一定溫度下與相匹配的單鏈 DNA 探針標(biāo)記復(fù)性而雜交結(jié)合為雙鏈DNA，使用相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，并與已知含量的陽性 DNA 對照比對后，給出待測原液中的宿主 DNA 殘留量數(shù)值。

1.2.4.3 內(nèi)毒素殘留量測定 原液中的細(xì)菌內(nèi)毒素殘留量的檢查采用試劑盒凝膠法，鱟試劑標(biāo)定的靈敏度為 0.125 EU/ml。

1.2.5 rHSA/EPO 物理特性分析

1.2.5.1 含量測定 采用改進(jìn)型 Lowry 法以中檢院的蛋白質(zhì)含量國家標(biāo)準(zhǔn)品為參比，測定所制備的 rHSA/EPO 原液和成品蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.2 純度測定

1.2.5.2.1 SDS-PAGE 法 采用常規(guī)的 10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為 4%，上樣量 10 μg，經(jīng)考馬斯亮藍(lán) R250 染色，電泳結(jié)果用掃描儀成像，應(yīng)用分析軟件分析各條帶的百分比，計(jì)算目的蛋白含量。

1.2.5.2.2 SEC-HPLC 和 RP-HPLC 法 采用凝膠分子排阻-高效液相法（SEC-HPLC）和反相-高效液相法分別對 rHSA/EPO 純度進(jìn)行檢測。在高效液相色譜儀上樣品經(jīng)色譜柱 TSK-GEL G2000SWXL （7.8 mm × 300 mm）以 50 mmol/L PB、0.1 mol/L NaCl 緩沖液（pH 7.0）為流動相（SEC-HPLC）進(jìn)行分離；或樣品經(jīng)烷基硅烷鍵合硅膠填充柱（C-18、C-4）以 A 相（三氟乙酸-水溶液：取 1.0 ml 三氟乙酸加水至 1000 ml，充分混勻）、B 相（三氟乙酸-乙腈溶液：取 1.0 ml 三氟乙酸加乙腈至 1000 ml，充分混勻）為流動相進(jìn)行分離，在室溫條件下進(jìn)行洗脫。上樣體積為 20 μl，上樣量不低于 10 μg，檢測波長為 280 nm 和 214 nm 雙波長。以 rHSA/EPO色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于 1000。按面積歸一化法計(jì)算，rHSA/ EPO 峰面積要求不低于總面積的 95.0%。

1.2.5.3 分子量測定

1.2.5.3.1 SDS-PAGE 分子量測定 采用還原型SDS-PAGE 測定 rHSA/EPO 分子量，分離膠濃度為 10%，上樣量為 1 μg。經(jīng)考馬斯亮藍(lán) R250 染色，用掃描儀對電泳結(jié)果成像，應(yīng)用分析軟件計(jì)算已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品各條帶的相對遷移距離制作直線回歸，根據(jù)目的蛋白遷移距離帶入直線回歸方程計(jì)算出 rHSA/EPO 分子量。

1.2.5.3.2 質(zhì)譜分子量測定 由北京蛋白質(zhì)組研究中心承擔(dān)。檢測條件：N2激光源，波長 337 nm；檢測方式：正離子，線性方式（飛行管長 1.5 m，加速電壓 20 kV），基質(zhì)：SA。rHSA/EPO 經(jīng)脫糖以及未經(jīng)處理的樣品分別檢測。結(jié)果則與 rHSA/EPO氨基酸序列的理論分子量進(jìn)行比對分析。

1.2.6 rHSA/EPO 化學(xué)特性分析

1.2.6.1 N 端氨基酸序列分析 rHSA/EPO 的N 端前 15 個氨基酸序列測定由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院按 Edman 降解法進(jìn)行測定。適量 rHSA/EPO原液樣品對純水充分透析，轉(zhuǎn)移至經(jīng)預(yù)處理的PVDF 膜上，干燥后直接在蛋白質(zhì) N 端氨基酸測序儀按標(biāo)準(zhǔn)測定方法，測定 rHSA/EPO 的前 15 個氨基酸的序列。

1.2.6.2 紫外光譜測定 以 10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）為空白對照液，在常規(guī)紫外可見分光光度計(jì)上對 rHSA/EPO 原液稀釋樣品（用空白對照液稀釋至 0.1 mg/ml）進(jìn)行 450 ～ 260 nm 波長的連續(xù)掃描，測定其最大吸收峰波長。

1.2.6.3 等電點(diǎn)分析 采用常規(guī)的等電聚焦垂直板電泳法測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的等電點(diǎn)（pI）對其相應(yīng)的遷移距離作直線回歸，將 rHSA/EPO 的遷移距離代入直線回歸方程，求出待測樣品的等電點(diǎn)。

1.2.6.4 自由巰基測定 自由巰基測定采用質(zhì)譜分子量測定方法，由北京蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行測定。將經(jīng)烷基化處理封閉自由巰基和未經(jīng)處理的同一來源 rHSA/EPO 原液按 1.2.5.3.2 中描述的質(zhì)譜分子量測定方法進(jìn)行比較，每一個烷基的分子量為 57 D。

1.2.6.5 N-糖基化位點(diǎn)定位分析 rHSA/EPO原液樣品溶液 200 μl，加入 5 μl 200 mmol/L NH4HCO3調(diào)節(jié) pH 至 7.8 左右，按酶：蛋白為1∶40 加入 PNGase F 溶液，渦旋混勻后 37 ℃ 孵育 16 h。取切 N-糖后樣本 50 μl，加入 100 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）5.5 μl，混勻，56 ℃ 孵育 1 h。加入 250 mmol/L 碘乙酰胺（IAM）6.0 μl，室溫避光反應(yīng) 1 h。取還原烷基化樣品 50 μl，按酶與蛋白1∶50 加入胰蛋白酶溶液，充分混勻，37 ℃ 酶解16 h；加入 FA 至終濃度為 0.1%，終止反應(yīng)。將酶切后樣品用 0.1% FA 稀釋 10 倍，17 000 × g 離心后，取上清液裝入進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣，Nano LC-MS/MS鑒定糖位點(diǎn)，以 mgf 數(shù)據(jù)格式文件進(jìn)行 mascot蛋白質(zhì)鑒定檢索。糖蛋白定性則是使用商品化的糖蛋白染色試劑盒，按操作手冊開展。

1.2.6.6 唾液酸分析 利用酸水解方法將結(jié)合在rHSA/EPO 融合蛋白糖鏈末端上的唾液酸變成游離狀態(tài)，游離狀態(tài)的唾液酸可與間苯二酚反應(yīng)生成有色化合物，再用有機(jī)酸萃取有色化合物后，達(dá)到測定唾液酸含量的目的。方法按中國藥典三部2015 版通則 3102 開展分析。

1.2.6.7 圓二色光譜分析 遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色 CD光譜主要反映肽鍵的圓二色性，辨識蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。rHSA/EPO 的圓二色光譜測定工作由中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)研究室和北京蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心分別承擔(dān)。

1.2.6.8 肽圖分析

1.2.6.8.1 RP-HPLC 法 取 rHSA/EPO 供試品溶液（預(yù)稀釋至 1 mg/ml 的溶液），用 1% 碳酸氫銨溶液充分透析，以終濃度 0.01 mol/L DTT 在56 ℃ 還原 60 min，以終濃度 0.055 mol/L 碘乙酰胺室溫閉光烷基化 30 min，然后按 1∶50（mg/mg）加入胰蛋白酶溶液[取胰蛋白酶（序列分析純）適量，加 1% 碳酸氫銨溶液溶解，制成 0.1 mg/ml 的溶液]到供試品溶液中，在 37 ℃ 保溫 24 h 后，按 1∶10 加入 50% 醋酸溶液，10 000 r/min 離心5 min，精密量取上清液 100 μl，注入液相色譜儀，梯度洗脫流動相按 1.2.5.2.2 中的 RP-HPLC 描述進(jìn)行，記錄色譜圖。

1.2.6.8.2 肽質(zhì)量指紋譜與序列覆蓋率分析 由北京蛋白質(zhì)組研究中心使用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行檢測。取樣本 90 μg，用水稀釋至濃度為 1 μg/μl，用 200 mmol/L 碳酸氫銨溶液調(diào)節(jié) pH 至 7.5 ～ 8.0，加入 100 mmol/L DTT 使其終濃度為 10 mmol/L，混勻，56 ℃ 孵育 1 h。加入 250 mmol/L IAM 使其終濃度為 25 mmol/L，室溫避光反應(yīng) 1 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶液平均分成 3 管，一管加入 1 μg 胰蛋白酶，37 ℃ 反應(yīng) 12 h；一管加入 1 μg 金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu-C），37 ℃ 反應(yīng) 12 h；另一管加入 1 μg 糜蛋白酶，37 ℃ 反應(yīng) 3 h，反應(yīng)結(jié)束后，–20 ℃ 保存。MALDI-TOF-MS 檢測肽質(zhì)量指紋譜（PMF）分析是將酶解后樣品與基質(zhì)（CCA）按 1∶1 混勻后點(diǎn)于靶上，以反射正離子模式下檢測。Nano LC-MS/MS 分析是將酶解后樣品加入FA，使 FA 濃度為 0.1%，10 000 × g 離心后，取上清進(jìn)樣，自動采集串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)與已知 rHSA/EPO 氨基酸序列的酶切肽段分子量和串聯(lián)質(zhì)譜離子進(jìn)行比對，得到檢出覆蓋率。

1.2.7 rHSA/EPO 免疫學(xué)鑒別 純化制備的rHSA/EPO 采用免疫印跡法或免疫斑點(diǎn)法進(jìn)行兩種不同抗體的分別鑒別，人血清白蛋白特異鼠單克隆抗體和人促紅素兔抗體分別作為第一抗體；第二抗體采用羊抗鼠或羊抗兔的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，按生產(chǎn)單位操作說明書執(zhí)行。

1.2.8 rHSA/EPO 生物活性分析

1.2.8.1 UT7 細(xì)胞/MTT 體外生物活性測定法 詳細(xì)方法見文獻(xiàn)[16]。UT7 細(xì)胞測活前用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞 3 遍，在含 10% 胎牛血清（FBS）、2 mmol/L 谷氨酰胺的 IMDM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞 24 h，用 50 U/ml 青鏈霉素清洗細(xì)胞并調(diào)整為 1 × 105個/ml，待測樣品用上述培養(yǎng)基溶液稀釋，進(jìn)行 3 倍系列稀釋，每一稀釋度做 3 孔，每孔加入 50 μl，取 50 μl 細(xì)胞洗懸浮液（5 × 103個細(xì)胞）加入各孔中，置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 45 ～48 h，每孔加入 20 μl MTT 試劑，繼續(xù)培養(yǎng) 3 ～6 h，離心棄上清；每孔加入 100 μl 裂解液（由鹽酸 14 ml、Triton X-100 溶液 50 ml，加異丙醇至500 ml 制成），混勻后，放入酶標(biāo)儀，以 630 nm 為參比波長，于波長 579 nm 測定吸光度值。

1.2.8.2 小鼠體內(nèi)生物活性測定法 rHSA/EPO原液或者成品的小鼠體內(nèi)生物活性測定時應(yīng)稀釋成低、中、高 3 個劑量（建議采用 30、60 和120 ng 或它們的相近值。即如果小鼠的給藥體積確定為 0.4 ml 時，則在 0.4 ml 中應(yīng)該分別含有 30、60 或 120 ng 的 rhHSA/EPO）作為供試品。具體方法按中國藥典 2015 版三部小鼠體內(nèi)生物活性測定法網(wǎng)織紅細(xì)胞法開展[17]。

圖 1 重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（rHSA/EPO）成熟肽氨基酸序列（下劃線標(biāo)示 hEPO 的成熟肽氨基酸序列）Figure 1 The amino acid sequences of mature peptide of recombinant human serum albumin/erythropoietin fusion protein (rHSA/EPO) (The underline shows the amino acid sequence of hEPO mature peptide)

2 結(jié)果

2.1 高效表達(dá) rHSA/EPO 的 CHO 細(xì)胞基因工程株的構(gòu)建

構(gòu)建的 CHO 細(xì)胞工程株可表達(dá)分泌完整的rHSA/EPO 成熟肽蛋白質(zhì)。其理論氨基酸序列見圖 1，具有 751 個氨基酸。rHSA/EPO 的理論計(jì)算分子量為 84849.52 D，等電點(diǎn)（pI）6.137；共有19 個二硫鍵，分別為 53-62，75-91，90-101，124-169，168-177，200-246，245-253，265-279，278-289，316-361，360-369，392-438，437-448，461-477，476-487，514-559，558-567，592-627 （7 hEPO161），614-618（29 hEPO33）。HSA 的第34 個半胱氨酸（C）為一個游離的自由巰基。N-糖基化位點(diǎn)分別為：609（24 hEPO）、623（38 hEPO）和 668（83 hEPO）。在位點(diǎn) 711（126 hEPO）有1 個氧連接 O-糖鏈結(jié)構(gòu)存在。

2.2 rHSA/EPO 規(guī)?；療o血清懸浮培養(yǎng)批次生產(chǎn)方法

對表達(dá) rHSA/EPO 的 CHO 細(xì)胞工程株進(jìn)行主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫的建立和檢定使之符合國家對生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞庫的要求。CHO 細(xì)胞工程株使用不同規(guī)模不同原理的生物反應(yīng)器系統(tǒng)（Wave 或一次性的生物反應(yīng)器）進(jìn)行生產(chǎn)的工藝都不會顯著影響 rHSA/EPO 的理化特性。融合蛋白直接分泌到 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液為無血清組分，無動物源蛋白質(zhì)和無抗生素添加的合成培養(yǎng)液。取不同時間的上清液 30 μl 進(jìn)行非還原的SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，10 ～ 14 d 時細(xì)胞上清液中總蛋白（約為 0.5 g/L）中的 80% 是 rHSA/EPO單體目的產(chǎn)物。從不同時間的表達(dá)結(jié)果（圖 2）可以看出，隨著時間的延長，細(xì)胞分泌的目的蛋白獲得積累，增加上清液中的融合蛋白含量。同時，觀察表明目的蛋白表達(dá)產(chǎn)物（rHSA/EPO）也還是有被降解和形成聚合體的現(xiàn)象存在。融合蛋白的降解物存在，會對目的蛋白的分離純化有直接影響。因?yàn)槟康牡鞍捉到馕锸呛湍康牡鞍拙哂邢嗤碾亩危H和層析介質(zhì)和疏水介質(zhì)（HIC）在特異結(jié)合目的蛋白時會受到競爭性結(jié)合影響。為此，雖然延長生長時間，單位產(chǎn)量會有顯著的增加，但是可能會為下游的純化帶來困難，因此限定在罐培養(yǎng)時間是有必要的。經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)將細(xì)胞和上清液分開，上清液可進(jìn)入融合蛋白的分離純化階段?？梢源_定CHO 細(xì)胞工程的 rHSA/EPO 表達(dá)水平不低于500 mg/L。規(guī)?；a(chǎn)工藝可線性放大，無血清培養(yǎng)基組分簡單、成本低廉，可滿足今后產(chǎn)業(yè)化的要求。

2.3 rHSA/EPO 的分離純化

融合蛋白從 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)不同介質(zhì)填料逐步富集和分離純化達(dá)到精純的目的。獲得的 rHSA/EPO 原液，按改進(jìn)型 Lowry 法測定，蛋白質(zhì)含量在 2 mg/ml 左右。制備的 rHSA/EPO 原液符合生物制品要求的純度，可以作為“注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白”的原料藥（原液），并用于藥學(xué)研究、制劑配方篩選以及臨床前動物實(shí)驗(yàn)的研究起始材料。

2.4 對 rHSA/EPO 原液中雜質(zhì)殘留量的分析

2.4.1 宿主蛋白殘留量分析 采用商品試劑盒檢測了 rHSA/EPO 原液中的 CHO 細(xì)胞宿主蛋白殘留量，結(jié)果表明原液中的宿主蛋白含量在 0.05%以下，測定的回收率在 70% ～ 130% 之間，符合國家對注射用重組蛋白質(zhì)藥物中宿主蛋白殘留量限定的要求。

2.4.2 外源 DNA 殘留量分析 采用來自中檢院的國家標(biāo)準(zhǔn)品 CHO 細(xì)胞總 DNA，利用 Dig-DNA標(biāo)記試劑盒來制備 CHO 細(xì)胞總 DNA 探針。檢測結(jié)果表明 rHSA/EPO 原液中融合蛋白的 CHO 細(xì)胞外源性 DNA 殘留量小于 10 pg/mg，符合臨床使用劑量小于 10 ng/人次的標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.3 內(nèi)毒素殘留量測定 原液中的細(xì)菌內(nèi)毒素殘留量的檢查采用鱟試劑標(biāo)定試劑盒凝膠法，結(jié)果表明原液中的內(nèi)毒素殘留量不高于 0.125 IU/mg，符合注射用藥的要求。

圖 2 重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（rHSA/EPO）CHO 細(xì)胞工程株在 120 L 生物反應(yīng)器中以無血清培養(yǎng)基、懸浮和批次生產(chǎn)時在不同時間的 SDS-PAGE 電泳圖譜Figure 2 The rHSA/EPO expressed from a genetically engineered CHO cell strain in a 120 L bio-reactor with chemical culture medium, suspension and batched condition in different culture period

2.5 rHSA/EPO 的物理特性分析

2.5.1 含量測定 采用改進(jìn)型 Lowry 法蛋白質(zhì)含量測定 rHSA/EPO 原液和成品的蛋白質(zhì)含量，符合要求，制備的原液的蛋白質(zhì)含量約在 1.5 mg/ml，可以直接用于配制臨床試驗(yàn)用藥規(guī)格的凍干粉針劑（300 μg/0.5 ml/支）。如果有需要，精純的rHSA/EPO 還可通過超濾獲得高蛋白含量的原液。

2.5.2 純度測定

2.5.2.1 SDS-PAGE 法 采用常規(guī)的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為 10%，上樣量10 μg（考馬斯亮藍(lán) R250 染色或者銀染上樣量5 μg），rHSA/EPO 原液蛋白質(zhì)在還原和非還原條件下電泳，掃描后經(jīng)分析軟件計(jì)算，結(jié)果顯示分離純化的 rHSA/EPO 電泳純度達(dá) 99%。

2.5.2.2 SEC-HPLC 和 RP-HPLC 法 采用凝膠分子排阻高效液相法（SEC-HPLC）分析的結(jié)果見圖 3A；經(jīng)對圖 3A 中的峰 1 和峰 2 組分SDS-PAGE 分析和銀染結(jié)果見圖 3B。反相高效液相法分別對 rHSA/EPO 純度進(jìn)行檢測，在波長280 nm 和 214 nm 記錄結(jié)果顯示均為單一峰，峰面積不低于總面積的 98%。rHSA/EPO 原液經(jīng)反相高效液相檢測顯示，在原液中幾乎沒有單體 EPO分子和單體 HSA 分子的存在。而以 SEC-HPLC 分析，還是可以看到以聚合體形式存在的 rHSA/EPO，但聚合體含量也確定小于 5%，而且沒有融合蛋白的降解片段檢出。

2.5.3 分子量

2.5.3.1 SDS-PAGE 分子量 rHSA/EPO 的分子量測定采用 SDS-PAGE 方法，在還原條件下以已知蛋白質(zhì)分子量為參照物進(jìn)行直線回歸方程計(jì)算，分子量測定結(jié)果為（100 ± 10）kD。

圖3 融合蛋白純化后的聚合體分析（A：SEC-HPLC 圖譜；B：A 中的峰 1 和峰 2 組分 SDS-PAGE 分析和銀染結(jié)果）Figure 3 The polymer analysis for the purification of rHSA/EPO sample (A: SEC-HPLC fingerprint; B:SDS-PAGE analysis with silver stain of the isolatedcomponts peak 1 and peak 2)

2.5.3.2 質(zhì)譜分子量 對 rHSA/EPO 理化對照品用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，結(jié)果為寬峰，是典型的糖蛋白質(zhì)譜峰，分子量為 93631.2 D 左右。rHSA/EPO 經(jīng)脫糖后再用質(zhì)譜測定的分子量為 85205.0 D。經(jīng)過深度去糖處理后測定的質(zhì)譜分子量為 84788.4 D，與 rHSA/EPO的理論分子量 84849.52 D 值相近。

2.6 rHSA/EPO 的化學(xué)特性分析

2.6.1 N 端氨基酸序列分析 rHSA/EPO 的 N端前 15 個氨基酸序列測定由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院按 Edman 降解法進(jìn)行測定。rHSA/EPO 的N 端氨基酸序列測定的結(jié)果為：Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly-(D-A -H-K-S-E-V-A-H-R-F-K-D-L-G-)，與 rHSA/EPO 氨基酸理論序列前 15 個氨基酸的序列相符。對不同批次制備的 rHSA/EPO 原液，進(jìn)行的 N 端氨基酸序列測定都獲得相同的結(jié)果。

2.6.2 紫外光譜測定 以 10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）為空白對照液，在紫外分光光度計(jì)上對 rHSA/EPO 原液稀釋樣品（用空白對照液稀釋至 0.1 mg/ml）進(jìn)行 450 ～ 260 nm 波長的連續(xù)掃描，測定的最大吸收峰波長結(jié)果為（277 ± 3）nm，呈典型蛋白質(zhì)紫外吸收峰。

2.6.3 等電點(diǎn)分析 等電聚焦垂直板電泳法測定結(jié)果表明 rHSA/EPO 的等電點(diǎn)值為 pI = 4.9，與理論值（pI 6.137）有一定差異（圖 4）。rHSA/EPO 原液中的電荷異構(gòu)體分析采用毛細(xì)管 cIEF-WCID法，獲得的圖譜見圖 5，電荷異構(gòu)體分布峰面積見表 1。所有 rHSA/EPO 各電荷異構(gòu)體的等電點(diǎn)處于pI 5.18 ～ 5.83 之間，與理論值 pI 6.137 比較接近。

2.6.4 自由巰基測定 rHSA/EPO 經(jīng)去 N 糖后，烷基化前和烷基化后，即在封閉和不封閉條件下測試的質(zhì)譜分子量分別為 85203.0 D 和 85295.5 D，兩者之差為 92.5 D，計(jì)算 92.5 D/57 D = 1.6，表明rHSA/EPO 中含有約 1.6 個自由巰基。理論氨基酸序列中 rHSA/EPO 含有 1 個自由巰基（半胱氨酸 C）位于第 34 位。因此測定值與理論值一致。在對不同批次生產(chǎn)制備的 rHSA/EPO 原液開展的自由巰基測定工作獲得了相近的結(jié)果。

圖4 不同批次 rHSA/EPO 原液的等電聚焦電泳結(jié)果Figure 4 Isoelectric focusing (IEF) of rHSA/EPO fusion proteins with different lots

圖5 rHSA/EPO 原液（批號：1882Y20150101）等電點(diǎn)（電荷異構(gòu)體）毛細(xì)管電泳分析結(jié)果Figure 5 Analysis of the cIEF-WCID (electro-charge isomers) for rHSA/EPO by capillary electrophoresis

表 1 rHSA/EPO 的 cIEF-WCID 等電點(diǎn)檢測結(jié)果Table 1 Analysis results of the cIEF-WCID (electro-charge isomers) for rHSA/EPO by capillary electrophoresis

2.6.5 糖基化位點(diǎn)分析 通過對 rHSA/EPO 原液樣品先還原烷基化后進(jìn)行適當(dāng)酶切，所得糖肽采用 PNGase F 切糖，天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?，使肽段質(zhì)量增加 0.984 D 的方法，Nano LC-MS/MS測定切糖后的肽段序列，以 mgf 數(shù)據(jù)格式文件進(jìn)行 mascot 蛋白鑒定檢索，從而確定了 rHSA/EPO 的 N-糖基化修飾位點(diǎn)分別為 N609、N623、N668，與理論一致。另外使用糖基化蛋白質(zhì)染色試劑盒檢測，也確定 rHSA/EPO 是 1 個糖基化蛋白。

2.6.6 唾液酸分析 酸水解結(jié)果表明 rHSA/EPO的唾液酸含量在 9.5 ～ 11 mol。CHO 細(xì)胞表達(dá)的rhEPO 原液的唾液酸含量一般在 10 ～ 13 mol?？紤]到 CHO 細(xì)胞修飾糖基化蛋白質(zhì)時，唾液酸分子僅僅是在糖鏈修飾完整的情況下，才能在糖鏈最外端發(fā)生修飾，連接上唾液酸；再考慮到融合蛋白的分子量要遠(yuǎn)大于 rhEPO 分子量，由于空間位阻效應(yīng)，這也會對唾液酸含量的檢測和計(jì)算上有一定的影響，因此可以判定處于融合蛋白中的 EPO 蛋白多肽分子的糖基化程度與重組人促紅素在 CHO細(xì)胞表達(dá)狀況下是幾乎相同，糖鏈?zhǔn)谦@得了完全修飾。

2.6.7 圓二色光譜分析應(yīng)用 利用紫外圓二色光譜儀分別對 rHSA/EPO、rhEPO、pHSA 和 rHSA蛋白質(zhì)溶液開展了遠(yuǎn)紫外光譜分析測定，對所獲得的光譜曲線分別進(jìn)行疊加分析比較。圖 6 中rHSA/EPO、rHSA、rhEPO 和 pHSA 分子間圓二色光譜疊加結(jié)果顯示圖形相似度非常高，表明在融合蛋白中的人血清白蛋白和人促紅素的各自空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。rHSA/EPO 二級結(jié)構(gòu)中的 α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角及隨機(jī)蜷曲的比例見表 2。中國科學(xué)院過程工程研究所和北京蛋白質(zhì)組研究中心分別開展的rHSA/EPO 的圓二色圖譜分析獲得的結(jié)果是一致的。

表 2 重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白二級結(jié)構(gòu)比例表Table 2 Scale table of the second structure of the fusion protein, rHSA/EPO

2.6.8 肽圖

2.6.8.1 RP-HPLC 法 rHSA/EPO 蛋白質(zhì)溶液經(jīng)變性和烷基化后，胰蛋白酶水解獲得清楚可分辨的 RP-HPLC 肽圖譜。不同時間制備的 2 個批次rHSA/EPO 原液樣品的肽圖譜在疊加后顯示出絕大部分的肽圖峰形相似，可用于 rHSA/EPO 的原液批次質(zhì)量質(zhì)檢指標(biāo)之一（圖 7）。

圖 6 對 rHSA/EPO 蛋白質(zhì)紫外圓二色疊加圖譜分析[紫色：pHSA（血源人血清白蛋白）；綠色：rHSA（酵母菌）；紅色：rHSA/EPO（CHO 細(xì)胞）；藍(lán)色：rhEPO（CHO 細(xì)胞）]Figure 6 Protein UV-circular dichroism spectra (CD) analysis of rHSA/EPO (Purple: pHSA isolated from human plasma; Green: rHSA expressed from yeast; Red: rHSA/EPO expressed from CHO cells; Blue: rhEPO expressed from CHO cells)

2.6.8.2 肽質(zhì)量指紋與序列覆蓋率 經(jīng) MALDI-TOF-MS PMF 方法檢測的結(jié)果表明，重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（批號：1882Y20150101）經(jīng)胰蛋白酶單獨(dú)酶解時，序列覆蓋率為 86%；Glu-C 單獨(dú)酶解序列覆蓋率為 83%；糜蛋白酶單獨(dú)酶解時，序列覆蓋率為 70%，合計(jì)序列覆蓋率為 99.9%。經(jīng) Nano LC-MS/MS 的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索結(jié)果則為胰蛋白酶酶解時，檢索得分42193，序列覆蓋率 51%；Glu-C 酶解時，檢索得分 12845，序列覆蓋率 43%；糜蛋白酶酶解時，檢索得分 11680，序列覆蓋率 65%。合計(jì)序列覆蓋率為 79.4%。經(jīng) Nano LC-MS/MS 的一級譜數(shù)據(jù)檢索結(jié)果表明，胰蛋白酶酶解時，覆蓋率為 78%；Glu-C酶解時，覆蓋率為 64%；糜蛋白酶酶解時，氨基酸序列匹配的覆蓋率為 96%；合計(jì)序列覆蓋率：99.9%（圖 1 下劃線部分）。當(dāng) rHSA/EPO 樣品經(jīng)切糖后還原烷基化處理，采用三種酶解（胰蛋白酶、Glu-C、糜蛋白酶）和兩種檢測方式（MALDI-TOF/TOF 和 Nano LC-MS/MS），檢出的氨基酸序列總覆蓋率為 100%。

2.7 rHSA/EPO 免疫學(xué)鑒別

rHSA/EPO 是由兩個蛋白質(zhì)分子融合組成的，通過免疫印跡試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，特異識別人血清白蛋白的單克隆抗體與 rHSA/EPO 有特異的免疫學(xué)反應(yīng)，也與作為陽性對照品的畢赤酵母菌表達(dá)的重組 HSA（rHSA）有免疫反應(yīng)，但不與陰性對照品人促紅素（rhEPO）有免疫反應(yīng)（圖 8A）；特異識別人促紅素抗體則與 rHSA/EPO 和陽性對照品重組人促紅素（rhEPO）有免疫特異反應(yīng)，但不與陰性對照品 rHSA 有特異反應(yīng)（圖 8B）。免疫斑點(diǎn)法可以獲得相同的鑒別結(jié)果。

圖 7 在還原/烷基化條件下獲得的不同批次制備的 rHSA/EPO 融合蛋白的 RP-HPLC 肽圖（上：批號為 1882Y20150101；下：批號為 1882Y20150202）Figure 7 The enzymatic peptide maps from different lots of rHSA/EPO preparation under RP-HPLC chromatography (Upper: 1882Y20150101; Down: 1882Y20150202)

圖 8 rHSA/EPO 的免疫印跡鑒別試驗(yàn)（A：人促紅素兔抗體；B：人血清白蛋白單克隆抗體）Figure 8 The Western blot results are from different first antibodies, rabbit-multi-clonal antibody against human erythropoietin (A) and mouse monoclonal antibody against human serum albumin (B)

2.8 rHSA/EPO 生物活性分析

UT7 細(xì)胞/MMT 體外細(xì)胞學(xué)生物活性測定結(jié)果顯示，rHSA/EPO 在一定范圍內(nèi)顯示了劑量依賴性，但其比活性值要低 4 倍，并不與小鼠體內(nèi)生物活性（網(wǎng)織紅細(xì)胞 Ret%）的測定結(jié)果相近。結(jié)果顯示，rHSA/EPO 在 15 ～ 125 ng 劑量范圍內(nèi)的小鼠生物比活性值穩(wěn)定和可重復(fù)，生物比活性值不低于 0.9 × 105IU/mg，生物比活性值的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可規(guī)定為 0.7 × 105IU/mg。中國藥典中rhEPO 的小鼠體內(nèi)生物比活性值規(guī)定為不低于1.0 × 105IU/mg[17]。rHSA/EPO 和 rhEPO 的分子量比為 100 kD∶34 kD ≈ 3∶1。由此計(jì)算可得，在分子等摩爾時（3 mg 融合蛋白中約有 1 mg 的 EPO），兩者的生物活性差異不大。

3 討論

利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的 CHO 細(xì)胞工程株，由貼壁細(xì)胞馴化為可懸浮培養(yǎng)生長的細(xì)胞。該細(xì)胞株可穩(wěn)定高效表達(dá)和分泌 1 個全新分子結(jié)構(gòu)、可溶性的重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（rHSA/EPO）。重組CHO 細(xì)胞工程株制備成原始細(xì)胞庫，經(jīng)連續(xù) 60 個代次的傳代，目的蛋白表達(dá)水平穩(wěn)定，并用于制備主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫。工作細(xì)胞庫用于生產(chǎn)符合制藥要求的 rHSA/EPO 原料藥（原液）。經(jīng)過認(rèn)真和長時間的仔細(xì)研究，建立了可規(guī)?；氖褂脽o血清培養(yǎng)液，懸浮批次培養(yǎng)生產(chǎn)工藝和獨(dú)創(chuàng)的純化工藝制備 rHSA/EPO 原液。該融合蛋白的理化特性研究也為今后的長效“注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋”創(chuàng)新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、檢定技術(shù)和方法學(xué)驗(yàn)證，為成品的生產(chǎn)都提供了全面的生產(chǎn)制備工藝和質(zhì)量檢控技術(shù)指導(dǎo)。獲得的 rHSA/EPO 原液滿足用于臨床目的的注射用凍干粉針劑生產(chǎn)的要求。

rhEPO 在大腸桿菌中可表達(dá)為一個非糖基化的蛋白質(zhì)[18]，但是非糖基化 EPO，其體內(nèi)生物活性則大大降低，作者將人血清白蛋白與 EPO 直接連接后在酵母菌中獲得表達(dá)，顯示出融合蛋白rHSA/EPO(酵母菌)的體內(nèi)生物活性沒有顯著下降，半衰期顯著延長[9-10]。但是考慮到 rhEPO 作為一個糖基化程度極高的藥物已經(jīng)上市多年，積累了極為詳盡的藥物代謝，也清楚依賴于其糖基化的特殊結(jié)構(gòu)，才能在臨床上具有顯著的療效，而白蛋白長效化的非糖基化 EPO 蛋白質(zhì)藥物是否具有與rhEPO 相似的臨床療效和安全性，是需要大量研究數(shù)據(jù)探索的。為此，作者也構(gòu)建了相同的rHSA/EPO 融合蛋白藥物分子結(jié)構(gòu)（沒有連接肽存在），能夠高效表達(dá)的 CHO 細(xì)胞工程株。同時采用了無血液來源組分、無抗生素、無動物源蛋白質(zhì)添加的人工合成配制的無血清培養(yǎng)基，采用懸浮、批次、規(guī)?；a(chǎn)工藝制備 rHSA/EPO，并開展了詳盡的理化特性分析。研究分析結(jié)果表明，在人血清白蛋白和促紅素兩個大分子蛋白質(zhì)之間不設(shè)有連接肽完全可行，作為藥物臨床使用為目標(biāo)的情況下，屬于更優(yōu)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。

通過規(guī)范的藥效學(xué)、安全藥理、毒理學(xué)、藥代動力學(xué)研究等全面的動物安全評價工作，完成了“注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白”新藥的臨床前研究工作，所提交申報(bào)的項(xiàng)目符合國家鼓勵和支持的“綠色用藥”方向。預(yù)計(jì)新藥的最終臨床使用劑量為 150 ～ 600 μg/次，每 2 周使用 1 次。有望將常規(guī) rhEPO 的每 2 周用藥頻率共 6 針，減為 rHSA/EPO的 1 針。當(dāng)然，新藥 rHSA/EPO的最終臨床使用劑量和用藥間隔（頻率）還需要臨床研究來確定?？傊?，本課題研發(fā)的新藥，有可能使患者的用藥量下降，注射次數(shù)下降，特別是在控制給藥后患者的紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白含量指數(shù)上，顯示出新藥可為患者帶來更優(yōu)的升紅治療和預(yù)防的療效，以及更好的治療依從度。創(chuàng)新藥生產(chǎn)成本較現(xiàn)有的同類產(chǎn)品更低，也將會給患者和醫(yī)療保險系統(tǒng)帶來優(yōu)惠，具有很好的社會和經(jīng)濟(jì)效益。

志謝北京清大天一生物技術(shù)有限公司劉華杰；中國科學(xué)院過程工程研究所劉瑞娜以及部分曾階段性參加過本課題研究工作的員工。

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Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):6-18

·協(xié)會之窗·

中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會當(dāng)選藥品安全合作聯(lián)盟副理事長單位

2017 年 1 月 19 日，藥品安全合作聯(lián)盟（以下簡稱“聯(lián)盟”）第二次全體會議和第二屆第一次理事會暨理事長辦公會擴(kuò)大會在京召開。會議審議通過聯(lián)盟第一屆理事會工作報(bào)告和財(cái)務(wù)報(bào)告。經(jīng)選舉，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會（以下簡稱“我會”）當(dāng)選聯(lián)盟第二屆理事會副理事長單位，我會李少麗副理事長當(dāng)選聯(lián)盟第二屆理事會理事長。我會今后在繼續(xù)做好本領(lǐng)域工作的同時，多參與聯(lián)盟的工作，承擔(dān)聯(lián)盟的任務(wù)。圍繞聯(lián)盟宗旨、結(jié)合協(xié)會職能，大力開展科普宣傳，為藥品安全和用藥安全多做貢獻(xiàn)。

藥品安全合作聯(lián)盟成立于 2012 年 11 月 28 日，由中國非處方藥物協(xié)會、中國藥學(xué)會、中國外商投資企業(yè)協(xié)會等12 家行業(yè)協(xié)會和單位共同發(fā)起成立。經(jīng)過四年發(fā)展，目前聯(lián)盟已有 25 家成員單位，下設(shè) 5 個專業(yè)委員會，在湖北、上海、廣東、北京建立了 4 個區(qū)域工作站，并于 2016 年成立了北京藥盾公益基金會。

Expression, preparation and characterization studies of a recombinant human serum albumin/erythropoietin fusion protein with novel molecular structure and long acting bio-better function

FU Yan, YANG Xiao-nan, WEI Kai-hua, FU Yu-song, YUN Wen-qi, ZHENG Bo-wei, LIU Dan, YU Zai-lin

ObjectiveStudies on the compliance of recombinant human serum albumin/erythropoietin fusion protein (rHSA/EPO) manufacture process and on the physicochemical properties and propose as basis and technical indicators of quality as a long acting, bio-better innovative protein drug.MethodsrHSA/EPO with long-acting and bio-better function was stably expressed in CHO cell line which constructed by genetically engineering technology. A manufacture process was established in a batch scale, suspension and growth in a serum-free medium. Then it was analyzed of the preparation process, detailed physicochemical properties and characteristics of technical quality indicators as a novel drug.ResultsThe purity of rHSA/EPO protein reached more than 97%. Products of rHSA/EPO digested by 3 different binding sites of protease separately and was analyzed with peptide mass fingerprint by MALDI-TOF/TOF PMF and Nano LC-MS/MS with the overall amino acid sequence coverage of 100%. N-terminal amino acid sequence of the first 15 amino acids is identical to the theoretical sequence. The glycosylation sites of rHSA/EPO was positioned with its molecular weight (MW) in mass spectrometry as 93 kD, but the MW of the fusion protein without sugars was 84205 D similar with the theoretical MW of 84849.52 D. The fusion protein contained 1 free sulfhydryl groups, which indicated that there existed only 1 free cysteine in the structure. HSA and EPO on their two space conformation unchanged after a round of two color spectrum analysis. A plurality of charge isomers were in the range of pI 5.1 - 5.8 by a capillary electrophoresis with isoelectric focusing obtained (pI) as about pI 4.9. A typical protein spectrum wasobtained by purple spectra. Residues of bacterial endotoxin, host protein, exogenous DNA were in line with the requirements of the regulations as drug raw materials. Immunological identification was positive with rhEPO which also expressed in CHO cells. Biological activity were determination with UT7 cells in vitro and with mice in vivo, but the activity were different. The in vivo and in vitro bioassay method was used for different experimental purposes, and each also had a certain correlation coefficient.ConclusionThe more comprehensive pharmacy data are obtained through studying on the physicochemical properties of the fusion protein. The results can be used as the guidance of the manufacture "Recombinant human serum albumin/erythropoietin fusion protein for injection" (CHO cells) on raw material medicine and preparation and show that the newly created molecular structure of rHSA/EPO (without a linker in between) is comply with the requirements as a bio-better novel protein drug.

Albumins; Erythropoietin; CHO cells; Recombinant fusion proteins

s:YU Zai-lin, Email: yuzailin88@sina.com; WEI Kai-hua, Email: wkh2006@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.003

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2009ZX09103-706）；天津市科學(xué)技術(shù)委員會科技支撐計(jì)劃（11ZCKFSY00200）

300457 天津溥瀛生物技術(shù)有限公司（富巖、楊小楠、富俞淞、云文琦、鄭博崴、于在林）；100026 北京，中美福源生物技術(shù)（北京）股份有限公司（富巖、楊小楠、富俞淞、于在林）；102206 北京，北京蛋白質(zhì)組研究中心/蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心（魏開華、劉丹）

于在林，Email：yuzailin88@sina.com；魏開華，Email：wkh2006@126.com

2016-12-02

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(1):6-18

Author Affiliations:Tianjin SinoBiotech Ltd., Tianjin 300457, China (FU Yan, YANG Xiao-nan, FU Yu-song, YUN Wen-qi, ZHENG Bo-wei, YU Zai-lin); FortuneRock (China) Co., Ltd. Beijing 100026, China (FU Yan, YANG Xiao-nan, FU Yu-song, YU Zai-lin); Beijing Proteome Research Center, National Engineering Research Center for Protein Drugs, Beijing 102206, China (WEI Kai-hua, LIU Dan)