陳夢(mèng)楠 盧海龍 李雷 楊榮禮

體外高糖環(huán)境對(duì)H9c2心肌細(xì)胞中STIM1、Orai1及TRPC1的影響

陳夢(mèng)楠 盧海龍 李雷 楊榮禮

目的 構(gòu)建體外高糖誘導(dǎo)的心肌損傷模型,觀察體外高糖環(huán)境對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的增殖以及基質(zhì)作用分子1(STIM1)、Orai1和瞬時(shí)受體電位通道1(TRPC1)表達(dá)的影響。 方法 體外培養(yǎng)鼠胚H9c2心肌細(xì)胞,隨機(jī)分為4組,正常對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高滲組(27.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(33 mmol/L葡萄糖),藥物組(2 μmol/L SKF96365+33 mmol/L葡萄糖)。培養(yǎng)72 h。采用CCK8技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖率;采用RT-PCR以及Western blotting技術(shù)測(cè)定4組STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果 正常對(duì)照組和高滲組STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);高糖組STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組增加(P均<0.05);藥物組的表達(dá)量較正常對(duì)照組高(P均<0.05),較高糖組下降(P均<0.05)。 結(jié)論 體外高糖在一定程度上抑制心肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)STIM1、Orai1及TRPC1蛋白的表達(dá),這可能是體外高糖環(huán)境下H9c2心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

糖尿病心肌病; 高糖; 基質(zhì)作用分子1; Orai1; 瞬時(shí)受體電位通道1

糖尿病已經(jīng)成為影響全球的重大公共健康問(wèn)題,據(jù)美國(guó)疾控中心數(shù)據(jù)表明,全球糖尿病病人已達(dá)到2.4億人,預(yù)計(jì)至2030年患病人數(shù)將達(dá)到4.39億[1]。我國(guó)已成為世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國(guó)家[2-3]。作為糖尿病最常見(jiàn)的心血管并發(fā)癥之一的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM),已成為1型或2型糖尿病病人死亡的主要因素。迄今為止,DCM的發(fā)病機(jī)制仍不明確,并且治療未有實(shí)質(zhì)性突破。研究發(fā)現(xiàn)DCM的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)[4],鈣庫(kù)操縱性鈣通道(store-operated channels, SOCs)主要由基質(zhì)交感分子 (stromal interaction molecule, STIM)1、Orai1、經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道1(transient receptor potential canonical 1, TRPC 1)3種蛋白組成,是細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入的主要途徑之一。高血糖毒性是損害心臟及血管的主要因素,對(duì)于高血糖對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載是否有促進(jìn)作用以及其可能機(jī)制的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究以體外培養(yǎng)的鼠胚心肌細(xì)胞H9c2為研究對(duì)象,觀察體外高糖對(duì)細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響,選用鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流(store-operated ca2+entry, SOCE)通道非特異性阻滯劑SKF96365,抑制SOCE,探討DCM的可能機(jī)制,以期為臨床DCM的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 鼠胚心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。胎牛血清(FBS)(中國(guó)四季青公司),DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司),D-葡萄糖(美國(guó)Gibco公司),細(xì)胞計(jì)數(shù)盒CCK-8(日本同仁公司),細(xì)胞總RNA提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒、RNA marker(上海生物工程有限公司),STIM1、Orai1、TRPC1以及β-Actin引物(中國(guó)金唯智公司),PCR試劑(中國(guó)Vicmed公司),STIM1(66189-1-Ig)、Orai1(13130-1-AP)及TRPC1(19482-1-AP)一抗(美國(guó)proteintech公司),SDS-PAGE凝膠配置試劑、BCA試劑盒(上海碧云天公司),SKF96365(以色列Alomone Labs公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 用含有10% FBS的低糖(5.5 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞。至細(xì)胞鋪滿(mǎn)85%左右培養(yǎng)面積后,0.25%胰酶消化,1:2傳代,8～9代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,以相應(yīng)的細(xì)胞密度,分別接種于96孔板、6孔板及培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h;待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)后,換為無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞成靜止?fàn)顟B(tài)后隨機(jī)分成相應(yīng)組別。

1.3 心肌細(xì)胞存活率檢測(cè) 接種于96孔板的細(xì)胞隨機(jī)分為5組,其中葡萄糖濃度依次為5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、33 mmol/L、44 mmol/L,分別于培養(yǎng)1 d、2 d、3 d和4 d后每孔加入10 μl的 CCK-8和90 μl的DMEM,在37 ℃、5%CO2條件下孵育1 h,酶標(biāo)儀(λ=450 nm)檢測(cè)吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(處理組A值-空白孔A值)/(對(duì)照組A值-空白孔A值)×100%,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以未加細(xì)胞懸液的DMEM培養(yǎng)液為空白孔,5.5 mmol/L葡萄糖組為對(duì)照組。對(duì)照組心肌細(xì)胞存活率定義為100%。結(jié)果提示在33 mmol/L葡萄糖作用3 d后,細(xì)胞存活率僅為(51.67±4.73)%,顯著下降,在超過(guò)此濃度及時(shí)間條件下細(xì)胞存活率極低,因此選用33 mmol/L的濃度和3 d時(shí)間作為高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型的條件。見(jiàn)表1，圖1。

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分組為:正常對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高滲組(27.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(33 mmol/L葡萄糖),藥物組(2 μmol/L SKF96365+33 mmol/L葡萄糖)(阻滯劑濃度由前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定)。

表1 不同濃度葡萄糖處理不同時(shí)間細(xì)胞增值率比較,%, n=3)

注:各組間比較,P均<0.05

圖1 不同濃度葡萄糖處理不同時(shí)間對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的影響(n=3,P均<0.05)

1.4RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞mRNA的表達(dá) 接種于6孔板的正常對(duì)照組、高滲組、高糖組、藥物組細(xì)胞于3d時(shí)提取細(xì)胞總RNA(由上步實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定葡萄糖濃度和時(shí)間點(diǎn)),并測(cè)定RNA濃度并配平。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。STIM1引物序列:上游:5’-TCTGAAGAGTCTACCGAAGC-3’,下游:5’-AGGTCCTCCACGCTGATA-3’;Orai1引物序列:上游:5’-GCCAGAGTTACTCCGAGGTGA-3’,下游:5’-ATGAGGGCGAACAGGTGC-3’;TRPC1引物序列:上游:5’-GCTGTGGTATGAAGGGTT-3’,下游:5’-AAGAAGAGCCGAAGGTAA-3’。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5min、94 ℃變性30s、55 ℃退火30s、72 ℃延伸30s、72 ℃徹底延伸7min,基因擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)分別為:β-actin24個(gè)、STIM1和TRPC1 33個(gè)、Orai1 28個(gè)。待擴(kuò)增之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,SyngeneG:BOX凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。以β-actin(上游:5’-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3’,下游5’-TGCCACAGGATTCCATACC-3’)為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Westernblotting檢測(cè)心肌細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 接種于培養(yǎng)皿中的正常對(duì)照組、高滲組、高糖組、藥物組細(xì)胞于3d時(shí)提取細(xì)胞總蛋白,檢測(cè)濃度后配平,采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)STIM1(1∶1000)、Orai1(1∶1000)及TRPC1(1∶1000)蛋白的表達(dá)水平。詳細(xì)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。以β-actin(66009-1-Ig,美國(guó)proteintech公司)為內(nèi)參照。采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 在培養(yǎng)至3 d后,正常對(duì)照組和高滲組STIM1、Orai1、TRPC1的mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。高糖組STIM1、Orai1、TRPC1的mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組均增加(P均<0.05),加入阻滯劑后其表達(dá)量較高糖組下降,但尚未達(dá)到正常水平(P均<0.05);見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組mRNA表達(dá)結(jié)果

注:以β-actin為內(nèi)參照;與正常對(duì)照組比較, *P<0.05;與高糖組相比,P<0.05圖3 各組mRNA相對(duì)表達(dá)水平

2.2 各組心肌細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 在培養(yǎng)3 d后,正常對(duì)照組和高滲組STIM1、Orai1、TRPC1的蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。高糖組STIM1、Orai1、TRPC1的蛋白相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組增加(P均<0.05),加入阻滯劑后其表達(dá)量較高糖組下降,但尚未達(dá)到正常水平(P均<0.05);見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 各組蛋白表達(dá)結(jié)果

注:以β-actin為內(nèi)參照;與正常對(duì)照組比較, *P<0.05;與高糖組比較,△P<0.05圖5 各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

在糖尿病心肌損傷中，高血糖為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,并且DCM的發(fā)生發(fā)展與高血糖的水平及持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)[5]。DCM的機(jī)制可能與晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)堆積、Ca2+攝取功能的改變、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增多及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的激活等機(jī)制密切相關(guān),并且具有互相關(guān)聯(lián)、相互調(diào)節(jié)的作用[6]。雖有眾多研究者對(duì)DCM的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究,但目前糖尿病的心肌功能障礙和高糖誘導(dǎo)心肌損傷的確切機(jī)制尚不明確,高血糖誘導(dǎo)的心肌損傷尚未尋找到有效的防治措施。

目前認(rèn)為SOCE主要激活方式為:G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)接受細(xì)胞外的刺激信號(hào),活化磷脂酶C(phospholipase C, PLC)并分解4,5-二磷酸脂酰肌醇(phosphatidylinositol biphosphate, PIP2)產(chǎn)生二酰甘油(diacylgycerol, DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)。其中IP3作為一種重要的效應(yīng)蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)(ER/SR)上的IP3受體結(jié)合并介導(dǎo)受體開(kāi)放,胞內(nèi)鈣池快速耗竭。位于ER/SR上的以相對(duì)寡聚體形式存在的STIM1接受到鈣庫(kù)中Ca2+濃度降低時(shí),STIM1構(gòu)象發(fā)生變化進(jìn)一步導(dǎo)致其發(fā)生寡聚,進(jìn)而易位到近細(xì)胞膜的區(qū)域聚集形成斑塊。然后位于細(xì)胞膜上的Orai1和TRPC1與聚集的STIM1多聚體相互作用,激活Orai1和TRPC1通道,產(chǎn)生對(duì)Ca2+有高度選擇性的SOCE通路形成Ca2+內(nèi)流[7-11]。它通過(guò)對(duì)Ca2+內(nèi)流的調(diào)控產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng),近些年研究表明,細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)是誘發(fā)心血管疾病的重要因素[12-13]。

研究者們逐漸發(fā)現(xiàn),SOCE對(duì)葡萄糖水平的變化較敏感。1995年Rivera等[14]研究指出,在平滑肌細(xì)胞中高血糖可抑制SOCE的過(guò)程。Estrada等[15]同樣發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ER鈣水平降低，并且STIM1蛋白表達(dá)水平顯著降低,過(guò)表達(dá)STIM1可恢復(fù)ER鈣水平并且可以改善糖尿病冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性的舒張效應(yīng)。他們隨后的研究發(fā)現(xiàn),將正常的離體血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于高血糖的狀態(tài)下,亦會(huì)發(fā)生ER鈣水平和STIM1水平的變化。但有研究結(jié)果恰恰與之相反,其發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高糖可通過(guò)上調(diào)STIM1、Orai1來(lái)增強(qiáng)SOCE[16]。近些年有研究表明,心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載與糖尿病心肌病的發(fā)生有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)在H9c2心肌細(xì)胞系中,高糖可促進(jìn)心肌細(xì)胞 TRPC6表達(dá),導(dǎo)致TRPC通道開(kāi)放,進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載[17]。而目前在心肌細(xì)胞中高糖對(duì)SOCE的影響尚不清楚,尚需要進(jìn)一步研究。

本研究顯示,在葡萄糖濃度越高及時(shí)間越久的狀態(tài)下,細(xì)胞存活力逐漸降低,表明高糖對(duì)心肌細(xì)胞的損傷有著明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。在33 mmol/L葡萄糖濃度3 d條件下,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的肥大、變性、凋亡,并且增殖率顯著降低,因此選用此濃度作為高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)中高滲組的對(duì)照排除了滲透壓對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。緊接著本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR及Western blotting技術(shù),對(duì)心肌細(xì)胞中Ca2+內(nèi)流的主要通道SOCs進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明在高糖組STIM1、Orai1、TRPC1的mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著增加,藥物組表達(dá)顯著下降。其可能原因?yàn)?細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加可激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子 (nuclear factor activated T cells,NFAT)信號(hào)通路、鈣調(diào)素依賴(lài)蛋白激酶(CaMK)-組蛋白脫乙酰酶(HDAC)信號(hào)通路使胚胎基因表達(dá)增加,從而介導(dǎo)SOCs表達(dá)增加。SKF96365是SOCE通路的非特異性阻滯劑,可減少細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,從而減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載,由細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活的胚胎基因表達(dá)減弱。該結(jié)果提示體外高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌損傷中有SOCE的參與,其可能為糖尿病心肌病的機(jī)制之一。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)初步觀察到體外高糖環(huán)境可抑制H9c2心肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)STIM1、Orai1及TRPC1的表達(dá),提示體外高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌損傷中有 SOCE的參與,這可能是體外高糖H9c2心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。本研究為DCM可能的發(fā)病機(jī)制及治療提供了新線(xiàn)索。

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Effects of high glucose on the STIM1，Orai1 and TRPC1 in H9c2 cardiomyocyte in vitro

CHENMeng-nan.GraduateSchool,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221004,China;LUHai-long,LILei,YANGRong-li.

DepartmentofGeriatrics,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China

Objective To construct model of myocardial injury induced by high glucose in vitro, and to observe the proliferation of cardiomyocytes and the expressions of STIM1, Orai1 and TRPC1 in H9c2 cardiomyocyte. Methods Mouse embryo H9c2 cardiomyocytes in vitro were cultured, and randomly divided into four groups according to culturing media: normal control group (5.5 mmol/L glucose), hypertonic group (27.5 mmol/L mannite+5.5 mmol/L glucose), high glucose group (33 mmol/L glucose), and drug group (2 μmol/L SKF96365+33 mmol/L glucose). Then the cardiomyocytes were cultured for three days. The cell viability was detected through CCK8 technique. The changes of mRNA and protein expression levels of stromal interaction molecule 1(STIM1)，Orai1 and transient receptor potential canonical 1(TRPC1) in four groups were detected by RT-PCR and Western blotting technique. Results There were no statistical differences in all observed indexes between the normal control group and hypertonic group(P>0.05). The expression of mRNA and protein of STIM1, Orai1 and TRPC1 in high glucose group were higher than those of normal control group (P<0.05); And the relative expression of STIM1, Orai1 and TRPC1 in drug group were lower than those of high glucose group (P<0.05),but higher than those of normal control group(P<0.05). Conclusions High glucose could inhibit the proliferation of H9c2 myocardial cell in vitro and promote the expression of STIM1, Orai1 and TRPC1, and then mediate the entrance of calcium ions. It may be the mechanisms which result in cell damage.

diabetic cardiomyopathy; high glucose; stromal interaction molecule 1;orai1; transient receptor potential canonica 1

徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(KC14SH110)

221004江蘇省徐州市，徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(陳夢(mèng)楠)；221002江蘇省徐州市，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科(盧海龍 ，李雷，楊榮禮)

楊榮禮，Email:yrl6502@sina.com.

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.01.007

2016-02-24)