董青川，張治國，程 繼，王志剛，趙華才，趙文彩，張海艷，程永毅

miR-155對前列腺癌放射治療的增敏作用

董青川1，張治國2，程 繼1，王志剛1，趙華才1，趙文彩1，張海艷1，程永毅1

目的 探討miR-155在前列腺癌放射治療(簡稱放療)中的增敏作用。方法 轉(zhuǎn)染anti-miR-155，抑制前列腺癌DU145和PC-3細胞中miR-155水平，聯(lián)合應用放射治1療，通過觀察DU145和PC-3細胞的存活率、黏附率，以及前列腺癌細胞的凋亡率，并觀察Caspase-3和Caspase-9表達水平和活性的變化。結(jié)果 與對照組相比，DU145和PC-3細胞經(jīng)放射或anti-miR-155單獨處理后，細胞存活率(放射組分別為25.6%±2.0%和21.6±1.0%；anti-miR-155處理組分別為20.5%±1.0%和15.5%±1.0%)和黏附率(放射組分別為0.8%±0.1%和0.7%±0.1%；anti-miR-155處理組分別為0.7%±0.1%和0.6%±0.1%)均顯著降低(P<0.01)；前列腺癌細胞凋亡率增高(放射組分別為3.3%±0.3%和4.2%±0.3%；anti-miR-155處理組分別為4.1%±0.1%和3.9%±0.2%)；Caspase-3和Caspase-9表達水平和活性均提高(P<0.01)；聯(lián)合組的細胞存活率(分別為10.1%±0.5%和6.1%±0.5%)和黏附率(分別為0.4%±0.1%和0.4%±0.1%)低于單獨處理組(P<0.01，n=6)，細胞凋亡率(分別為6.9%±0.4%和6.8%±0.3%)，Caspase-3和Caspase-9表達水平和活性等均高于單獨處理組(P<0.01)。結(jié)論 抑制miR-155可增加人前列腺癌的放療敏感性，提高放射線對人前列腺癌細胞的治療效果，其機制可能與Caspase-3和Caspase-9參與細胞凋亡的途徑相關。

miR-155；前列腺癌；放療增敏；Caspase-3；Caspase-9

前列腺癌(prostate cancer, PCa) 嚴重威脅人類健康，是老年男性常見的惡性腫瘤。臨床常規(guī)的治療手段包括手術切除、放療、化療等，但患者復發(fā)率高、易出現(xiàn)耐藥，存活率低。大多數(shù)晚期患者常伴有全身多器官轉(zhuǎn)移，生存質(zhì)量差。盆腔淋巴結(jié)是前列腺癌最早侵犯的部位，骨骼是前列腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位[1-3]。尋找新的治療靶點，提高前列腺癌患者的生存率，改善生存質(zhì)量，是目前本領域國內(nèi)外研究的熱點問題。

miRNA具有高度進化保守的特點，特異性低，是真核細胞中一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長19～25個核苷酸，與靶mRNA的3’UTRs (untranslated regions) 互補結(jié)合，抑制蛋白合成，在基因表達中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可以影響腫瘤細胞的生物學進程，調(diào)控細胞增殖、凋亡等過程[4，5]。研究表明，miR-155在前列腺癌細胞中高表達，參與調(diào)控前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程[6，7]。據(jù)報道，miR-155可以增大肺癌等腫瘤的放療敏感性[8，9]。本實驗選擇人前列腺癌DU145和PC-3細胞，通過抑制miR-155表達，同時聯(lián)合放療，觀察前列腺癌細胞的生物學變化，同時分析其相關分子機制，以闡明miR-155對前列腺癌細胞的放療增敏效應，為其臨床應用提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及設備 人前列腺癌DU145和PC-3細胞株(中科院上海生命科學院細胞庫)。Anti-miRTM miR-155 抑制劑(anti-miR-155)和Anti-miRTM 陰性對照(美國 Applied Biosystems公司)。胎牛血清(Hyclone公司)；DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)。二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)，四甲基偶氮唑藍(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)， Caspase-3和Caspase-9抗體(Sigma 公司)；Caspase-9和Caspase-3活性檢測試劑盒(BioVision公司)。WDVE-6直線加速器(西門子，德國)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組處理 人前列腺癌DU145和PC-3細胞，DMEM培養(yǎng)液常規(guī)處理(含10%滅活胎牛血清，37 ℃，95%O2，5%CO2)，孵箱內(nèi)培養(yǎng)。按照以下實驗分組：對照組、放射組(5 Gy)，anti-miR-155處理組，放射(5 Gy)和anti-miR-155聯(lián)合處理組(聯(lián)合組)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。照射條件：采用直線加速器發(fā)出的X射線為照射源，單次照射方式，從培養(yǎng)皿底部向上照射，源距離(SSD)=100 cm，照射面積10 cm×10 cm，劑量率=2 Gy/min。

1.3 細胞生長曲線測定 MTT法測定細胞生長曲線，取對數(shù)生長期的DU145和PC-3細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，密度為5×103/孔，按上述分組分別處理細胞后，每孔加5 g/L的MTT 20 μl，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入二甲基亞砜 150 μl，室溫孵育10 min。酶聯(lián)免疫檢測分析儀測定490 nm的吸光值。

1.4 細胞黏附試驗 在24孔培養(yǎng)板上每孔加入層粘連蛋白溶液0.2 ml，37 ℃，過夜，PBS洗2次，再加入3%牛血清白蛋白0.2 ml，孵育2 h，PBS沖洗2 遍，包被備用。取1×105的單細胞懸液分別接種于已包被不同ECM的板內(nèi)，按上述分組分別處理細胞后，棄去未黏附細胞，PBS沖洗，在顯微鏡下隨機挑取10個不相關視野計數(shù)黏附細胞，計算黏附百分率。

1.5 Annexin V/PI 雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的DU145和PC-3細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，2×105/孔。按上述分組分別處理細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，PBS緩沖液沖洗，加入100 μl標記溶液 (FITC-Annexin V和PI，終濃度為1 μg/ml)，孵育10 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 Western blot分析Caspase-3和Caspase-9表達 取對數(shù)生長期的DU145和PC-3細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，按上述分組分別處理細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，PBS沖洗，加入細胞裂解液， 4 ℃ 放置30 min，14 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，加入一抗(1∶1000)孵育，4 ℃ 過夜，加入二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，收集圖像。

1.7 Caspase-9和Caspase-3活性檢測 按照上述分組，取對數(shù)生長期的DU145和PC-3細胞，按Caspase活性檢測試劑盒操作程序，加入細胞裂解液，1500 r/min離心20 min，取上清，加入Ac-LEHD-pNA后混勻，室溫條件下放置1 h，并測定405 nm處的吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 存活率 放射組和anti-miR-155處理組DU145和PC-3細胞的存活率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；聯(lián)合組的細胞黏附率顯著低于放射組或Anti-miR-155處理組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2 黏附率 與對照組相比，DU145和PC-3細胞經(jīng)放射或anti-miR-155單獨處理后，細胞黏附率均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；聯(lián)合組的細胞黏附率顯著低于放射組或Anti-miR-155處理組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

2.3 凋亡率 與對照組相比，DU145和PC-3細胞經(jīng)放射或anti-miR-155單獨處理后，細胞凋亡率均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；聯(lián)合組的細胞黏附率顯著高于放射組或Anti-miR-155處理組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表1 不同培養(yǎng)時間下各組對前列腺癌細胞存活率的影響 ±s；%；n=6)

注：與對照組比較，①P<0.01；與放射組或Anti-miR-155處理組比較，②P<0.01

表2 各組對前列腺癌細胞DU145和PC-3黏附率的影響 ；%；n=6)

注：與對照組比較，①P<0.01；與放射組或Anti-miR-155處理組比較，②P<0.01

表3 各組對前列腺癌細胞DU145和PC-3凋亡率的影響 ；%；n=6)

注：與對照組比較，①P<0.01；與放射組或Anti-miR-155處理組比較，②P<0.01

2.4 Caspase蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，DU145和PC-3細胞經(jīng)放射或anti-miR-155單獨處理后，細胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的水平均增加，而聯(lián)合組的細胞，其Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平均顯著高于放射組或Anti-miR-155處理組(圖1)。

2.5 Caspase活性 如圖2所示，放射組和anti-miR-155處理組DU145和PC-3細胞中的Caspase-3和Caspase-9活性均高于對照組；而聯(lián)合組的細胞中，Caspase-3和Caspase-9活性均顯著高于放射組或Anti-miR-155處理組(圖2)。

圖1 各組對前列腺癌細胞Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的影響

A. DU145；B.PC-31。1.對照組；2.放射組；3.anti-miR-155處理組；4.聯(lián)合組

圖2 各組對前列腺癌細胞Caspase-3和Caspase-9活性的影響

A. DU145；B.PC-31；1.對照組；2.放射組；3.anti-miR-155處理組；4.聯(lián)合組

3 討 論

放療是臨床治療前列腺癌的常規(guī)治療之一，據(jù)報道，一些患者易出現(xiàn)輻射抵抗效應，從而降低了臨床療效[10，11]。因此，探索此抵抗效應在前列腺癌中發(fā)生的分子機制，同時尋找新的治療靶點和策略，是目前本領域研究的熱點問題，對于提高前列腺癌患者的臨床治療效果，改善患者的生存質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應用價值。

miR-155與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關，研究發(fā)現(xiàn)，miR-155不僅在前列腺癌細胞中高表達，同時可以增加肺癌等腫瘤對放療的敏感性，這一效應與缺氧效應及FOXO3A的作用密切相關[7-9]。本研究通過特異性抑制前列腺癌DU145和PC-3細胞中miR-155的水平，觀察其對前列腺癌生物學行為的影響。結(jié)果表明，抑制miR-155，能夠顯著降低DU145和PC-3細胞的增殖水平和黏附率，同時能夠顯著誘導細胞凋亡的發(fā)生，增高細胞凋亡率，這一效應與細胞中Caspase-3和Caspase-9的表達水平和活性有關；此外，我們還發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155的水平，可以顯著增加放射治療的效果，顯著抑制放射治療細胞的增殖和黏附，同時增加Caspase-3和Caspase-9的表達水平和活性，從而促進放射治療組細胞凋亡的發(fā)生，增加前列腺癌DU145和PC-3細胞的放療敏感性。

在細胞的凋亡進程中，Caspase 家族成員起著關鍵的作用，Caspase-3和Caspase-9是關鍵分子，調(diào)控凋亡信號轉(zhuǎn)導的過程[12，13]。上游FasL、TRAIL等信號分子與相應受體結(jié)合后，激活Caspase-3，啟動死亡受體途徑，誘導細胞凋亡的發(fā)生；細胞線粒體跨膜電位及通透性的改變，引起細胞色素C 的釋放，從而激活Caspase-9，啟動線粒體途徑，誘導細胞凋亡的發(fā)生[14，15]。Caspase 活性與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族成員關系密切，影響細胞凋亡的調(diào)控過程[16，17]。本實驗結(jié)果也表明，miR-155的水平與Caspase-3和Caspase-9密切相關，提示，miR-155影響前列腺癌DU145和PC-3細胞的凋亡過程可能與上述兩個Caspase分子有關，而這一關系也可能是miR-155增加前列腺癌放療敏感性的分子機制之一。

本研究結(jié)果提示，抑制miR-155可以增加人前列腺癌的放療敏感性，提高γ射線對人前列腺癌細胞的放射治療效果，其相關機制可能與Caspase-3和Caspase-9參與細胞凋亡的途徑相關。

[1] Brody H. Prostate cancer [J]. Nature, 2015, 528(7582): S117.

[2] Xin L. Cells of origin for cancer: an updated view from prostate cancer [J]. Oncogene, 2013, 32(32): 3655-3663.

[3] Jerónimo C, Bastian P J, Bjartell A,etal. Epigenetics in prostate cancer: biologic and clinical relevance [J]. Eur Urol, 2011, 60(4): 753-766.

[4] Bertoli G, Cava C, Castiglioni I. MicroRNAs as biomarkers for diagnosis, prognosis and theranostics in prostate cancer [J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(3): 245-251.

[5] Tutar Y. miRNA and cancer; computational and experimental approaches [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2014, 15(5): 429-436.

[6] Cai Z K, Chen Q, Chen Y B,etal. microRNA-155 promotes the proliferation of prostate cancer cells by targeting annexin 7 [J]. Mol Med Rep, 2015, 11(1): 533-538.

[7] Ji H, Li Y, Jiang F,etal. Inhibition of transforming growth factor beta/SMAD signal by MiR-155 is involved in arsenic trioxide-induced anti-angiogenesis in prostate cancer [J]. Cancer Sci, 2014, 105(12):1541-1549.

[8] Babar I A, Czochor J, Steinmetz A,etal. Inhibition of hypoxia-induced miR-155 radiosensitizes hypoxic lung cancer cells [J]. Cancer Biol Ther, 2011, 12(10): 908-914.

[9] Challagundla K B, Wise P M, Neviani P,etal. Exosome-mediated transfer of microRNAs within the tumor microenvironment and neuroblastoma resistance to chemotherapy [J]. J Natl Cancer Inst, 2015, 107(7):1093-1098.

[10] Barbieri C E, Demichelis F, Rubin M A. Molecular genetics of prostate cancer: emerging appreciation of genetic complexity [J]. Histopathology, 2012, 60(1):187-198.

[11] Chang L, Graham P H, Ni J,etal. Targeting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in the treatment of prostate cancer radioresistance [J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2015, 96(3): 507-517.

[12] Kiliccioglu I, Konac E, Varol N,etal. Apoptotic effects of proteasome and histone deacetylase inhibitors in prostate cancer cell lines [J]. Genet Mol Res, 2014, 13(2): 3721-3731.

[13] Das T P, Suman S, Alatassi H,etal. Inhibition of AKT promotes FOXO3a-dependent apoptosis in prostate cancer [J]. Cell Death Dis, 2016, 7: e2111.

[14] Jain A, Jain S, Jain R,etal. Coated chitosan nanoparticles encapsulating caspase 3 activator for effective treatment of colorectral cancer [J]. Drug Deliv Transl Res, 2015, 5(6): 596-610.

[15] Yan J, Ma C, Cheng J,etal. HAX-1 inhibits apoptosis in prostate cancer through the suppression of caspase-9 activation [J]. Oncol Rep, 2015, 34(5): 2776-2781.

[16] Lu T, Stark G R. NF-κB: regulation by methylation [J]. Cancer Res, 2015, 75(18): 3692-3695.

[17] Turturro F. Constitutive NF- κ B activation underlines major mechanism of drug resistance in relapsed refractory diffuse large B cell lymphoma [J]. Biomed Res Int, 2015,2015:484537.

(2016-06-20收稿 2016-09-15修回)

(責任編輯 武建虎)

Effect of miR-155 on radiosensitivity enhancement of prostate cancer in vitro

DONG Qingchuan1, ZHANG Zhiguo2，CHENG Ji1, WANG Zhigang1, ZHAO Huacai1, ZHAO Wencai1, ZHANG Haiyan1, and CHENG Yongyi1.

1.Department of Urinary Surgery, People’s Hospital of Shaanxi Province, Xi’an 710068, China; 2 Department of Urinary Surgery, Changqing oil field worker hospital, Xi’an 710201,China

Objective To explore the effects of miR-155 on radiosensitivity enhancement of prostate cancer in vitro.Methods Cell viability and adhesion of DU145 and PC-3 cells were evaluated after anti-miR-155 transfection combined with irradiation therapy. Flow cytometry was performed to evaluate the cell apoptosis. The expression and activity of Caspase-3 and Caspase-9 were also observed after the above treatment.Results The results evidenced that cell viability(25.6%±2.0% and 21.6±1.0% in irradiated group；20.5%±1.0% and 15.5%±1.0% in anti-miR-155 transfected group) and adhesion of DU145 and PC-3 cells(0.8%±0.1% and 0.7%±0.1% in irradiated group；0.7%±0.1% and 0.6%±0.1% in anti-miR-155 transfected group) were inhibited obviously after anti-miR-155 transfection. The apoptosis rate(3.3%±0.3% and 4.2%±0.3% in irradiated group；4.1%±0.1% and 3.9%±0.2% in anti-miR-155 transfected group), Caspase-3 and Caspase-9 expression and activity were enhanced obviously compared with the control group(P<0.01).After combinative treatment, cell viability (10.1%±0.5% in irradiated group and 6.1%±0.5% in anti-miR-155 transfected group) and adhesion (0.4%±0.1% in irradiated group and 0.4%±0.1% in anti-miR-155 transfected group)decreased significantly(P<0.01，n=6).The apoptosis rate(6.9%±0.4% in irradiated group；6.8%±0.3% in anti-miR-155 transfected group) and the expression of Caspase-3 and Caspase-9 were also higher than the signal treated group(P<0.01).Conclusions Our results suggested that miR-155 can increase the radiosensitivity of DU145 and PC-3 cells and increase the efficiency of radiotherapy of γ-ray irradiation on prostate cancer in vitro.

miR-155; prostate cancer; radiosensitivity; Caspase-3; Caspase-9

陜西省科技攻關項目(2011JQ4017)

董青川,博士，主治醫(yī)師。

1.710068 西安,陜西省人民醫(yī)院泌尿外科；2.710201,陜西省西安市長慶油田職工醫(yī)院泌尿外科

程永毅，E-mail：dongqc168@163.com

R737.25