趙嬋娟

(重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技系，重慶 404155)

清溫消熱飲對小鼠LPS致炎模型血清中炎性因子的影響

趙嬋娟

(重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技系，重慶 404155)

為了解促炎、抗炎細(xì)胞因子在小鼠LPS致炎模型中的動態(tài)變化，探討中藥方劑清溫消熱飲的抗炎治療作用，采用酶聯(lián)免疫法測定112例用LPS致小鼠急性炎癥模型治療過程中血清中促炎因子(TNF-α、IL-1β、PGE2)、抗炎因子(IL-10)含量。與LPS致小鼠急性炎癥模型組比較：清溫消熱飲組在18、24 h血清中IL-1β含量明顯降低，差異顯著(P<0.05)；清溫消熱飲組在6、12、18 h血清中TNF-α含量明顯降低，6、18 h差異顯著(P<0.05)，12 h差異極顯著(P<0.01)；清溫消熱飲組血清中的PGE2含量均低于模型組，在6、18、24、36 h時(shí)血清中的PGE2含量明顯降低，差異極顯著(P<0.01)；清溫消熱飲組在18、48 h血清中IL-10含量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)。同時(shí)，清溫消熱飲組與地塞米松組在各時(shí)間段血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、 PGE2含量無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，清溫消熱飲在急性炎癥模型中能有效降低血清促炎因子TNF-α、IL-1β、PGE2含量水平，提升抗炎因子(IL-10)含量水平以表現(xiàn)出明顯的抗炎作用。

炎性細(xì)胞因子；清溫消熱飲；小鼠；LPS致炎模型

清溫消熱飲方由清營湯改良，由石膏、知母、金銀花等多種藥物組成。在前期臨床使用中，表現(xiàn)出良好的抗炎鎮(zhèn)痛治療效果[1]。炎癥為醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床常見病癥。1988年，Rinderkecht等提出了“炎癥介質(zhì)學(xué)說”認(rèn)為：白細(xì)胞釋放的大量細(xì)胞因子形成復(fù)雜的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。大量的研究表明，細(xì)胞因子(cytokines)包括TNF-α、IL-10、IL-1等在急性炎癥的發(fā)病過程中起到極其重要的作用。研究炎癥因子可作為評價(jià)預(yù)測炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，因此，血清炎性細(xì)胞因子水平的變化可以在一定程度上反映藥物的治療效果。

為更進(jìn)一步的研究清溫消熱飲抗炎鎮(zhèn)痛的藥效活性及作用機(jī)制，本試驗(yàn)通過LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生小鼠急性炎癥模型，研究該藥通過血清促炎因子(TNF-α、IL-1β、PGE2)、抗炎因子(IL-10)等介導(dǎo)抗炎作用的機(jī)制，為清溫消熱飲進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動物 SPF級健康昆明系小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，購自重慶市中藥研究院試驗(yàn)動物研究所，許可證號：SCXK(渝)2015-0037。實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7 d，環(huán)境要求溫度(22±1)℃,相對濕度保持(55±5)%，飼養(yǎng)期間飲水、采食自由，所有條件均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)要求執(zhí)行。

1.2 藥物 清溫消熱飲方中石膏、知母、金銀花等中藥材購于重慶市萬州區(qū)全宏藥店，并經(jīng)重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技系中獸醫(yī)藥教研室具有中藥鑒定師資格的教師鑒定。按文獻(xiàn)方法制備試驗(yàn)制劑：取石膏先行煎煮30 min，然后將知母、金銀花、甘草等藥混合，煎煮3次合并煎液，濃縮至500 mL。加4%明膠攪拌至無沉淀，4 ℃靜置24 h，過濾，取濾液。加無水乙醇使含醇量分別達(dá)65%，4 ℃靜置24 h，離心過濾，取濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，揮發(fā)乙醇至無醇味。加無水乙醇使含醇量分別達(dá)75%、85%后，重復(fù)上述步驟。濾液加活性炭1.5 g，45 ℃，靜置30 min，過濾，調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至含生藥1 g/mL，高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆肹2-3]。

1.3 主要試劑 地塞米松磷酸注射液(湖北天藥藥業(yè)，批號：51409222)規(guī)格5 mg/ml、脂多糖(LPS，Sigma公司，美國，批號：201506)，小鼠TNF-α、IL-1β、IL-10、 PGE2試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號：201510)。

2 方法

2.1 LPS致小鼠急性炎癥模型 112只SPF小鼠隨機(jī)分成4個(gè)組，即陰性對照組、炎癥模型組(以下簡稱模型組)、清溫消熱飲組、地塞米松組。模型組、清溫消熱飲組、地塞米松對照組按照0.2 mL/10 g體重進(jìn)行腹腔注射LPS劑量，陰性對照組腹腔注射等量的滅菌生理鹽水。造模后：給藥組按照0.1 mL/10 g采用灌胃給藥，在0 h、4 h進(jìn)行兩次灌服；陰性對照組和模型組以滅菌蒸餾水(等容積)灌服。

2.2 樣本采集及處理 分別于致炎后6、12、18、24、32、64、72 h，采用摘眼球取血，血樣室溫放置30 min后3000 r/min離心10 min, 分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明的方法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-10、 PGE2含量水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以X±S表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 清溫消熱飲對LPS致急性炎癥模型小鼠血清中TNF-α含量水平的影響 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以得出造模后各組中小鼠血清中TNF-α含量均有不同程度的升高。模型組12 h時(shí)達(dá)到峰值，與陰性對照組比較差異極顯著(P<0.01)，隨后含量逐步降低。與模型組比較，清溫消熱飲組、地塞米松組在各時(shí)間點(diǎn)血清中的TNF-α含量均低于模型組，在6、18 h時(shí)清溫消熱飲組血清中的TNF-α含量顯著低于模型組(P<0.05)在12 h時(shí)清溫消熱飲組血清中的TNF-α含量極顯著低于模型組(P<0.01)，清溫消熱飲組與地塞米松組在各時(shí)間段血清中TNF-α含量無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果詳見表1。

表1 清溫消熱飲對LPS致急性炎癥模型小鼠血清TNF-α含量水平的影響 單位：ng/L

與陰性對照組比較A(P<0.01)、a(P<0.05)與模型組比較B(p<0.01)、b(p<0.05)

3.2 清溫消熱飲對LPS致急性炎癥模型小鼠血清中IL-1β含量水平的影響 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以得出造模后各組中小鼠血清中IL-1β含量均有不同程度的升高。與模型組比較，清溫消熱飲組血清中IL-1β含量均低于模型組,12 h差異極顯著(P<0.01)，18、24 h差異顯著(P<0.05)。清溫消熱飲組和地塞米松組各時(shí)間段血清中IL-1β含量無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果詳見表2。

表2 清溫消熱飲對LPS致急性炎癥模型小鼠血清IL-1β含量水平的影響 單位：ng/L

與陰性對照組比較A(p<0.01)、a(p<0.05)與模型組比較B(p<0.01)、b(p<0.05)

3.3 清溫消熱飲對LPS致急性炎癥模型小鼠血清中PGE2含量水平的影響 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以得出造模后各組中小鼠血清中PGE2含量均有不同程度的升高18 h時(shí)達(dá)到峰值,與陰性對照組比較差異極顯著(P<0.01)。與模型組比較，清溫消熱飲組、地塞米松組在6、18、24、36 h時(shí)血清中的PGE2含量均低于模型組(P<0.01)。清溫消熱飲組與地塞米松組在各時(shí)間段血清中PGE2含量無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果詳見表3。

表3 清溫消熱飲對LPS致急性炎癥模型小鼠血清中PGE2含量水平的影響 單位：ng/L

與陰性對照組比較A(P<0.01)、a(P<0.05)與模型組比較B(P<0.01)、b(P<0.05)

3.4 清溫消熱飲對LPS致急性炎癥模型小鼠血清中IL-10含量水平的影響 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以得出造模后各組中小鼠血清中IL-10含量均有不同程度的升高，極顯著高于陰性對照組(P<0.01)。與模型組比較，清溫消熱飲組、地塞米松組在各時(shí)間點(diǎn)血清中的TNF-α含量均高于模型組，在18 h、48 h時(shí)清溫消熱飲組血清中的IL-10含量極顯著高于模型組(P<0.01)，清溫消熱飲組與地塞米松組在各時(shí)間段血清中IL-10含量無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果詳見表4。

表4 清溫消熱飲對LPS致急性炎癥模型小鼠血清中IL-10含量水平的影響 單位：pg/mL

與陰性對照組比較A(P<0.01)、a(P<0.05)與模型組比較B(P<0.01)、b(P<0.05)

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，LPS(革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要成分)對機(jī)體具有毒害作用，其釋放進(jìn)入血液達(dá)到一定濃度可導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，可以通過與Toll樣受體(TLR4)結(jié)合激活炎癥信號通路，誘導(dǎo)研究體內(nèi)釋放大量細(xì)胞因子和細(xì)胞介質(zhì)在炎癥反應(yīng)過程中大量的表達(dá)，如IL-1β、TNF-α以及次一級的炎癥介質(zhì)PGE2等的合成和釋放。TNF-α在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)即開始分泌，其作用在于激活其他細(xì)胞因子的級聯(lián)，低濃度時(shí)則可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]。IL-1β主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種促炎細(xì)胞因子，參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，包括細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等。在炎癥開始反應(yīng)期為主要的促炎因子，能較早的生成并介導(dǎo)組織病理損傷過程，激活細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素等以及誘導(dǎo)IL-6等其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，具備進(jìn)一步誘發(fā)、放大炎癥反應(yīng)的作用[5]。整個(gè)過程中，抗炎介質(zhì)、促炎介質(zhì)兩者水平失衡為炎癥發(fā)生、發(fā)展和加劇的重要因素。故為了防止過度的炎癥反應(yīng)，機(jī)體在大量促炎介質(zhì)釋放的同時(shí)，也會伴隨產(chǎn)生多種抗炎介質(zhì)。IL-10能有效抑制抑制巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞的抗原呈遞作用，從而起到抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及降低血清中炎性細(xì)胞因子的水平，通過抑制免疫細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生而達(dá)到抗炎作用[6-8]。前列腺素E2(PGE2)作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有對IL-10、TNF-α、IL-1β等炎癥因子的調(diào)節(jié)作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，灌服清瘟消熱飲后，小鼠血清中TNF-α在6、12、18 h含量顯著降低；IL-1β在12、18、24 h含量顯著降低；PGE2在18、24、36 h含量顯著降低；IL-10在18、48 h含量顯著升高，表現(xiàn)出一定的抗炎效果。

通過長期、多角度的研究發(fā)現(xiàn)，中藥抗炎作用的藥理活性包含了多途徑的抗炎作用。周永學(xué)等[10]發(fā)現(xiàn)石膏能顯著降低甘酵母誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型中大鼠下丘腦中PGE2的含量。Lu等[11]發(fā)現(xiàn)知母苷BⅡ可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平上減少炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的生成，且呈現(xiàn)劑量依賴性，表現(xiàn)出很好的抗炎效果。張羅修等[12]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參素能顯著抑制巨噬細(xì)胞在酵母多糖誘導(dǎo)下合成的PGE2。OK-Hwa等[13]證實(shí)金銀花中的木犀草素(Luteolin)能夠通過NF-kB和MAPKs激活途徑抑制 TNF-α、IL-8、IL-6等促炎細(xì)胞介質(zhì)的釋放。

利用LPS致小鼠急性炎癥模型是目前評價(jià)或篩選抗炎藥物活性作用的經(jīng)典急性滲出性炎癥模型，主要表現(xiàn)為局部的充血、水腫及滲出等病理反應(yīng)過程[14-15]，該模型在新藥評價(jià)中應(yīng)用較為廣泛[16]。本研究通過建立LPS致小鼠急性炎癥模型研究清溫消熱飲對急性炎癥反應(yīng)的干預(yù)影響，通過對試驗(yàn)小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-10以及PGE2水平變化來了解其作用機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果證明，清溫消熱飲可降低TNF-α、IL-1β和PGE2水平，促進(jìn)IL-10的釋放，即通過對促炎細(xì)胞因子的合成與釋放，促進(jìn)抗炎因子的釋放過程來達(dá)到抑制過度炎癥反應(yīng)，從而起到抗炎作用。

中獸藥創(chuàng)新研究務(wù)必在傳統(tǒng)中獸藥的理論指導(dǎo)下選擇藥物，通過建立動物病理模型、細(xì)胞損傷模型等方法來闡釋中藥的作用機(jī)理[17]。試驗(yàn)是根據(jù)清溫消熱飲對LPS致炎小鼠血清中的部分抗炎、致炎因子的含量變化，闡述抗炎的作用機(jī)理，對于中藥通過什么通路影響血清中的抗炎、致炎因子的含量變化還有待于進(jìn)一步的研究。

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(編輯：陳希)

Effect of a Traditional Chinese Prescription Drug Qingwen Xiaore Yin on Serum Inflammatory Factors in LPS-induced Inflammatory Model

ZHAO Chan-juan

(DepartmentofAnimalScienceandTechnology,ChongqingThreeGorgesPolytechnicCollege,Chongqing404155，China)

This work aims to investigate the dynamic changes of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in LPS-induced inflammatory models in mice and explore the anti-inflammatory effect of a traditional Chinese prescription drug named Qingwen Xiaore Yin. ELISA was used to detect the contents of serum pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, PGE2) and anti-inflammatory cytokines (IL-10) in 112 acute inflammatory models in mice induced by LPS. Compared to LPS-induced acute inflammatory model group, the contents of pro-inflammatory cytokines in the serum of Qingwen Xiaore Yin group dramatically decreased. Specifically, IL-1β decreased at 18 and 24 h (P<0.05), TNF-α decreased at 6 h (P<0.05), 12 h (P<0.01) and 18 h (P<0.05), while PGE2 decreased at 6, 12 and 18 h (P<0.01). On the contrary, the content of serum IL-10 in the Qingwen Xiaore Yin group significantly increased at 6, 18, 24 h, and 36 h (P<0.01). Additionally, no significant difference was observed on the contents of TNF-α, IL-1β, IL-10, and PGE2 between the Qingwen Xiaore Yin group and the dexamethasone group (P>0.05). Qingwen Xiaore Yin can effectively decrease the levels of serum pro-inflammatory cytokines and enhance the level of anti-inflammatory factor in the acute inflammatory models, thus demonstrating recognizable anti-inflammatory effect.

inflammatory cytokines; Qingwen Xiaore Yin; mice; LPS-induced inflammatory model

重慶市市教委科技項(xiàng)目(KJ1503408);萬州區(qū)區(qū)科委科技項(xiàng)目(201501023)

趙嬋娟，碩士，講師，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，從事中獸醫(yī)學(xué)及動物藥學(xué)臨床方面研究。E-mail：zhaochanjuan@qq.com

2016-11-02

A

1002-1280 (2017) 01-0041-05

S853.74