王 婧,秦 卓,翟麗靜,游 敏,吳嬌娟,李昱頡,任 杰,王 桓,程 凱

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

電針三陰交對雌性癡呆模型小鼠HPO軸及學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究*

王 婧,秦 卓,翟麗靜,游 敏,吳嬌娟,李昱頡,任 杰,王 桓,程 凱△

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

目的：通過觀察電針三陰交對雌性癡呆模型小鼠HPO軸和學(xué)習(xí)記憶功能的影響，以進(jìn)一步揭示電針三陰交對阿爾茨海默病的作用。方法：選用9月齡SAMP8雌性小鼠12只隨機(jī)分為模型組(6只)、電針三陰交組(6只)，選用SAMR1小鼠6只為空白對照組。電針組選取兩側(cè)三陰交穴，電針20 min/次，隔日1次，共治療15次。采用ELISA法檢測HPO軸相關(guān)激素水平，采用水迷宮法檢測學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):治療前從第1天到第5天模型組和電針三陰交組逃避潛伏期都高于空白對照組，且存在顯著性差異(P<0.01)，模型組和電針三陰交組無明顯差異(P>0.05);治療后電針三陰交組較模型組從第1天和第5天潛逃期明顯縮短，其中第1、3和5天存在明顯差異(P<0.05)。對HPO軸的影響：與空白對照組相比，模型組卵巢E2水平降低(P<0.05)，垂體中FSH、LH和下丘腦中GnRH水平均升高(P<0.05)，卵巢重量顯著降低(P<0.01);與模型組相比，電針三陰交組卵巢E2水平顯著升高(P<0.05)，垂體FSH、LH和下丘腦GnRH水平均降低(P<0.05)，卵巢重量升高(P<0.05)。結(jié)論：電針三陰交對于9月齡SAMP8雌性小鼠的HPO軸功能以及學(xué)習(xí)記憶能力起到良性調(diào)節(jié)的作用。

阿爾茨海默?。浑娽?；SAMP8雌性小鼠；三陰交；下丘腦垂體卵巢軸

阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是老年癡呆中最為常見的一種發(fā)病類型，它突出的臨床表現(xiàn)體現(xiàn)在記憶功能的衰退，智力的全面下降，精神狀態(tài)異常以及個(gè)體行為失常，是老年的一種常見的退行性神經(jīng)系統(tǒng)病變。目前阿爾茨海默病是影響老年人生活質(zhì)量的重要的疾病原因[1]。隨著全球人口老齡化嚴(yán)峻，阿爾茨海默病的發(fā)病率在逐年升高，年齡一直是AD發(fā)病的首要影響因素，但是近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，女性阿爾茨海默病的患病率遠(yuǎn)高于男性[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)給予雌激素治療的絕經(jīng)期婦女，可減少阿爾茨海默病的發(fā)病[4-5]。雌激素減少假說是阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制研究的重點(diǎn)之一[6]。ERT是目前針對女性激素異常導(dǎo)致AD的臨床常用療法，但以雌激素為主的ERT在臨床使用及動物研究中出現(xiàn)了較多的副作用和使用的局限性[7-8]。因此探尋既能改善HPO軸功能和提高女性雌激素水平，又減少副作用的手段亟待解決。

三陰交穴為足三陰之交會,屬足太陰脾經(jīng),是治療婦科疾病之常用穴位,亦是臨床治療圍絕經(jīng)期綜合征的要穴。既往實(shí)驗(yàn)研究表明，電針三陰交對圍絕經(jīng)期動物模型的HPO軸相關(guān)激素水平具有良性的調(diào)節(jié)作用[9],對HPO軸的調(diào)節(jié)可以改善雌激素等相關(guān)激素的水平，進(jìn)而對更年期綜合癥的臨床癥狀起到改善的作用，并進(jìn)一步猜想，電針三陰交通過對HPO軸的調(diào)節(jié)，提高雌激素水平、改善下丘腦功能從而預(yù)防或者延緩AD的進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)選擇具有更年期綜合征與AD病理特點(diǎn)的9月齡SAMP8雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)對象[10-11],通過電針三陰交(SP6)，觀察其對9月齡SAMP8雌性小鼠HPO軸的調(diào)節(jié)作用以及行為學(xué)的影響，初步討論電針三陰交穴改善AD學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

9月齡SAMP8雌性小鼠16只，9月齡SAMR1小鼠8只，體質(zhì)量(30±5)g，清潔級，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。將動物置于清潔柜中，溫度控制在(20±2)℃，濕度為65%，在12 h光照和12 h黑暗的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，保持自由攝食和飲水。

1.2 主要儀器與試劑

毫針：新杏林針灸針(北京天宇恒科技有限責(zé)任公司),規(guī)格0.17 mm×7 mm。

儀器：ZK380型低溫離心機(jī)(德國)；正置olympus顯微鏡(日本)；LH韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)公司)。

試劑：E2、GnRH、FSH、LH酶免試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與治療措施

根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)要求，采用完全隨機(jī)分組方法，將12只9月齡SAMP8雌性小鼠隨機(jī)分成兩組：模型組(6只)，電針三陰交組(6只)。9月齡SAMR1雌性小鼠作為空白對照組(6只)。

穴位定位和刺法：參照全國高等中醫(yī)院校規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位的說明。三陰交穴：小鼠后肢內(nèi)踝尖直上1.5 mm，脛骨后緣。選用雙側(cè)三陰交穴，將毫針向腳掌斜刺2 mm，然后將韓氏電針儀連于毫針針柄上，并加以固定，采用疏密波，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度以針柄輕微抖動為宜，每次留針20 min。隔日治療1次，共治療15次，療程歷時(shí)30天，其余各組常規(guī)飼養(yǎng)，隔日抓取。

2.2 行為學(xué)觀察

Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation):選取各組小鼠作為觀察對象，水迷宮，是由圖像采集分析系統(tǒng)和不銹鋼噴塑圓柱形水池兩部分組成。水池直徑為10 m，高3.8 m，注入3 m水。在水池中放置一登臺平臺，高1.5 m。按東南西北4個(gè)方位將水池平均劃分成4個(gè)象限(NE、SE、SW、NW) 。實(shí)驗(yàn)時(shí)將登陸平臺固定于 SE 象限內(nèi)，不高出水面(水下1.5 cm)，水溫穩(wěn)定在 (25±1)℃。除SE象限外在各象限設(shè)置3個(gè)入水點(diǎn)，每天測試 3次，連續(xù)5天，將動物從入水到尋臺成功所需的時(shí)間記作逃避潛伏期。每次從不同象限的入水點(diǎn)將動物面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)小鼠的登臺時(shí)間，在平臺上停留超過2 s則定為登陸成功，若超過120 s未找到平臺則登臺失敗，潛伏期記為120 s，用木棒引導(dǎo)其登陸平臺并停留10 s。記錄每只連續(xù)5天的逃避潛逃期，計(jì)算每天潛伏期的平均值，來評價(jià)小鼠空間記憶的學(xué)習(xí)獲得能力。

2.3 材料處理

每組隨機(jī)選取，電子天平稱重后快速斷頭，快速將小鼠腦部取出放置于冰袋上，迅速分離出下丘腦。用木簽將垂體從垂體窩中分離出來，于此同時(shí)打開小鼠腹腔，取出左側(cè)卵巢。將各組織用濾紙擦拭干凈，置于液氮中冷藏，將下丘腦、垂體、卵巢用電子天平稱重，分別放入勻漿管中將組織充分研磨，按1:9比例加入生理鹽水。將勻漿液移入EP管中,置于低溫(4℃)離心機(jī)中，以3500 r/min的轉(zhuǎn)速充分離心15 min，取上清液，置于-80℃冰箱中保存，待測。

2.4 指標(biāo)檢測

選用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked imraunosortent assay，ELISA)測定SAMP8及SAMR1小鼠卵巢中的E2含量、下丘腦中GnRH含量以及垂體中LH、FSH含量，指標(biāo)檢測操作完全嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)

治療前：每組個(gè)體內(nèi)變異示:P=0.000<0.05，說明各組逃避潛伏期隨時(shí)間的變化趨勢有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間變異部分示：P=0.000<0.05，說明分組因素(即干預(yù)因素)有影響。從第1天到第5天模型組和三陰交逃避潛伏期都高于空白對照組，且存在顯著性差異P<0.01，電針三陰交組與模型組相比無明顯變化(P>0.05)，說明癡呆模型成功。見表1、圖1。

治療后：每組個(gè)體內(nèi)變異示:P=0.000<0.05，說明各組逃避潛伏期隨時(shí)間改變的趨勢有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間變異部分示：P=0.000<0.05，說明分組因素有影響。從第1天到第5天電針三陰交組的潛伏期均較模型組縮短，其中第1天、第3天和第5天電針三陰交組較模型組比較潛伏期明顯縮短，存在顯著差異性(P<0.05)，電針三陰交組雖然潛伏期縮短，但與空白對照組相比潛伏期時(shí)間依然延長。見表2、圖2。

表1 治療前各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力水迷宮逃避潛伏期比較(±s,s)

注：與空白對照組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 治療后各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力水迷宮逃避潛伏期比較(±s)

注：與空白對照組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01

圖1 治療前各組Morris水迷宮潛伏期的比較注：與空白對照組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01

圖2 治療后各組Morris水迷宮潛伏期的比較注：與空白對照組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01

3.2 電針三陰交對雌性小鼠HPO軸的影響

3.2.1 電針三陰交對雌性小鼠E2的影響 見表3。與空白對照組比較，模型組卵巢E2明顯降低(P<0.05)，電針三陰交組無明顯差異(P>0.05)；與模型組比較，電針三陰交組卵巢E2明顯升高(P<0.05)。

表3 電針三陰交對雌性小鼠E2的影響(±s)

注：與空白對照組比較,▲P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

3.2.2 電針三陰交對雌性小鼠垂體LH的影響 見表4。與空白對照組比較，模型組垂體LH明顯升高(P<0.05)，電針三陰交組升高(P<0.05)；與模型組比較，電針三陰交組垂體LH顯著降低(P<0.05)。

表4 電針三陰交對雌性小鼠LH的影響(±s)

注：與空白對照組比較,▲P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

3.2.3 電針三陰交對雌性小鼠垂體FSH的影響 見表5。與空白對照組比較，模型組垂體FSH明顯升高(P<0.05)，電針三陰交組無明顯差異(P>0.05)；與模型組比較，電針三陰交組FSH明顯降低(P<0.05)。

表5 電針三陰交對雌性小鼠FSH的影響(±s)

注：與空白對照組比較,▲P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

3.2.4 電針三陰交對雌性小鼠下丘腦GnRH的影響 見表6。與空白對照組比較，模型組下丘腦GnRH明顯升高(P<0.05)，電針三陰交組無明顯差異(P>0.05)；與模型組比較，電針三陰交組GnRH明顯降低(P<0.05)。

表6 電針三陰交對雌性小鼠GnRH的影響(±s)

注：與空白對照組比較,▲P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

3.3 電針三陰交對雌性小鼠卵巢重量的影響

見表7。與空白對照組比較，模型組卵巢重量明顯降低(P<0.01)，電針三陰交組卵巢重量無明顯差異(P>0.05)；與模型組比較，電針三陰交組卵巢重量明顯升高(P<0.05)。

表7 電針三陰交對卵巢重量的影響(±s)

注：與空白對照組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01;與模型組比較,*P<0.05

4 討論

阿爾茨海默病是老年癡呆中最為常見的神經(jīng)退行性疾病，隨著女性患AD的發(fā)病率逐年升高，尋找針對于女性患阿爾茨海默病的治療方法以及預(yù)防手段愈加受到關(guān)注?，F(xiàn)代研究認(rèn)為女性患AD的發(fā)病原因與女性在圍絕經(jīng)期過程中體內(nèi)E2、LH、GnRH等HPO軸相關(guān)激素水平變化相關(guān)[12-13]，針對HPO軸性激素水平對AD的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)選用以中樞學(xué)習(xí)記憶功能快速衰退為主要特征的SAMP8亞系小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，以有正常衰老過程的SAMR1亞系為空白對照，本實(shí)驗(yàn)水迷宮行為學(xué)表明，SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減退較SAMR1小鼠明顯，出現(xiàn)提前衰老的特征。既往針刺治療AD的相關(guān)腧穴研究中大多使用百會、大椎、風(fēng)池等通督脈腧穴為主，鮮有對三陰交單穴對性激素的研究[14]。既往研究證實(shí)三陰交可以對圍絕經(jīng)期大鼠及去卵巢大鼠的HPO軸有良性的調(diào)節(jié)作用[9,15-17]。因此，本次實(shí)驗(yàn)選用電針三陰交穴觀察對癡呆模型雌性小鼠的HPO軸的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針三陰交能夠顯著提高SAMP8雌性小鼠卵巢重量及卵巢中E2的水平，降低垂體內(nèi)FSH、LH及下丘腦中GnRH的水平，說明三陰交有促進(jìn)卵巢分泌雌激素、抑制下丘腦以及垂體對促性腺激素和促性腺激素釋放激素的調(diào)節(jié)功能，可以對SAMP8雌性小鼠的HPO軸起到良性的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而可以改善小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。從三陰交的穴性分析，三陰交穴屬足太陰脾經(jīng)，為足太陰脾經(jīng)與足厥陰肝經(jīng)、足少陰腎經(jīng)3條陰經(jīng)的交會穴，脾為后天之本，是氣血生化之源，脾主中焦,肝腎主下焦，故中下焦之氣三陰交一穴可以盡之，具有健脾利濕、祛風(fēng)活絡(luò)、活血調(diào)經(jīng)、疏肝益腎之功效。從足三陰入腹循行的部位看，足少陰經(jīng)“貫脊屬腎”，明顯位置在會陰部的后方；足厥陰經(jīng)“循股陰，入毛中，環(huán)陰器，抵小腹”，聯(lián)系會陰部陰器，明顯位置較足少陰經(jīng)靠前；足太陰經(jīng)“交出厥陰之前,上循膝股內(nèi)前廉，入腹”,明顯較足厥陰經(jīng)靠前，也就是說足三陰經(jīng)從3個(gè)不同方向抵盆腔陰器，對胞宮功能具有整體性、全面性的調(diào)節(jié)作用。腦為髓海，腎經(jīng)貫脊入腦，腦髓是先天腎精所化生，后天脾運(yùn)化所濡養(yǎng)，肝腎同源，肝經(jīng)與督脈會于巔，所以三陰交能夠補(bǔ)氣養(yǎng)血、補(bǔ)益腦髓的功效。從三陰交特定神經(jīng)節(jié)段看，三陰交與子宮和卵巢關(guān)系密切[18-19]，提示三陰交可對盆腔以及腦起到直接刺激作用，三陰交通過改善卵巢和下丘腦功能，調(diào)整HPO軸功能，從而提高癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

因此，筆者得出結(jié)論電針三陰交可能通過調(diào)節(jié)HPO軸相關(guān)激素的作用機(jī)制，延緩衰老進(jìn)而改善AD的學(xué)習(xí)記憶能力，為預(yù)防和治療AD提供新的治療思路與方法，進(jìn)一步補(bǔ)充三陰交穴的主治作用。

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國家自然基金項(xiàng)目，編號:81072768。

王婧(1991-)，女，2014級針灸推拿專業(yè)碩士研究生。

△通訊作者：程凱(1971-)，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事腧穴特異性的臨床與研究。

R246.6

A

1005-0779(2017)01-0042-04

2016-08-05