樊嬌嬌，李蘇穎，李春紅，陳 華，夏之寧，楊豐慶*

(1.重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400031；2.河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 藥學(xué)系，河南 鄭州 451191)

綜 述

組合肽配體庫(kù)技術(shù)富集蛋白研究進(jìn)展

樊嬌嬌1，李蘇穎2，李春紅1，陳 華1，夏之寧1，楊豐慶1*

(1.重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400031；2.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，河南 鄭州 451191)

低豐度蛋白是生物體中重要的活性物質(zhì)，參與新陳代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多種生理及病理過程，因此對(duì)低豐度蛋白的研究具有重要意義。組合肽配體庫(kù)技術(shù)(CPLL)是富集低豐度蛋白的一種有效方法，通過CPLL富集作用可以實(shí)現(xiàn)低豐度蛋白的檢測(cè)與鑒定。該文總結(jié)了CPLL應(yīng)用于不同領(lǐng)域中(包括人體、動(dòng)物源、植物源等蛋白研究方面)低豐度蛋白樣品的富集研究，可為CPLL的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

低豐度蛋白；組合肽配體庫(kù)技術(shù)；蛋白質(zhì)組學(xué)；研究進(jìn)展;綜述

蛋白質(zhì)組(Proteome)一詞最早由Wilkins等于1994年提出，是指一個(gè)細(xì)胞或組織中由基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[1]。根據(jù)每種蛋白在蛋白質(zhì)組中的含量差異，通?？蓪⒌鞍踪|(zhì)組中的蛋白質(zhì)分為兩類，即低豐度蛋白(Low-abundance proteins,LAP)和高豐度蛋白(High-abundance proteins,HAP)。其中，蛋白豐度的高低可用密碼子傾向指數(shù)(Codon Bia Index,CBI)表征，CBI代表了特定密碼子表達(dá)相同氨基酸殘基的傾向，CBI<0.2即歸為L(zhǎng)AP。不同生物體中，LAP和HAP的含量差異巨大，尤其是在復(fù)雜的生物體中，二者的含量差異可達(dá)108以上[2]。LAP作為生物體的重要蛋白成分，雖然含量很低，對(duì)生物體的生物活性卻有重大影響。不同動(dòng)植物生物體中的蛋白質(zhì)種類和含量各有差異，在進(jìn)行蛋白質(zhì)分析時(shí)，HAP會(huì)在不同程度上影響LAP的分析和檢測(cè)。同時(shí)，由于蛋白質(zhì)不具有DNA能在體外被大量擴(kuò)增的性質(zhì)[3]，所以如何富集和分離LAP是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

除了傳統(tǒng)的蛋白富集方法如親和色譜分離法、液相等電聚焦分離法、聚乙二醇分級(jí)沉淀法之外，近幾年研究報(bào)道了一種有效的LAP富集方法——組合肽配體庫(kù)技術(shù)(Combinatorial peptide ligand library,CPLL)，即具有捕獲LAP能力的由數(shù)百萬六勝肽(又稱六元?jiǎng)匐?，Areginine essence)組成的配體庫(kù)[4]。本文對(duì)LAP的富集分離方法進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，重點(diǎn)綜述了CPLL富集LAP的方法在不同領(lǐng)域(人體、動(dòng)物及植物源蛋白)研究中的應(yīng)用，以期為CPLL的進(jìn)一步研究和應(yīng)用以及不同生物體中LAP的富集純化研究提供參考。

1 低豐度蛋白的富集分離方法

LAP的富集技術(shù)主要包括親和色譜分離法[5-6]、亞細(xì)胞器分離法[7-8]、液相等電聚焦分離法[9-10]以及聚乙二醇分級(jí)沉淀法[11]等。此外，也可通過去除HAP使LAP的濃度相對(duì)增大，以達(dá)到富集并檢測(cè)LAP的目的，如超濾離心法、金磁微粒法等[12-14]。

親和色譜分離法[5-6]是利用親和吸附作用分離純化生物物質(zhì)的方法，其固定相是鍵合親和配基的親和吸附介質(zhì)。由于目標(biāo)產(chǎn)物是基于生物親和作用(抗原與抗體、激素與受體、酶與基質(zhì)等)吸附在固定相上而分離，因此親和色譜具有高度選擇性。馬梅蘭等[15]依據(jù)親和層析法制備的柱式白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒結(jié)合超濾離心法去除血清中的HAP(白蛋白、免疫球蛋白)，達(dá)到了檢測(cè)血清中能夠反映疾病病理、生理等相關(guān)信息的LAP的目的。在采用這種分離方法純化LAP時(shí)，不同的分離對(duì)象需要配備專一的配基并選擇特定的色譜柱，因而親和色譜分離技術(shù)在分離蛋白質(zhì)樣品中的應(yīng)用受到限制。利用亞細(xì)胞器分離法[7-8]進(jìn)行蛋白樣品分離是通過細(xì)胞器的純化和亞細(xì)胞組分的分離，來降低樣品的復(fù)雜性，從而增大相應(yīng)蛋白質(zhì)組分的濃度?？诐h金等[16]總結(jié)了近年來不同亞細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展。高純度亞細(xì)胞器的獲得成本高、難度大等是限制該方法應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。液相等電聚焦分離法[9-10]的原理與固相等電聚焦一致，是根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)不同來分離蛋白。Fountoulakis等[17]利用該方法從大鼠腦蛋白中富集了鈣結(jié)合蛋白、類視錐蛋白等大量LAP。液相等電聚焦分離需在無鹽溶液中進(jìn)行，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀，同時(shí)該技術(shù)還要求樣品中的蛋白成分必須在其等電點(diǎn)范圍內(nèi)，因此該法不適用于在其等電點(diǎn)范圍內(nèi)不溶或易發(fā)生變性的蛋白富集。此外，聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)[11]是一種直鏈的高分子聚合物，能夠破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層從而使蛋白質(zhì)沉淀，已被廣泛應(yīng)用于蛋白的分級(jí)提取。在分級(jí)提取時(shí)，通過改變PEG濃度梯度可將HAP(如二磷酸核酮糖羧化酶，Rubisco)富集在單一PEG濃度組分中，從而提高后續(xù)雙向電泳分析中對(duì)LAP的檢測(cè)靈敏度。目前，該法已被用于天女木蘭種子[18]、水稻葉鞘[19]、擬南芥[20]、卷柏[21]、十大功勞[22]及生菜種子[23]等植物中LAP的富集。但樣品中殘留的PEG可能會(huì)使凝膠背景變暗是PEG法的一大缺點(diǎn)，這會(huì)直接影響雙向電泳的分辨率，還可能會(huì)抑制離子信號(hào)從而干擾后續(xù)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析。

圖1 組合肽配體庫(kù)技術(shù)的原理圖[27]Fig.1 Principle of combinatorial peptide ligand library[27]

Furka等[24]和Lam等[25]在1991年提出“一珠一肽”，隨后Turk等[26]于2003年提出配體庫(kù)的概念，而Thulasiraman等[27]于2005年在二者的基礎(chǔ)上開發(fā)了CPLL技術(shù)，并將其應(yīng)用于實(shí)際的血清和尿液等生物樣品中LAP的富集。CPLL是一種新型的LAP富集方法，與上述的蛋白樣品處理方法相比，它能減小樣品中蛋白濃度的動(dòng)態(tài)變化范圍。有諸多研究者對(duì)CPLL的原理進(jìn)行了介紹[28-32]，其核心是六肽組合配體庫(kù)的建立，即在多孔的固相層析介質(zhì)上合成和連接由不同氨基酸殘基組成的數(shù)百萬的短肽配體(常用的是六肽配體)，這些短肽配體構(gòu)成一套組合的短肽配體庫(kù)，即組合肽配體庫(kù)。蛋白質(zhì)可與鍵合在聚丙烯酸酯磁珠上的六肽配體發(fā)生親和反應(yīng)，因配體庫(kù)中每種配體的量相同，因此HAP的相應(yīng)配體會(huì)迅速飽和，而LAP逐漸被富集并趨于飽和。洗去未結(jié)合的HAP，最后將親和結(jié)合的所有蛋白質(zhì)洗脫下來供后續(xù)分析，由此達(dá)到降低樣品中蛋白濃度的動(dòng)態(tài)范圍和富集LAP的目的(如圖1)。

肽庫(kù)的制備主要有兩種方法[33]：①生物肽庫(kù)系統(tǒng)(隨機(jī)肽庫(kù))，如絲狀噬菌體肽庫(kù)和質(zhì)粒肽庫(kù)；②組合技術(shù)：“反復(fù)選擇合成法”；“選擇法”，即“一珠一肽”合成法；反復(fù)比較合成法。在制備CPLL肽庫(kù)時(shí)，以“一珠一肽”合成法為主，以三肽的合成為例(圖2)：A代表丙氨酸，G代表甘氨酸，V代表纈氨酸，將聚甲基丙乙酸酯樹脂球載體均分后，分別放入盛有A、G和V的3個(gè)反應(yīng)器中，待縮合反應(yīng)完成后，將3個(gè)反應(yīng)器中的載體取出，混合均勻，重新平均分裝到3個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行下一輪縮合反應(yīng)。待3次縮合反應(yīng)(分離、結(jié)合和再結(jié)合)完成后，合成得到27種可能序列的三肽。同樣，采用此方法(采用20種氨基酸為原料)可在數(shù)天內(nèi)合成一個(gè)高達(dá)2×106的六肽庫(kù)[28,33]。Thulasiraman等[27]提出合成的配體庫(kù)必須滿足3個(gè)條件：①必須保證有足夠的、可重復(fù)性的、多樣性的配體，以結(jié)合所給復(fù)雜樣品中的每一個(gè)蛋白；②配體與蛋白之間的解離常數(shù)必須與蛋白濃度相兼容；③配體及其組成成分必須與未知的待測(cè)樣品兼容，同時(shí)配體必須具有足夠高的結(jié)合能力來捕獲足夠多的蛋白以便于后續(xù)的檢測(cè)分析。但由于合成過程中會(huì)存在某種蛋白與配體不兼容的情形，且不能保證每個(gè)配體珠與對(duì)應(yīng)的氨基酸均能反應(yīng)完全，所以自組裝合成的配體庫(kù)不一定適合富集待測(cè)樣品中的所有LAP。目前市售的美國(guó)BioRad公司生產(chǎn)的CPLL配體庫(kù)(ProteoMiner)是應(yīng)用最廣泛的六肽配體庫(kù)，其為采用16種不同氨基酸組合而成含1 670萬種的配體庫(kù)[34]。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于人體、動(dòng)物源和植物源等蛋白樣品中LAP的分析研究。

圖2 配體庫(kù)合成步驟示意圖[25]Fig.2 Scheme of combinatorial peptide library synthesis[25]

2 組合肽配體庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 在人體蛋白組研究中的應(yīng)用

LAP對(duì)維持人體正常的生理功能具有獨(dú)特作用，因而對(duì)LAP的研究可以促進(jìn)對(duì)人體局部生理功能的了解。張淵[35]采用CPLL結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)分析了非小細(xì)胞肺癌患者尿液中的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果表明經(jīng)CPLL處理后，尿液外泌體(Exosomes，活細(xì)胞分泌的來源于晚期核內(nèi)體的膜性囊泡)中含有的HAP量明顯減少，并檢測(cè)出512個(gè)LAP(55.36%為可溶性蛋白，44.93%為膜蛋白)，其中374個(gè)在之前的尿蛋白質(zhì)組研究中未見報(bào)道，這些LAP可為非小細(xì)胞肺癌患者的治療提供參考。Bruschi等[36]研究了小兒內(nèi)科患者腹膜透析液的蛋白質(zhì)組學(xué)特征。通過MS鑒定，結(jié)果顯示經(jīng)CPLL富集后的樣品中有5個(gè)HAP(白蛋白、血清鐵傳遞蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-微球蛋白和免疫球蛋白)含量明顯減少，同時(shí)檢測(cè)出約700個(gè)LAP，這些LAP可為該病的進(jìn)一步研究提供參考。Selvaraju等[37]采用CPLL、凝集素親和層析法(Lectin affinity chromatography,LAC)和MS技術(shù)對(duì)乳腺癌患者體內(nèi)的血清蛋白進(jìn)行了富集與鑒定，結(jié)果共鑒定出乳腺癌患者血清中58個(gè)與健康人血清蛋白不同的差異蛋白，其中有17個(gè)屬于LAP。這些LAP可為乳腺癌的進(jìn)一步研究及治療提供依據(jù)，同時(shí)該研究也為CPLL與其他技術(shù)的結(jié)合使用提供了參考。

在樣品預(yù)處理過程中多種因素可能會(huì)影響CPLL富集LAP的效果，因此優(yōu)化樣品預(yù)處理?xiàng)l件可進(jìn)一步提高CPLL富集LAP的效果。為了比較CPLL在離子間相互作用和疏水作用兩種條件下對(duì)蛋白捕獲的影響，Santucci等[38]在生理pH 7.2條件下采用能增加離子間相互作用的低濃度鹽(25 mmol/L NaCl)和能促進(jìn)疏水作用的高濃度鹽(1 mol/L (NH4)2SO4)分別處理人血清蛋白樣品，之后進(jìn)行CPLL富集、雙向電泳分離及MS分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在人血清蛋白樣品鑒定出的305個(gè)蛋白中，52%的蛋白在兩種預(yù)處理?xiàng)l件下共同含有，20%的蛋白在離子間相互作用條件下特有，28%的蛋白在疏水作用條件下特有，即表明該兩種條件均能在一定程度上促進(jìn)CPLL對(duì)LAP的富集。此外，有研究[39-40]報(bào)道CPLL富集過程中會(huì)出現(xiàn)“蛋白損失”的現(xiàn)象，而此研究結(jié)果顯示離子間相互作用條件下的“蛋白損失”為5%，疏水作用條件下無“蛋白損失”，表明這兩種條件均能減小CPLL富集過程中的“蛋白損失”。Thulasiraman等[27]采用CPLL、雙向電泳和MS技術(shù)分析和鑒定人體血清中的LAP。結(jié)果表明相比于未處理樣品(檢測(cè)出195個(gè)蛋白)，經(jīng)CPLL富集后的樣品中檢測(cè)出487個(gè)蛋白，諸如玻璃體結(jié)合蛋白、C3a過敏毒素、C4a過敏毒素、血清淀粉樣蛋白A、載脂蛋白J、C4結(jié)合蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、芳香基酯酶等LAP。在CPLL富集蛋白的過程中，配體珠的性質(zhì)(大小、密度等)會(huì)影響最終的富集結(jié)果，因此該實(shí)驗(yàn)還研究了配體珠與血清樣品間的質(zhì)量比和配體珠大小對(duì)檢測(cè)蛋白量的影響，結(jié)果顯示檢測(cè)到的蛋白量隨血清樣品與配體珠間質(zhì)量比的增加而增加；當(dāng)保持二者質(zhì)量比不變，僅增加或減小所使用的配體珠大小時(shí)，蛋白的檢測(cè)量基本不變。Guerrier等[41]發(fā)現(xiàn)在采用CPLL富集人體血清中的LAP時(shí)，蛋白的富集量隨緩沖溶液的離子強(qiáng)度和pH值的變化而變化，即血清蛋白與CPLL珠間的結(jié)合力與緩沖溶液的離子強(qiáng)度和pH值有關(guān)，因此緩沖溶液的配方要依據(jù)蛋白樣品的性質(zhì)而定。Santucci等[42]在采用CPLL富集人體尿液中的LAP之前，先對(duì)樣品進(jìn)行了超速離心、囊泡分離和丁醇沉淀，最后將得到的蛋白進(jìn)行MS分析。結(jié)果顯示相比于未處理樣品(檢測(cè)出1 176個(gè)尿液蛋白)，從CPLL富集后的人體尿液樣品中檢測(cè)出3 429個(gè)蛋白，其中有1 724個(gè)在尿蛋白質(zhì)組研究中未曾報(bào)道。Candiano等[43]研究了經(jīng)阿利新藍(lán)(Alcian Blue)染料預(yù)處理后的CPLL柱對(duì)人體尿液中LAP的富集效果。MS分析結(jié)果顯示經(jīng)染料修飾后，CPLL富集后的樣品與前期報(bào)道的尿蛋白質(zhì)組相比，新增加了115個(gè)蛋白(包括核苷結(jié)合蛋白、催化反應(yīng)蛋白、陽離子結(jié)合蛋白、糖結(jié)合蛋白、水解酶活性蛋白和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)成分蛋白等)，該結(jié)果表明經(jīng)染料修飾后的CPLL柱有助于富集樣品中某些特定的LAP。此外,Candiano等[40]、Castagna等[44]、Santucci等[45]還從不同洗脫液組成等其他方面對(duì)尿液樣品的CPLL預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，證實(shí)了不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)CPLL富集蛋白作用具有不同程度的影響。

此外，CPLL也可用于富集人腦脊液[46]、膽汁[47]中的LAP。研究表明，人腦脊液的蛋白濃度比人血清蛋白濃度低約500倍，但通過CPLL富集，最終在人腦脊液中鑒定出約800個(gè)蛋白[46]。人的膽汁[47]經(jīng)CPLL富集后共鑒別出新發(fā)現(xiàn)的143個(gè)蛋白。此外，CPLL還用于富集人體血小板[48-49]、紅細(xì)胞[50-52]、骨骼肌[53]和重組單克隆抗體[54]中的LAP，提高了對(duì)其蛋白質(zhì)組的認(rèn)識(shí)水平。

2.2 在動(dòng)物源蛋白組研究中的應(yīng)用

一般情況下對(duì)人體疾病的研究會(huì)先通過相應(yīng)的動(dòng)物模型進(jìn)行初步判斷，因此研究動(dòng)物模型與人體蛋白質(zhì)組的異同對(duì)人體疾病的診斷及提出相應(yīng)的治療方案具有指導(dǎo)意義。為了比較卵巢癌雞血液蛋白與人血液蛋白的異同，Ma等[55]研究了卵巢癌雞的血液蛋白質(zhì)組學(xué)。結(jié)果顯示與傳統(tǒng)的乙腈分離法相比，CPLL能有效去除雞血液中的HAP，并在卵巢癌雞血液中鑒定出264個(gè)蛋白，諸如血液輸送與結(jié)合蛋白、免疫與防御相關(guān)蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制劑、細(xì)胞酶、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與黏附蛋白，其中血液輸送與結(jié)合蛋白、免疫與防御相關(guān)蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與黏附蛋白等與之前報(bào)道的卵巢癌診斷生物標(biāo)記物種類相同，也與報(bào)道的人血液蛋白同源染色體的生物標(biāo)記物種類相同，此結(jié)果為以卵巢癌雞為動(dòng)物模型的人體卵巢癌疾病的研究提供了參考。此外，豬常被用作心血管疾病研究的動(dòng)物模型，如Tu等[39]研究了豬血漿的蛋白質(zhì)組學(xué)，結(jié)果顯示在豬血漿樣品所鑒定的3 421個(gè)蛋白中，55%為采用CPLL富集后的LAP，這些LAP也可成為人體心血管疾病研究中的潛在活性靶標(biāo)。

Cunsolo等[56]則采用CPLL對(duì)山羊奶樣品進(jìn)行了處理，結(jié)果顯示在山羊奶樣品共檢測(cè)出的452個(gè)蛋白中，其中經(jīng)CPLL富集的樣品檢測(cè)出449個(gè)蛋白，是未經(jīng)CPLL處理樣品的8倍。該結(jié)果表明CPLL能顯著提高山羊奶中LAP的檢測(cè)數(shù)量，在哺乳類動(dòng)物的蛋白質(zhì)組研究中有重要作用。張榮春[57]對(duì)尖吻蝮蛇毒中的“隱形蛋白質(zhì)組”進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與粗毒(未處理樣品)相比，經(jīng)CPLL富集后的樣品中10～15 kDa 的HAP含量明顯降低；而30～43 kDa之間豐度較低的LAP得到了富集。另外粗毒中，在20～30 kDa、等電點(diǎn)為7.5～8.5之間基本檢測(cè)不出蛋白點(diǎn)，而經(jīng)CPLL富集后的樣品在此區(qū)域呈現(xiàn)出9個(gè)特異蛋白點(diǎn)。劉怡君等[58]采用CPLL富集雞蛋清中的LAP，并研究了鹽濃度和pH值對(duì)CPLL豐度均衡化效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于未經(jīng)處理的蛋清原液，CPLL富集能使蛋清中的蛋白濃度達(dá)到豐度均衡化的效果，并且富集效率隨鹽濃度與pH值的變化而變化。Farinazzo等[59]研究了雞蛋黃的蛋白質(zhì)組學(xué)，結(jié)果表明經(jīng)CPLL富集后的樣品鑒別出的蛋白量是未處理樣品的2倍多。此外用CPLL富集海膽體腔液[60]蛋白的研究也發(fā)現(xiàn)，在未使用CPLL富集之前只檢測(cè)出26個(gè)蛋白，而富集后的蛋白點(diǎn)檢測(cè)量達(dá)到82個(gè)。

2.3 在植物源蛋白組研究中的應(yīng)用

植物中的LAP可能與植物產(chǎn)生抗病毒、抗炎等作用相關(guān)，也可能與植物自身的新陳代謝過程有關(guān)[4]，因此對(duì)植物中LAP的分析和鑒定具有重要意義。植物中LAP的富集方法有PEG分級(jí)沉淀法[18-23]等，但CPLL具有去除HAP作用的同時(shí)能富集LAP的特殊性質(zhì)，因而被廣泛應(yīng)用于植物源蛋白質(zhì)組的研究，如富集植物中的LAP來分析其對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，檢測(cè)植物中的低豐度過敏原以及飲料真實(shí)性等。

為了研究金銀花未成熟花芽產(chǎn)生抗炎、抗病毒、抗真菌等生物活性的潛在分子機(jī)制，Zhu等[61]分別用CPLL富集法與PEG分級(jí)沉淀法處理金銀花未成熟花芽中的蛋白。結(jié)果表明，在空白樣品、經(jīng)CPLL富集后的樣品和經(jīng)PEG分級(jí)沉淀后的樣品中分別檢測(cè)出177，614，529個(gè)蛋白，僅在采用CPLL富集和PEG分級(jí)沉淀后的樣品中檢測(cè)出與氧化磷酸戊糖途徑、激素代謝和運(yùn)輸相關(guān)的蛋白。此外，在金銀花未成熟花芽檢測(cè)出的所有蛋白中含有28個(gè)與次生代謝相關(guān)的蛋白。人參因具有抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等多種藥理活性，而作為一種保健中藥被廣泛使用，但對(duì)其蛋白成分的研究較少。Colzani等[62]對(duì)人參根的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析與鑒定，結(jié)果顯示，在采用CPLL富集后的人參根中檢測(cè)出207個(gè)蛋白，其中有55個(gè)在人參數(shù)據(jù)庫(kù)中得以匹配，其余的152個(gè)在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中得以匹配，這些蛋白主要為結(jié)構(gòu)相關(guān)酶(19.2%)、氧化還原酶(19.5%)、脫氫酶(7.6%)和合成酶(9%)。為了研究與生物堿合成相關(guān)的LAP，章燕珍[3]采用CPLL和雙向電泳技術(shù)研究十大功勞葉的蛋白質(zhì)組。結(jié)果顯示相比于未處理樣品，CPLL富集后的樣品檢測(cè)出91個(gè)新蛋白點(diǎn)、26個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中包含血根堿合成酶、異黃酮還原酶和苯丙氨酸解氨酶3個(gè)與次生代謝相關(guān)的蛋白，同時(shí)這些檢測(cè)出的蛋白與光合作用、氮代謝和膽固醇代謝等生物代謝過程相關(guān)。

植物細(xì)胞壁中多糖占90%～95%，蛋白質(zhì)僅占5%～10%，但這少量的蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁的可塑性發(fā)育過程和響應(yīng)環(huán)境線索中發(fā)揮著重要作用，因此如何富集細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)顯得尤為重要。Nguyen-Kim等[63]采用CPLL和MS技術(shù)研究了擬南芥根細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)組學(xué)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在擬南芥根細(xì)胞壁共檢測(cè)出的1 534個(gè)蛋白質(zhì)中，經(jīng)CPLL富集后的樣品有1 458個(gè)(含有大量未曾報(bào)道的LAP)，是未富集樣品的2.8倍。此研究是首次利用CPLL研究植物細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)組學(xué)，證實(shí)了CPLL是深入分析細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)的一種有效的樣品前處理方法，可以促進(jìn)對(duì)植物細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組的深入研究。另外，Boschetti等[64]采用CPLL富集了玉米種子中的LAP，結(jié)果顯示經(jīng)CPLL富集后的樣品的HAP(如凝集素)含量明顯減少，其蛋白檢測(cè)量是未處理樣品的2倍多。此外，CPLL富集技術(shù)也應(yīng)用于菠菜[65]、柏樹花粉[66]、擬南芥葉與南瓜韌皮部[67]、朝鮮薊葉(富含LAP)[68]、寧夏枸杞[69]的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

當(dāng)人體在攝入非人體組成的外源蛋白后可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)，從而傷害機(jī)體的一些正常細(xì)胞、組織和器官，嚴(yán)重者甚至?xí){到生命安全，因此對(duì)于食物中過敏原蛋白(通常含量較低)的檢測(cè)顯得尤為重要[70]，食物中的LAP經(jīng)CPLL富集、雙向電泳分離和MS分析后可使其含有的低豐度過敏原得到檢測(cè)與鑒定。Righetti等[71-74]采用上述方法研究了3種熱帶水果(鱷梨、香蕉和芒果)的蛋白質(zhì)組學(xué)特征。結(jié)果顯示，在鱷梨果肉[71]檢測(cè)出的1 012個(gè)蛋白中含有鱷梨過敏原Pers a1，還含有抑制蛋白、聚半乳糖醛酸酶、類甜蛋白、葡聚糖酶和類異黃酮還原酶蛋白等易受過敏原影響的蛋白。在香蕉果肉[72]中檢測(cè)出1 131個(gè)蛋白(經(jīng)CPLL富集后的樣品檢測(cè)出819個(gè)蛋白)，其中包含芭蕉屬a1、果膠酯酶、過氧化物歧化酶等過敏原，還包含降解淀粉顆粒的酶、與成熟期緊密相關(guān)的酶。芒果[73]的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，芒果果皮含有334個(gè)蛋白，芒果果肉的蛋白數(shù)量高達(dá)2 855個(gè)，并且經(jīng)CPLL富集后的果皮與果肉樣品的蛋白檢測(cè)量均占總蛋白檢測(cè)量的70%以上。芒果中含有非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、過氧化物歧化酶、類小麥萌發(fā)素蛋白和抑制蛋白4種過敏原蛋白，其中只在芒果皮中檢測(cè)出非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和類小麥萌發(fā)素蛋白，這是由于此兩種蛋白與芒果皮的抵御和轉(zhuǎn)移功能有關(guān)。此外，Righetti團(tuán)隊(duì)還分析了檸檬皮與檸檬果肉[75]中的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬皮與檸檬果肉分別檢測(cè)出1 011個(gè)和674個(gè)蛋白，其中經(jīng)CPLL富集后的蛋白檢測(cè)數(shù)量分別是未處理樣品的8倍和4倍。同時(shí)檸檬皮中含有Cit s1、抑制蛋白和Cit s3三種過敏原蛋白，檸檬果肉中也含有Cit s1和Cit s2兩種過敏原蛋白。Esteve等[76]也采用相同方法分析了橄欖果肉和橄欖種子的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在橄欖種子檢測(cè)出的61個(gè)蛋白中含有種子儲(chǔ)藏蛋白、油脂蛋白和組蛋白等LAP，在橄欖果肉檢測(cè)出的231個(gè)蛋白中含有類奇異果甜蛋白過敏原。

由于飲料中的蛋白含量相對(duì)較低，必須通過富集才能檢測(cè)其中的蛋白質(zhì)，通常可通過CPLL富集、雙向電泳分離及MS分析飲料中的蛋白。Righetti團(tuán)隊(duì)最早將CPLL富集技術(shù)用于酒精性飲料中的蛋白質(zhì)檢測(cè)，采用上述方法分析了啤酒[77]中的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的啤酒含有20個(gè)不同的大麥蛋白、40個(gè)啤酒酵母菌蛋白、1個(gè)貝酵母菌蛋白、1個(gè)巴氏酵母菌蛋白和2個(gè)玉米蛋白，該結(jié)果表明所檢測(cè)的啤酒可能由大麥和玉米經(jīng)過多重發(fā)酵制得。隨后Righetti等[78-79]用CPLL分別富集了白葡萄酒和意大利紅葡萄酒中的LAP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的酪蛋白濃度分別為1 μg/L和3.8 μg/L，均符合檢驗(yàn)要求，還發(fā)現(xiàn)意大利紅葡萄酒中含有屬于釀酒酵母和植物病原體與真菌(如灰葡萄孢霉、核盤菌和棘孢曲霉)的LAP。為了驗(yàn)證商業(yè)酒的真實(shí)性，Righetti等對(duì)比了自制白酒和商業(yè)西娜爾利口酒[68]、自制檸檬酒和市售檸檬酒[75]中的蛋白組分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在自制的白酒中檢測(cè)出18個(gè)在西娜爾利口酒中未檢測(cè)出的蛋白；自制檸檬酒含有24個(gè)蛋白，而市售檸檬酒僅含有8個(gè)蛋白。另有研究對(duì)開胃酒(AmaroBraulio)[80-81]和香檳酒[82]中的蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在開胃酒檢測(cè)出的93個(gè)蛋白中，除33個(gè)蛋白未歸屬外，其余60個(gè)蛋白(含部分共有蛋白)中，6個(gè)屬于蜂蜜、11個(gè)屬于橙皮、29個(gè)屬于龍膽屬藤黃、46個(gè)屬于當(dāng)歸蘆荀；在香檳酒檢測(cè)的43個(gè)蛋白中，12個(gè)屬于釀酒葡萄、7個(gè)屬于釀酒酵母，其余屬于綠色植物有機(jī)體。

CPLL還可用于富集非酒精性飲料中的LAP。例如，杏仁乳和杏仁糖漿[83]、椰奶[84]、可樂[85]、姜汁[86]、橄欖油[87]、白葡萄醋[88]和口服補(bǔ)液[89]中的LAP通過CPLL富集得到了很好的檢測(cè)。經(jīng)CPLL富集后在杏仁乳中[83]檢測(cè)出了137個(gè)蛋白，含有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白過敏原和鈣調(diào)蛋白、抑制蛋白、Pru2蛋白和磷酸甘油醛脫氫酶等潛在過敏原，在杏仁糖漿中檢測(cè)出了14個(gè)蛋白均屬于苦杏仁提取物，以此證明了杏仁糖漿原料的來源。椰奶[84]的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，在椰奶檢測(cè)出的307個(gè)蛋白中有200個(gè)是通過CPLL富集后得到。為了驗(yàn)證可樂飲料的原料是否來源于植物常青樹堅(jiān)果(可樂果)，D’Amato等[85]采用CPLL富集可樂飲料中的LAP，結(jié)果顯示經(jīng)CPLL富集后，在1 L裝的可樂飲料中檢測(cè)出屬于可樂果和龍舌蘭的分子量在15～20 kDa范圍的LAP，此結(jié)果與該飲料商業(yè)標(biāo)簽中公布的信息一致(飲料中摻入6%的龍舌蘭糖漿)。而姜汁[86]的分析結(jié)果顯示，檢出5個(gè)葡萄蛋白和1個(gè)蘋果蛋白，未檢測(cè)出任何生姜蛋白，但味覺測(cè)試(舌頭有辛辣刺痛感)證明有生姜提取物的存在，未檢測(cè)出生姜蛋白是因?yàn)橄鄬?duì)于葡萄汁和蘋果汁的存在，生姜提取物的含量太低。橄欖油[87]的蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，橄欖油含有組蛋白H4和細(xì)胞色素P450等3個(gè)來源于植物的蛋白，也含有7個(gè)來源于細(xì)菌的蛋白。此前已有研究者對(duì)CPLL富集技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述[90-92]，這些研究將為CPLL應(yīng)用于更多的食品分析提供參考。

3 總結(jié)與展望

LAP是生物體各種生物過程的重要蛋白，參與到生命活動(dòng)過程中的各個(gè)方面，因而對(duì)生物體的LAP進(jìn)行研究具有十分重要的意義。CPLL是富集LAP的有效方法之一，如前所述CPLL在人體、動(dòng)物源和植物源等蛋白組研究中已有廣泛的應(yīng)用。然而，有研究[27,46]報(bào)道在CPLL富集蛋白的過程中會(huì)出現(xiàn)“蛋白損失”的情況，即原始粗提物中的某些蛋白在經(jīng)CPLL富集后會(huì)“損失”，從而影響這些蛋白的檢測(cè)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要有以下原因：①不是所有蛋白均能與配體庫(kù)相匹配；②洗脫時(shí)的洗脫條件不足以破壞蛋白與CPLL間較強(qiáng)的相互作用力，導(dǎo)致部分蛋白還保留在CPLL柱上；③洗脫條件破壞了蛋白與CPLL間較弱的相互作用力，導(dǎo)致部分蛋白隨洗脫液被洗脫；④某些次級(jí)代謝物可能干擾部分蛋白的結(jié)合與洗脫。此外，對(duì)樣品進(jìn)行處理時(shí)，商品化CPLL柱要求蛋白進(jìn)入量為10～50 mg[33]，一般而言提純后的蛋白輸出量(通常是進(jìn)入量的2%～5%)足夠用于后續(xù)的蛋白分析，但對(duì)大多數(shù)植物蛋白樣品而言，高濃度的蛋白進(jìn)入量要求較難達(dá)到。另外，研究[27]發(fā)現(xiàn)HAP被飽和后，洗脫掉未結(jié)合的HAP使得這些HAP不能被定量。同時(shí)LAP的模擬實(shí)驗(yàn)也顯示只有CPLL珠不被飽和，樣品中的蛋白方能進(jìn)行定量分析[93]，亦即被飽和的蛋白不能進(jìn)行定量分析。

針對(duì)上述局限性，為提高CPLL的富集率，有研究[47,94]顯示，在不影響CPLL的整體富集效率時(shí)，適當(dāng)減小CPLL珠的體積可以相應(yīng)減少蛋白的進(jìn)樣量。同時(shí)研究[60]發(fā)現(xiàn)在用CPLL富集植物樣品的蛋白前，先使用酚萃取和丙酮洗滌等步驟除去植物蛋白中的次級(jí)代謝物，將使得CPLL的蛋白富集效果得到顯著提高。此外也有研究[95-96]顯示在不同pH值條件下CPLL可選擇性富集陽離子蛋白或陰離子蛋白，低離子強(qiáng)度與高離子強(qiáng)度下的富集結(jié)果也有所不同，而易溶鹽條件有利于富集疏水性蛋白，分餾解吸條件有利于提高蛋白的檢測(cè)量。

近年來，隨著CPLL的發(fā)展，蛋白質(zhì)組和基因組的研究已經(jīng)緊密相連，這不僅促進(jìn)了基因組的發(fā)展，同時(shí)也將推動(dòng)蛋白質(zhì)組分析的發(fā)展。經(jīng)CPLL富集后的蛋白在進(jìn)行2-D電泳分離后，其差異蛋白可再進(jìn)行MS分析，主要有以下方式：①基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量法(MALDI-TOF MS)，鑒定該多肽源自何種蛋白，即多肽質(zhì)量指紋分析。②電噴霧電離質(zhì)譜測(cè)量法(ESI-MS)，通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的質(zhì)譜獲得多肽的氨基酸序列，從而使蛋白的鑒定更準(zhǔn)確可靠。③表面增強(qiáng)激光解析離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF MS)，該技術(shù)適合不同來源的樣品比較。④傅立葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜法(FTICR-MS)，該方法便于實(shí)現(xiàn)串聯(lián)質(zhì)譜分析，可完成多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析?？傊?，CPLL已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最多的一種LAP富集技術(shù)，而2-D電泳和MS分析則成為分離和鑒定蛋白最為重要的技術(shù)。

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Progress in Research of Combinatorial Peptide Ligand Libraries for Protein Enrichment

FAN Jiao-jiao1,LI Su-ying2,LI Chun-hong1,CHEN Hua1,XIA Zhi-ning1,YANG Feng-qing1*

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University,Chongqing 400031,China; 2.Department of Pharmacy,Henan Medical College,Zhengzhou 451191,China)

The low-abundance proteins play an important role in the biological activity of living organisms,involving in many physiological or pathological processes,such as metabolism,transcription and translation.Therefore,the analysis and identification of low-abundance proteins are vital in the study of proteomics.Combinatorial peptide ligand library(CPLL) is an effective method for the enrichment of low-abundance proteins,and the detection and identification of low-abundance proteins could be achieved after treated by CPLL.According to studies on the CPLL reported in recent years,its applications in different fields including the studies on low-abundance proteins in human,animal and plant protein samples were reviewed.The main purpose of this review is to provide a reference for future researches and applications of CPLL.

low-abundance proteins;combinatorial peptide ligand library;proteomics;research progress;review

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.024

2016-07-11；

2016-07-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202886，21275169)

*通訊作者：楊豐慶，博士，教授，研究方向：藥物分析、色譜分析，Tel:13617650637，E-mail:fengqingyang@cqu.edu.cn

O629.7;O657.7

A

1004-4957(2017)01-0136-09