邱楠楠，董桂賢，陳達(dá)煒*，周 爽，趙云峰

(1.國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心/衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2.煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心，山東 煙臺(tái) 264003)

自組裝管尖固相萃取/超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定水果中的15種酸性農(nóng)藥

邱楠楠1，董桂賢2，陳達(dá)煒1*，周 爽1，趙云峰1

(1.國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心/衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2.煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心，山東 煙臺(tái) 264003)

建立自組裝管尖固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)水果中15種酸性農(nóng)藥殘留的分析方法。水果樣品經(jīng)甲酸-乙腈(1∶99，體積比)提取后，以官能化聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)和親水作用色譜(HILIC)作為吸附填料進(jìn)行管尖固相萃取凈化。以T3色譜柱進(jìn)行色譜分離，采用高分辨質(zhì)譜的tSIM/ddMS2掃描模式進(jìn)行定性、定量分析，內(nèi)標(biāo)法測(cè)定。15種酸性農(nóng)藥在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。方法的定量下限(LOQ)為0.2～10 μg/kg。在LOQ,10 μg/kg，100 μg/kg加標(biāo)水平下，15種酸性農(nóng)藥的回收率為73.5%～115.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～8.3%。該方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于水果中酸性農(nóng)藥殘留的分析測(cè)定，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

管尖固相萃??；超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法；水果；酸性農(nóng)藥

隨著化學(xué)工業(yè)的發(fā)展，除草劑的品種日漸增多，在全球農(nóng)藥的銷售中除草劑約占市場(chǎng)一半份額。酸性農(nóng)藥作為除草劑中的重要種類之一，被用作植物小麥、玉米等除草劑和植物生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑，可以防止植物落花落果，誘導(dǎo)無(wú)籽果實(shí)形成，在世界各國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。近些年，酸性農(nóng)藥作為果實(shí)保鮮劑應(yīng)用于水果中[1]。研究表明，許多酸性農(nóng)藥本身具有中等毒性，可以引起人類軟組織惡性腫瘤,如2,4-滴具有Ⅰ等毒性，可能與非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)[2-3]；同時(shí)，酸性農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物能夠長(zhǎng)時(shí)間存在于被噴灑的雜草和有害植物中，對(duì)人類和動(dòng)物產(chǎn)生毒性危害，動(dòng)物體甚至能夠表現(xiàn)出胎盤毒性[4]。鑒于酸性農(nóng)藥的潛在危害性，為了保障人們的食用安全，許多國(guó)家都針對(duì)這些農(nóng)藥制定了最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(MRLs)，項(xiàng)目逐漸增多，限量標(biāo)準(zhǔn)日漸嚴(yán)格，因此對(duì)酸性農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析方法研究也日益迫切。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的酸性農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-7]、高效液相色譜法(LC)和高效液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[8-9]，研究的基質(zhì)包括地表水、蔬菜、糧谷、茶葉以及水果。酸性農(nóng)藥因含有羧基或羥基等極性基團(tuán)，部分化合物的極性較大、沸點(diǎn)較高、難以氣化，因此采用GC-MS不能直接測(cè)定，需經(jīng)柱前衍生的方式，操作較為繁瑣；而LC-MS則較適用于此類型化合物的檢測(cè)分析。當(dāng)前的前處理方法通常包括固相萃取柱(SPE)和分散固相萃取(DSPE)[10-13]。常規(guī)的SPE凈化步驟繁瑣，操作復(fù)雜，常需額外的預(yù)濃縮，導(dǎo)致回收率不理想；采用DSPE凈化，雖然無(wú)需對(duì)分析液進(jìn)行濃縮，但去除基質(zhì)干擾的能力有限?；诂F(xiàn)有SPE和DSPE凈化技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，本研究組開發(fā)了一種自組裝的管尖固相萃取技術(shù)(Pipette tip solid-phase extraction,PTSPE)，其具有操作簡(jiǎn)單，無(wú)需離心、氮吹等操作，且凈化效果好等特點(diǎn)[14]。本實(shí)驗(yàn)以水果為研究對(duì)象，采用PTSPE凈化，首次以官能化聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)和親水作用色譜(HILIC)作為吸附填料，結(jié)合超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(UPLC-HRMS)建立了水果中15種酸性農(nóng)藥的檢測(cè)方法。本方法快速、簡(jiǎn)單、靈敏、可靠，能夠滿足國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求，適用于對(duì)水果中酸性農(nóng)藥殘留的定性定量分析，已應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(Q Exactive)及Dionex UltiMate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Thermo公司)；渦旋混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)；Sigma 3K15高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)，甲酸(HPLC級(jí)，Tedia公司)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉(分析純，國(guó)藥試劑有限公司)；酸性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品及2,4-D-13C6同位素內(nèi)標(biāo)(純度>98%，德國(guó)DR.Ehrenstorfer公司)；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。PEP和HILIC粉購(gòu)自天津博納艾杰爾公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各酸性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，冷凍(-18 ℃以下)貯存。用50%乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，冷藏(約4 ℃)貯存。

1.3 自組裝的PTSPE

圖1 自組裝管尖固相萃取示意圖Fig.1 Self-assembly pipette tip solid-phase extraction procedure

PTSPE作為一種小型化的SPE模式，具有操作簡(jiǎn)單、快捷、填料用量少等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物樣品的痕量檢測(cè)分析[14-16]。本實(shí)驗(yàn)開發(fā)的自組裝PTSPE裝置如圖1所示，主要由兩根移液槍頭(200 μL和1 mL)和accu-jet?電動(dòng)控制移液器組成。首先，用脫脂棉堵住200 μL槍頭底部，將吸附填料裝入至槍頭中，上端再用脫脂棉封口；然后上接1 mL槍頭，將其套入電動(dòng)控制移液器中，通過(guò)電動(dòng)控制移液器進(jìn)行樣品上下循環(huán)的吸液、放液以完成樣品凈化。

1.4 樣品處理

1.4.1 提 取取水果樣品10 g(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，添加1 mg/L 2,4-D-13C6內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，渦旋混勻后加入10 mL的甲酸-乙腈溶液(1∶99)，渦旋提取5 min，加入2 g氯化鈉和8 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋30 s后，以5 000 r/min離心5 min。取上清液，待凈化。

1.4.2 PTSPE凈化取上清液0.5 mL進(jìn)行PTSPE凈化，PTSPE柱中填有20 mg PEP和20 mg HILIC填料，通過(guò)5次上下吸液、放液循環(huán)吸附凈化后，取0.4 mL凈化液，加入0.4 mL水，混勻過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，注入U(xiǎn)PLC-HRMS分析測(cè)定。

1.5 色譜與質(zhì)譜條件

UPLC色譜條件：流動(dòng)相A為含0.05‰甲酸的水溶液，B為乙腈。梯度洗脫：0～2 min，5%B；2～10 min，5%～90%B；10～11.5 min，90%～100%B；11.5～15 min，100%～5%B；15～16 min，5%B。進(jìn)樣量：5 μL；流速:300 μL/min；柱溫：40 ℃；Waters Acquity UPLC BEH T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)進(jìn)行分離。

質(zhì)譜條件:采用HESI 離子化方式；噴霧電壓3.5 kV；毛細(xì)管溫度325 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣40 arb，輔助氣10 arb；掃描模式為tSIM/ddMS2，正、負(fù)離子采集模式；tSIM采集采用70 000 FWHM分辨率，Maximum IT為100 ms，MSX為4，Isolation window為4m/z；ddMS2采集分辨率為17 500 FWHM，Loop Count為1，TopN設(shè)為5，碰撞裂解能量(NCE)為35 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

采用BEH T3色譜分析柱，比較了純水、含0.1%甲酸和4 mmol/L甲酸銨的水溶液、含0.1%甲酸的水溶液和含0.05‰甲酸的水溶液作為流動(dòng)相A，以及甲醇、乙腈和含0.1%甲酸的乙腈溶液作為流動(dòng)相B的效果。結(jié)果表明，流動(dòng)相采用乙腈-水的分析時(shí)間比甲醇-水的分析時(shí)間更短，并且能夠提高一些保留時(shí)間較為相近的酸性農(nóng)藥的分離度，因此選用乙腈-水作為分離體系。以該體系為流動(dòng)相分離時(shí)，氯氨吡啶酸、二氯吡啶酸和毒莠定的出峰時(shí)間過(guò)早，可能是由于在純水流動(dòng)相中，這些酸性農(nóng)藥形成內(nèi)鹽，造成這3種化合物在色譜柱的保留較差；而在流動(dòng)相中添加0.1%甲酸和4 mmol/L甲酸銨后，部分化合物不出峰或響應(yīng)下降，主要是酸性介質(zhì)抑制了這些化合物的負(fù)離子采集。而以含0.05‰甲酸的水溶液和乙腈溶液為流動(dòng)相分離時(shí)，15種酸性農(nóng)藥均出峰，并保持較好的響應(yīng)以及色譜分離，因此，本實(shí)驗(yàn)以此流動(dòng)相體系作為15種酸性農(nóng)藥的色譜分離條件(圖2)。

2.2 高分辨質(zhì)譜的篩查分析

Full Scan和tSIM是高分辨質(zhì)譜Q Orbitrap最為常用的兩種定量篩查模式，其均以精確母離子進(jìn)行定量，無(wú)需繁瑣的參數(shù)優(yōu)化過(guò)程。前期工作中，本研究組發(fā)現(xiàn)由于tSIM采集模式具有更窄的監(jiān)測(cè)掃描范圍，從而較Full Scan模式具有更好的信號(hào)響應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)采用tSIM/ddMS2掃描模式，先通過(guò)目標(biāo)化合物的精確母離子進(jìn)行tSIM采集，以此采集響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行定量分析；同時(shí)tSIM采集后觸發(fā)該母離子下的二級(jí)質(zhì)譜ddMS2采集，獲得目標(biāo)物的二級(jí)質(zhì)譜圖，進(jìn)而以二級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行定性確證。以氯氨吡啶酸為例，圖3A為tSIM采集所獲得的母離子m/z206.972 2[M+H]+下的離子色譜圖；圖3B為觸發(fā)該母離子ddMS2采集下的二級(jí)質(zhì)譜圖譜，以精確的二級(jí)質(zhì)譜碎片m/z178.976 6和149.022 7進(jìn)行定性確證。15種酸性農(nóng)藥的母離子和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息見(jiàn)表1。

2.3 凈化方法的選擇及優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用PTSPE程序完成樣品的凈化，與DSPE凈化相比，其具有更好的凈化效果，主要是由于DSPE凈化屬于一次性分散型凈化，而PTSPE凈化屬于小型化SPE柱，同時(shí)借助于電動(dòng)控制移液器可進(jìn)行樣品上下式循環(huán)的凈化，充分發(fā)揮PTSPE的凈化效果。此外，吸附填料的選擇是保證PTSPE凈化效果的關(guān)鍵。在常規(guī)DSPE凈化中，PSA，C18和GCB是3種最為常用的分散型吸附填料。由于15種酸性農(nóng)藥含有芳香官能基團(tuán)和酸性官能團(tuán)，這決定了PSA和GCB填料會(huì)對(duì)酸性農(nóng)藥產(chǎn)生明顯的吸附，從而影響目標(biāo)物的回收率。目前，現(xiàn)有文獻(xiàn)基本采用C18為吸附填料用于DSPE凈化，但凈化效果受到一定影響，導(dǎo)致目標(biāo)物仍存在一定的基質(zhì)效應(yīng)[1]。由于水果樣品基質(zhì)中含有較多的糖、小分子有機(jī)酸和氨基酸等極性化合物，本實(shí)驗(yàn)采用親水性的HILIC吸附填料，能夠?qū)O性化合物雜質(zhì)較好的吸附，并結(jié)合聚合型反相填料PEP，從而充分地對(duì)水果樣品進(jìn)行凈化。為了得到較好的凈化效果，采用單因素分析對(duì)影響PTSPE過(guò)程的主要因素(填料用量、吸附循環(huán)次數(shù))進(jìn)行優(yōu)化，以目標(biāo)物在凈化液中的基質(zhì)效應(yīng)為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示：使用20 mg PEP和20 mg HILIC填料，通過(guò)5次吸附循環(huán)后，可獲得最佳的凈化效果。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

用50%乙腈配制各系列濃度范圍的15種酸性農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)稱取空白的蘋果、圣女果和草莓樣品，按照“1.4”方法進(jìn)行提取凈化，用空白樣品液配制系列同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，比值越接近1.0表示基質(zhì)效應(yīng)越弱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15種酸性農(nóng)藥在蘋果、草莓、圣女果3種水果基質(zhì)中的斜率比值分別為0.91～1.05,0.98～1.20,0.96～1.09，均在0.91～1.20之間；根據(jù)Frenich等[18]的研究結(jié)果，基質(zhì)效應(yīng)在0.8～1.2 之間為存在弱的基質(zhì)效應(yīng)，是可以接受的，而超出此范圍則認(rèn)為存在強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。然而，部分酸性農(nóng)藥在草莓樣品中仍存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。為了準(zhǔn)確定量不同水果樣品中的酸性農(nóng)藥，確保定量分析結(jié)果的可靠性，本實(shí)驗(yàn)3種水果均以2,4-D-13C6作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)定量。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

將15種酸性農(nóng)藥配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.5”分析條件，濃度由低到高的順序依次進(jìn)樣分析，內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L。結(jié)果表明，酸性農(nóng)藥在各自的系列濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99(見(jiàn)表1)。分別添加低水平的酸性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于空白水果樣品中，按照已建立的方法對(duì)含15種酸性農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定和分析，分別以3倍和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得到本方法的LOD為0.1～3.0 μg/kg，LOQ為0.2～10 μg/kg(見(jiàn)表1)。

表1 15種酸性農(nóng)藥的線性關(guān)系、質(zhì)譜信息、檢出限以及定量下限

Y:peak area ratio of analyte to the internal standard;X:mass concentration of analyte(μg/L)

2.6 準(zhǔn)確度與精密度

分別取蘋果、圣女果和草莓樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為L(zhǎng)OQ，10 μg/kg，100 μg/kg，按照“1.4”方法對(duì)3種水果樣品提取凈化后，分析測(cè)定，每個(gè)濃度水平重復(fù)5次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表2。在3個(gè)加標(biāo)水平下，酸性農(nóng)藥在蘋果樣品中的回收率為77.8%～112.8%，RSD為1.0%～8.3%；在圣女果樣品中的回收率為73.5%～111.5%，RSD為1.1%～7.6%；在草莓樣品中的回收率為73.9%～115.9%，RSD為1.2%～6.6%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

利用本方法對(duì)北京市售的10份蘋果、5份圣女果和6份草莓樣品進(jìn)行15種酸性農(nóng)藥的殘留檢測(cè)，其中3份蘋果樣品檢出2,4-滴，含量為10.7～82.1 μg/kg，2份蘋果樣品檢出MCPA，含量為4.2～12.7 μg/kg，其它樣品均未檢出15種酸性農(nóng)藥殘留。

表2 空白樣品的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

(續(xù)表2)

3 結(jié) 論

本研究建立了一套自組裝PTSPE前處理技術(shù)應(yīng)用于水果中15種酸性農(nóng)藥殘留的凈化，并首次以PEP和HILIC填料作為凈化吸附填料應(yīng)用于管尖固相萃取技術(shù)。該前處理技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快捷、填料用量少，與DSPE技術(shù)相比，具有更好的凈化效果。結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)，使該方法的靈敏度、準(zhǔn)確性和精密度等技術(shù)指標(biāo)均能夠滿足國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求，適用于對(duì)水果中酸性農(nóng)藥殘留的定性定量分析，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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QIU Nan-nan1,DONG Gui-xian2,CHEN Da-wei1*,ZHOU Shuang1,ZHAO Yun-feng1

(1.China National Centre for Food Safety Risk Assessment/Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment,Ministry of Health,Beijing 100021，China；2.Yantai Center for Diseases Prevention and Control,Yantai 264003，China)

A self-assembly pipette tip solid-phase extraction(PTSPE)/high-resolution benchtop Q Exactive mass spectrometric(HRMS) method for the analysis of 15 acidic pesticides in fruit was established.The samples were first extracted with 1%formic acid in acetonitrile,and then the extracts were cleaned up using PTSPE procedure with the adsorbent of PEP and HILIC.The chromatographic analysis was performed on a T3 column.And the qualitative and quantitative analyses were performed under tSIM/ddMS2mode by high resolution mass spectrometry.The internal standard calibration was used for quantification,and the method showed a good linearity(r2>0.99) in a certain concentration range for the 15 acidic pesticides.The limits of quantitation(LOQ) were between 0.2 μg/kg and 10 μg/kg.The recoveries of the analytes in apples,cherry tomatoes and strawberries samples at spiked levels of LOQ,10 μg/kg and 100 μg/kg ranged from 73.5%to 115.9%,with relative standard deviations(RSDs) of 1.0%-8.3%.The results showed that the method was sensitive and accurate,and was suitable for the analysis of acidic pesticides in fruit．

pipette tip solid-phase extraction(PTSPE)；ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry(UPLC-HRMS); fruit; acidic pesticides

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.005

2016-09-28；

2016-11-07

國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心高層次人才隊(duì)伍建設(shè)523項(xiàng)目

*通訊作者：陳達(dá)煒，博士，副研究員，研究方向：食品衛(wèi)生，Tel：010-67779768，E-mail:chendw@cfsa.net.cn

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2017)01-0031-06