秦 艷，尹建兵，杜冬生，曹 捷，尹成樂(lè)，程志紅*

(1.復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院 生藥學(xué)教研室，上海 201203；2.浙江省醫(yī)療器械不良事件監(jiān)測(cè)中心，浙江 杭州 311121)

中藥紫花地丁黃酮碳苷類化學(xué)成分的超高效液相色譜-電噴霧離子源-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜研究

秦 艷1，尹建兵2，杜冬生1，曹 捷1，尹成樂(lè)1，程志紅1*

(1.復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院 生藥學(xué)教研室，上海 201203；2.浙江省醫(yī)療器械不良事件監(jiān)測(cè)中心，浙江 杭州 311121)

采用超高效液相色譜-電噴霧離子源-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-QTOF-MS/MS)方法，以中藥紫花地丁中分離得到的5個(gè)黃酮碳苷化合物為對(duì)照品，研究了黃酮二糖碳苷類化合物在ESI-QTOF-MS/MS質(zhì)譜中的裂解規(guī)律。研究進(jìn)一步證實(shí)了文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮二糖碳苷C-6位取代糖基較C-8位糖更易優(yōu)先發(fā)生裂解；但同時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中如果含有不穩(wěn)定構(gòu)象的糖基取代時(shí)，該規(guī)律不再適用。通過(guò)對(duì)照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并結(jié)合文獻(xiàn)和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，成功表征和鑒定了紫花地丁中21個(gè)黃酮二糖碳苷類以及4個(gè)黃酮氧苷類成分。該方法能快速、靈敏、準(zhǔn)確地對(duì)中藥中微量黃酮碳苷類成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征和鑒定。

紫花地??；黃酮碳苷；四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

紫花地丁為堇菜科堇菜屬植物紫花地丁ViolayedoensisMakino的干燥帶根全草，其性寒，味苦、辛；具有清熱解毒和涼血消腫的功效，用于治療疔瘡腫毒、癰疽發(fā)背、丹毒和毒蛇咬傷等[1]。該植物主要含有黃酮及其苷類、香豆素及其苷類和倍半萜類等多種化學(xué)成分[2-4]。其中黃酮類成分具有顯著的抗菌和抗氧化等活性[2,5]，是紫花地丁最為重要的活性成分之一。紫花地丁中的黃酮類成分主要為碳苷類[2,6]，這類成分不同于黃酮氧苷，其糖部分很難水解，且由于苷元和糖端基碳之間C—C鍵的旋轉(zhuǎn)，造成了該類化合物核磁共振(NMR)信號(hào)的嚴(yán)重展寬[7]，不利于該類化合物的結(jié)構(gòu)解析。一般需在較高的樣品量和高溫NMR(大于60 ℃)中才能獲得分辨率較好的NMR信號(hào)。因此對(duì)于該類化合物的結(jié)構(gòu)研究，采用傳統(tǒng)的NMR法是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。而采用靈敏度高的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析和檢測(cè)中藥中的微量黃酮碳苷類成分具有重要的科學(xué)意義。

筆者所在課題組前期采用高效液相色譜-電噴霧離子源-離子阱-多級(jí)質(zhì)譜(HPLC-ESI-IT-MSn)法對(duì)紫花地丁中的黃酮碳苷類成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了該類成分在離子阱質(zhì)譜中的裂解規(guī)律[8]。但該方法是在HPLC中分離，且經(jīng)MS5級(jí)裂解對(duì)黃酮碳苷化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。而關(guān)于紫花地丁中的該類化合物在超高效液相色譜(UPLC)并結(jié)合四極桿飛行時(shí)間(QTOF)高分辨質(zhì)譜中的裂解行為，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首先對(duì)從紫花地丁中分離鑒定的5個(gè)黃酮碳苷類化合物進(jìn)行了UPLC-ESI-QTOF-MS/MS分析；結(jié)合文獻(xiàn)研究，總結(jié)了黃酮二糖碳苷類化合物在ESI-QTOF-MS中的裂解規(guī)律，并應(yīng)用該質(zhì)譜裂解規(guī)律和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析和鑒定了紫花地丁中的黃酮碳苷類成分。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters AcquityTMUPLC system(配備有Acquity UPLC Sample Manager、FTN Acquity UPLC PDA Detector、Waters XevoTMG2QTOF-MS和Masslynx、Markerlynx工作站)；KQ5200E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Elix/RIOS純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)。

圖1 紫花地丁中5個(gè)主要黃酮碳苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of five standard flavone di-C-glycosides isolated from Viola yedoensis

紫花地丁藥材購(gòu)自上海華宇藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地為浙江，經(jīng)作者鑒定為堇菜科植物紫花地丁ViolayedoensisMakino 的干燥帶根全草；標(biāo)本(DH2008082905)保存于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室。對(duì)照品：芹菜素-6,8-二-C-β-D-葡萄糖苷(S1)、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷(S2)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3)、芹菜素-6,8-二-C-α-L-阿拉伯糖苷(S4)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-L-阿拉伯糖苷(S5)和山奈酚-3-O-β-D-槐糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(S6)均由本實(shí)驗(yàn)室自制，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式(圖1)經(jīng)NMR,MS和UV等多種方法鑒定[2,9]。乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)。

1.2 對(duì)照品與供試品溶液的制備

取各對(duì)照品約1.0 mg，加入甲醇2 mL，溶解，搖勻，即得各對(duì)照品溶液。取干燥紫花地丁藥材，粉碎，過(guò)100目篩，精密稱取粗粉2.0 g，精密加入75%甲醇水溶液40 mL，精密稱定，超聲提取30 min后，放冷，精密稱定，以甲醇補(bǔ)足失重，過(guò)濾；精密吸取續(xù)濾液20.0 mL，減壓濃縮至干。以75%甲醇水溶液將樣品完全溶解，并轉(zhuǎn)移定容至5 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

1.3 色譜條件

ThermoScientific Hypersil C18- GOLD柱(100 mm × 2.1 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%乙酸水溶液(B)，線性梯度洗脫：0～3 min，5%～10%A；3～5 min，10%～12%A；5～10 min，12%～15%A；10～12 min，15%～18%A；12～14 min，18%～100%A；14～15 min，100%A；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm,272 nm和342 nm；柱溫35 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

ESI離子源；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：40 V(ESI+)，55 V(ESI-)；萃取電壓：4.0 V；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣(氮?dú)?溫度：450 ℃；錐孔氣(氮?dú)?流量：150 L/h(ESI+)，50 L/h(ESI-)；脫溶劑氣流量：600 L/h；MS/MS條件：碰撞能量：30 keV；每0.2 s采集1次圖譜；質(zhì)量掃描范圍：100～1 000m/z。

1.5 黃酮碳苷類化合物質(zhì)譜裂解碎片的命名

圖2 黃酮二糖碳苷的質(zhì)譜特征離子及裂解示意圖Fig.2 Fragment nomenclature and MS fragmentation mechanism proposed for an apigenin 6,8-di-C-glycoside

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮碳苷類單體化合物的紫外光譜特征

圖3 黃酮碳苷S1(a)及黃酮氧苷S6(b)的UV圖譜Fig.3 UV spectra of a flavone C-glycoside(S1，a) and a flavonol O-glycoside(S6，b)

本研究選取了從紫花地丁中分離鑒定的黃酮碳苷類成分S1和黃酮氧苷類成分S6，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍分別對(duì)其紫外光譜進(jìn)行掃描(見(jiàn)圖3)。結(jié)果顯示，黃酮碳苷類化合物S1有3個(gè)特征吸收帶：347，271，227 nm；而黃酮氧苷S6有兩個(gè)特征吸收帶：355 nm和266 nm。這些黃酮碳苷和氧苷的UV特征吸收與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。利用兩者的紫外特征圖譜，可初步鑒別和區(qū)分黃酮碳苷和氧苷類化合物。本文選擇PDA檢測(cè)器的三通道檢測(cè)230，272，342 nm作為黃酮碳苷類成分的特征檢測(cè)波長(zhǎng)。在上述波長(zhǎng)下，黃酮氧苷類化合物也同樣會(huì)被檢測(cè)到。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖5 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3)在不同碰撞能量時(shí)的MS/MS圖Fig.5 ESI-QTOF MS(A)and MS/MS spectra(B-E) of apigenin 6-C-β-D-glucosyl-8-C-α-L-arabinoside(S3) in different collision energy B.20 keV，C.25 keV，D.30 keV，E.35 keV

2.2.2 MS/MS碰撞能量的考察在ESI負(fù)離子模式下，對(duì)黃酮碳苷類化合物二級(jí)質(zhì)譜中不同碰撞能量進(jìn)行考察，以對(duì)照品芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3)為例，該化合物在20 keV和25 keV的碰撞能量下基本不發(fā)生裂解或裂解碎片較少(圖5B和C)；當(dāng)碰撞能量增至30 keV時(shí)(圖5D)，產(chǎn)生黃酮碳苷類的特征性碎片離子峰，且碎片峰強(qiáng)度適中；繼續(xù)提高碰撞能量至35 keV時(shí)(圖5E)，產(chǎn)生的特征性碎片離子種類和30 keV時(shí)較為相近，鑒于其主要特征離子峰(如m/z473和443)強(qiáng)度已顯著降低，因此選擇碰撞能量為30 keV對(duì)黃酮碳苷類化合物進(jìn)行MS/MS分析。

2.3 黃酮二糖碳苷對(duì)照品的ESI-QTOF-MS/MS碎片離子結(jié)構(gòu)分析

以上黃酮碳苷對(duì)照品S1-S4的質(zhì)譜裂解行為與文獻(xiàn)[8,12]報(bào)道的一致：六碳糖主要產(chǎn)生0,2裂解脫120 amu和0,3裂解脫90 amu的峰，而五碳糖主要產(chǎn)生0,2裂解脫90 amu和0,3裂解脫60 amu的峰。且C-6位上連接的糖較C-8位上連接的糖更容易優(yōu)先發(fā)生碎裂，因此MS/MS中脫1個(gè)糖的碎片離子一般為C-6位上的糖產(chǎn)生的，然后再發(fā)生C-8位上糖的裂解。這在S3中表現(xiàn)的最為明顯：其MS/MS二級(jí)質(zhì)譜中有豐度較高的來(lái)源于C-6位六碳糖裂解產(chǎn)生的[M-120-H]-和[M-90-H]-碎片離子，而來(lái)源于其C-8位五碳糖的特征碎片離子[M-60-H]-的豐度非常弱(表1)，說(shuō)明C-6位的葡萄糖先裂解，在此基礎(chǔ)上又發(fā)生了C-8位上阿拉伯糖的裂解。

圖6 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3，A)和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-L-阿拉伯糖苷(S5，B)的MS/MS圖Fig.6 ESI-QTOF MS/MS spectra of apigenin 6-C-β-D-glucosyl-8-C-α-L-arabinoside(S3，A)and apigenin 6-C-β-D-glucosyl-8-C-β-L-arabinoside(S5，B)

表1 黃酮二糖碳苷類對(duì)照品的主要質(zhì)譜碎片離子峰

2.4 紫花地丁中黃酮碳苷類化合物的UPLC-QTOF-MS/MS檢測(cè)與結(jié)構(gòu)表征

使用上述優(yōu)化的UPLC-QTOF-MS/MS法對(duì)紫花地丁75%甲醇提取物中的黃酮苷類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。圖7為紫花地丁75%甲醇提取物典型的PDA色譜圖和總離子流圖。對(duì)這些化合物的質(zhì)譜MS1-2行為進(jìn)行分析，對(duì)其碎片離子進(jìn)行歸屬，并根據(jù)其裂解規(guī)律、PDA特征圖譜(表2～4)、對(duì)照品的保留時(shí)間和高分辨質(zhì)譜給出的精確分子量，對(duì)這些黃酮碳苷類化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，共發(fā)現(xiàn)黃酮碳苷類化合物21個(gè)。

表2 紫花地丁中黃酮-6,8-di-C-六碳糖苷和黃酮6,8-di-C-五碳糖苷類化合物的色譜及質(zhì)譜信息

紫花地丁75%甲醇提取物中共檢出7個(gè)黃酮雙五碳糖碳苷類化合物：P14,P18～P22和P24(表2)。其中6個(gè)化合物P14,P18-P21和P24的分子量和裂解行為非常一致：一級(jí)質(zhì)譜均給出準(zhǔn)分子離子峰m/z533[M-H]-(基峰)；二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z443[M-90-H]-,m/z473[M-60-H]-，m/z353[M-180-H]-和m/z383[M-150-H]-的五碳糖裂解產(chǎn)生的特征碎片離子，推測(cè)這些化合物中含有2個(gè)五碳糖，且分別連接在C-6和C-8位上。根據(jù)其苷元的特征碎片離子m/z353，推測(cè)其苷元均為芹菜素。因此，鑒于以上質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推定這6個(gè)化合物均為芹菜素6,8-雙-C-五碳糖苷。通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間、PDA圖譜和MS/MS數(shù)據(jù)對(duì)比分析，可以進(jìn)一步鑒定P19為芹菜素-6,8-雙-C-α-L-阿拉伯糖苷(S4)，P24為芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷(S2)(表2)。

表3 紫花地丁中黃酮-6,8-C-六碳糖-五碳糖苷化合物的色譜及質(zhì)譜信息

(續(xù)表3)

化合物P26的準(zhǔn)分子離子峰為m/z575.141 1[M-H]-，MS/MS中存在豐度較強(qiáng)的m/z515[M-42-18-H]-碎片峰，推測(cè)可能是脫乙酰基產(chǎn)生的特征碎片離子。此外，由碎片離子m/z425[M-60-90-H]-和m/z335[M-60-90-90-H]-，進(jìn)一步推測(cè)出該結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)C-五碳糖。鑒于相對(duì)高強(qiáng)度的脫乙酰基峰，并結(jié)合前期采用離子阱技術(shù)對(duì)紫花地丁黃酮碳苷類化合物的研究結(jié)果[8]，推測(cè)乙酰基連在C-6位的五碳糖上，因此可推測(cè)P26的結(jié)構(gòu)為芹菜素-6-C-(2′′′-乙酰基)五碳糖-8-C-五碳糖苷(表4)。

表4 紫花地丁中乙酰基取代的黃酮碳苷類化合物的色譜及質(zhì)譜信息

2.5 紫花地丁中黃酮氧苷類的檢測(cè)與表征

表5 紫花地丁中黃酮氧苷類化合物的色譜及質(zhì)譜信息

3 結(jié) 論

本研究采用UPLC-ESI-QTOF-MS/MS法首次對(duì)從中藥紫花地丁中分離鑒定的5個(gè)黃酮二糖碳苷化合物進(jìn)行了質(zhì)譜裂解規(guī)律分析。通過(guò)這些黃酮二糖碳苷的二級(jí)質(zhì)譜碎片分析，可以確定黃酮苷元的類型、C-6和C-8位取代糖基的類型和位置。利用該方法所建立的質(zhì)譜裂解規(guī)律，共從紫花地丁75%甲醇提取物中鑒定出21個(gè)黃酮碳苷類化合物，全部為黃酮二糖碳苷，其中只有6個(gè)化合物是先前通過(guò)傳統(tǒng)柱色譜分離得到。這些化合物的苷元主要為芹菜素、木犀草素和金圣草黃素/香葉木素。此外，在碎片峰的歸屬上，盡管QTOF-MS/MS法沒(méi)有IT-MSn法對(duì)離子的親緣關(guān)系提供更為直接的證據(jù)，但是憑借其給出的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息也可實(shí)現(xiàn)對(duì)黃酮碳苷結(jié)構(gòu)的鑒定。加之ESI-QTOF-MS/MS法也是目前主流的液質(zhì)聯(lián)用工具之一，本文的研究表明結(jié)合其高分辨技術(shù)和MS/MS二級(jí)裂解研究，可以實(shí)現(xiàn)中藥中黃酮二糖碳苷的結(jié)構(gòu)表征和鑒定研究。

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Characterization of Flavone di-C-glycosides in Viola yedoensis by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Quadrupole Time of Flight-Mass Spectrometry

QIN Yan1，YIN Jian-bing2，DU Dong-sheng1，CAO Jie1，YIN Cheng-le1，CHENG Zhi-hong1*

(1.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，F(xiàn)udan University，Shanghai 201203，China；2.Center for Medical Device Events Monitoring of Zhejiang，Hangzhou 311121，China)

MS/MS fragmentation patterns of five flavone di-C-glycoside standards fromViolayedoensiswere studied by ultrahigh performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time of flight-mass spectrometry(UPLC-ESI-QTOF-MS/MS) in the negative ion mode.The fragmentation pathways of C-6 and C-8 sugars in these flavone di-C-glycosides were consistent with those reported earlier.The results of our study also suggested that the configurations of sugars at C-8 obviously influenced the fragmentation behaviors.The fragmentation behaviors of these flavone di-C-glycoside standards were successfully used to characterize flavoneC-glycosides inV.yedoensis.Total of 21 flavone di-C-glycosides along with 4 flavonolO-glycosides were identified or tentatively identified on the base of their MS/MS data，accurate molecular weights，or by comparing with reference standards.The UPLC-ESI-QTOF-MS/MS method is rapid，sensitive and accurate,and could be used for the characterization of flavoneC-glycosides in traditional Chinese medicines.

Violayedoensis；flavoneC-glycoside；quadrupole time of flight-mass spectrometry(QTOF-MS)；liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.002

2016-09-28；

2016-11-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81073025)

*通訊作者：程志紅，博士，副研究員，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究，Tel：021-51980157，E-mail：chengzhh@fudan.edu.cn

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)01-0009-09