張 蕊，張 靜，許保海*，徐延昭

HPLC波長切換法同時測定藤藥中5種成分的含量

張 蕊1，張 靜1，許保海1*，徐延昭2

目的 建立同時測定藤藥中5種成分含量的HPLC方法。方法 采用Phenomene C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相采用甲醇(A)-水(B)梯度洗脫：0～15 min (45.0%A)，15～27 min (45.0%→56.0%A)，27～42 min (56.0%→70.0%A)，42～50 min (70.0%→45.0%A)。流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長：0～15 min (248 nm，α-玉柏堿)，15～50 min (254 nm，升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷)。結(jié)果 測得α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的平均加樣回收率及對應(yīng)的RSD分別為98.63% (1.60%)、97.82% (1.45%)、99.18% (1.48%)、97.18% (1.29%)和98.19% (1.80%)，且在5.15～103.00、8.13～162.60、4.74～94.80、4.09～81.80、4.35～87.00 μg/mL內(nèi)，線性關(guān)系良好(r≥0.999 1)。結(jié)論 采用HPLC波長切換法能有效分析藤藥中的5個成分，方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性良好，結(jié)果穩(wěn)定，可以作為藤藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的方法。

藤藥；α-玉柏堿；升麻素苷；升麻素；5-O-甲基維斯阿米醇苷；亥茅酚苷

0 引言

藤藥是我院(北京積水潭醫(yī)院)協(xié)定處方制劑，是我院60年代中醫(yī)科主任佟闊泉主任醫(yī)師(清末御醫(yī))的經(jīng)驗方，由伸筋草、防風(fēng)、透骨草、海桐皮、木瓜、地楓、獨(dú)活、赤芍、紅花、骨碎補(bǔ)、急性子、川椒、乳香、白芷、川牛膝、桂枝、大青鹽17味中藥材加工而成的醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有舒筋活血、疏風(fēng)定痛、消腫散結(jié)的功效，對風(fēng)寒痹痛濕痹、腰腿諸痛、風(fēng)寒入筋絡(luò)等癥狀的治療效果顯著?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)僅對該制劑的性狀及生產(chǎn)過程進(jìn)行了控制，未對該制劑中任何藥味進(jìn)行定量控制研究，方中伸筋草祛風(fēng)散寒、除濕消腫、舒筋活絡(luò)，為方中君藥，其主要成分是α-玉柏堿；方中防風(fēng)祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙定搐，為方中臣藥，其主要成分是升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷。為了確保藤藥臨床用藥的安全有效和質(zhì)量一致性，本文建立了簡便、可靠、準(zhǔn)確度高的 HPLC方法，對藤藥中的α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量進(jìn)行了定量測定。樣品處理方法簡便，測定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于藤藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HP1100型高效液相色譜儀(美國Waters)，Agilent1100型紫外檢測器(安捷倫科技有限公司)；XS105 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥 藤藥(北京積水潭醫(yī)院，125 g/袋，批號：150604、150605、151101)；α-玉柏堿對照品[凱立德生物醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司，596-55-4，含量：98.0%]；升麻素苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，111522-201511，含量：94.8%),升麻素對照品(中國食品藥品檢定研究院，111710-200602，含量：100.0%),異5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，111523-201509，含量：95.8%),亥茅酚苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，111714-201501，含量：100.0%)；甲醇(色譜純),水(重蒸餾水)。

2 溶液制備

2.1 對照品儲備液的制備 分別精密稱取對照品α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷各適量，分別置5個不同的20 mL量瓶中，用50%甲醇分別溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得單一濃度的對照品儲備液(α-玉柏堿0.515 mg/mL、升麻素苷對照品0.813 mg/mL、升麻素對照品0.474 mg/mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品0.409 mg/mL、亥茅酚苷對照品0.435 mg/mL)。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別依次量取上述各對照品儲備液：1.0、5.0、2.5、5.0、2.0 mL，置同一50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(α-玉柏堿0.010 3 mg/mL、升麻素苷對照品0.081 3 mg/mL、升麻素對照品0.023 7 mg/mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品0.040 9 mg/mL、亥茅酚苷對照品0.017 4 mg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 取藤藥適量，粉碎成細(xì)粉，取約3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得藤藥供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例分別稱取除伸筋草外和除防風(fēng)外的其他16味藥材各1份，嚴(yán)格按照藤藥制備工藝和供試品溶液的配制方法，分別制得伸筋草陰性對照溶液和防風(fēng)陰性對照溶液。

3 色譜條件

采用Phenomene C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流速：0.8 mg/mL；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動相A：甲醇，流動相B：水梯度洗脫[1-6](0～15 min，45.0%A；15～27 min，45.0%A→56.0%A；27～42 min，56.0%A→70.0%A；42～50 min，70.0%A→45.0%A)；0～15 min時在248 nm[7]波長下檢測α-玉柏堿，15～50 min時在254 nm[8-9]波長下檢測升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷。

4 方法學(xué)考察及含量測定

4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，將其置于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得到一系列濃度的混合對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，以質(zhì)量濃度X(μg/mL)作為橫坐標(biāo)，測得的峰面積Y作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍如表1所示。

4.2 專屬性實(shí)驗 在上述色譜條件下，分別取伸筋草陰性對照溶液、防風(fēng)陰性對照溶液、混合對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。陰性對照溶液、混合對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1，結(jié)果表明，在本條件下，5種待測定成分不受處方中其他藥味的影響。

4.3 精密度考察 取上述混合對照品溶液，按上述規(guī)定的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的峰面積，分別計算這5個組分峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，其RSD依次為1.13%、0.85%、1.07%、0.94%和1.11%，表明儀器精密度良好。

4.4 重復(fù)性試驗 取批號：150604的藤藥樣品6份，按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，分別計算α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量，并計算所測5個組分含量的RSD，結(jié)果所測顯示，5個組分的RSD依次為1.79%、1.54%、1.63%、1.59%和1.80%，表明本方法重復(fù)性良好。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗結(jié)果

圖1 藤藥含量測定的HPLC色譜圖

4.5 加樣回收率試驗 取批號為150604已知含量的藤藥適量，粉碎成細(xì)粉，稱定6份，每份1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液25 mL、50%甲醇25 mL，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為加樣回收樣品試液。按照上述色譜條件及檢測方法，計算5個組分的回收率及RSD，結(jié)果見表2。

5 樣品含量測定

取3批藤藥，按上述制備方法制備供試品溶液，在上述的色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。

6 討論

6.1 液相色譜條件的選擇與優(yōu)化

6.1.1 流動相的選擇 本實(shí)驗考察了甲醇-水、乙腈-水不同比例為流動相體系的梯度洗脫分離，結(jié)果表明，以甲醇-水按照文中的流動相比例進(jìn)行梯度洗脫時，所測α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷均能達(dá)到很好分離，所測各成分色譜峰峰型較好。

6.1.2 流速的選擇 本實(shí)驗還考察了流動相流速(0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min) 對各成分峰分離度及峰形的影響，結(jié)果表明，以0.8 mL/min的流速對所測5個成分(α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷)進(jìn)行測定時，樣品與對照品均能獲得良好的峰形。

6.2 檢測波長的選擇 取上述各對照品儲備液，用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果α-玉柏堿在波長248 nm處有較大吸收，因此，選擇248 nm作為α-玉柏堿含量測定波長；升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷在254 nm處均有較大吸收，因此，選擇254 nm作為該4種成分的測定波長。

6.3 提取溶劑的選擇 本實(shí)驗考察了不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、乙腈)、不同提取方式(加熱回流、超聲處理)和不同提取時間(30 min、60 min、90 min)對樣品中所測各成分定量測定的影響，結(jié)果表明，50%甲醇加熱回流提取 1 h效果最佳。

7 結(jié)論

本實(shí)驗所建立的HPLC波長切換法同時測定藤藥中α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷含量的方法，操作簡便，重復(fù)性好，可以有效地控制藤藥的產(chǎn)品質(zhì)量。

表2 α-玉柏堿、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的回收率

表3 含量測定結(jié)果(mg/g)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S]北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:177,146.

[2] 尤獻(xiàn)民,鄒桂欣,姜鴻,等.伸筋草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,14(12):15-17.

[3] 李悅悅,趙亮,張海,等.HPLC法測定防風(fēng)中升麻苷,升麻素,5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2010,28(6):445-447,474.

[4] 趙博,楊秀偉,張連學(xué),等.HPLC 法同時測定防風(fēng)中 6 個主要成分的含量[J].藥物分析雜志,2013,33(3):382-387.

[5] 曾麗君,孫啟時,賈凌云.RP-HPLC 法同時測定不同產(chǎn)地及不同部位防風(fēng)中 4種有效成分的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2009,26(2):127-130.

[6] 邵留英,喻志斌,瞿發(fā)林.不同產(chǎn)地防風(fēng)飲片中有效成分含量比較[J].海峽藥學(xué),2013,25(2):52-54.

[7] 鄒桂欣,尤獻(xiàn)民,王光函.HPLC 法測定伸筋草中α-玉柏堿含量[J].中藥材,2010,33(6):934-936.

[8] 姬雪禮,李文烈,張永鋒.辛防通竅片中升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測定[J].中國藥業(yè),2013,21(11):38-40.

[9] 于春月,白玉華,韓成花,等.大慶市不同產(chǎn)地防風(fēng)中有效成分含量比較[J].實(shí)驗研究,2011,8(34):39-41.

Simultaneous determination of five constituents in Teng Yao by HPLC wavelength switching method

ZHANG Rui1,ZHANG Jing1,XU Bao-hai1*,XU Yan-zhao2

(1.Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China;2.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China)

Objective To develop an HPLC method for simultaneous determination of five components in Teng Yao.Methods The chromatographic analysis was carried out on an Phenomene C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase was methanol (A)-water (B) at 0.8 mL/min in gradient elution mode which was 45.0% A from 0 to 15 min,45.0%→56.0% A from 15 to 27 min,56.0%→70.0% A from 27 to 42 min,70%～45% A from 42 to 50 min.The column temperature was set at 25 ℃,and detection wavelength was set at 248 nm (0～15 min,α-obscurine) and 254 nm (15～50 min,prim-o-glucosylcimifugin,cimifugin,5-O-methylvisammioside and sec-o-glucosylhamaudol).Results Five components were determined by HPLC,including α-obscurine,prim-o-glucosylcimifugin,cimifugin,5-O-methylvisammioside and sec-o-glucosylhamaudol.The average recoveries and the correspondingRSDwere 98.63% (1.60%),97.82% (1.45%),99.18% (1.48%),97.18% (1.29%)and 98.19% (1.80%),respectively.The linearity was good (r≥0.999 1) in the concentration ranges of 5.15～103.00 μg/mL,8.13～162.60 μg/mL,4.74～94.80 μg/mL,4.09～81.80 μg/mL and 4.35～87.00 μg/mL.Conclusion Five components in Teng Yao are effectively analyzed by HPLC wavelength switching method,and the method is accurate,reproducible with high sensitivity,which can be applied to the quality control of Teng Yao.

Teng Yao;α-obscurine;Prim-o-glucosylcimifugin;Cimifugin;5-O-methylvisammioside;Sec-o-glucosylhamaudol

2016-05-11

1.北京積水潭醫(yī)院，北京 100035；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201701020