艾 亮

參芪五味子片對(duì)阿爾茨海默小鼠的治療作用及其對(duì)小鼠血清與海馬體氧化應(yīng)激水平的影響

艾 亮

目的 研究參芪五味子片對(duì)阿爾茨海默小鼠的治療作用及其對(duì)小鼠血清和海馬體氧化應(yīng)激水平的影響。方法 選取50只3月齡APP小鼠，隨機(jī)平均分為模型組,陽(yáng)性藥組,高、中、低劑量組；另選取10只C57BL/6小鼠作為空白組。陽(yáng)性藥組每天灌胃給予多奈哌齊(10 mg/kg)，高、中、低劑量組每天分別灌胃給予1.44、0.72、0.36 g/kg參芪五味子片，空白組和模型組則灌胃給予等量生理鹽水，飼養(yǎng)時(shí)間為2個(gè)月。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各組血清與海馬體，檢測(cè)其超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-Aoc)與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)水平；利用末端標(biāo)記法(TUNEL法)觀察小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果 高、中劑量組的潛伏期明顯短于模型組，第3象限時(shí)間明顯長(zhǎng)于模型組，SOD、T-Aoc、GSH-Px水平明顯高于模型組，MDA明顯低于模型組；TUNEL染色顯示，模型組與低劑量組小鼠出現(xiàn)較多的陽(yáng)性染色的神經(jīng)元，而在高、中劑量組中僅觀察到少量的凋亡神經(jīng)元。結(jié)論 參芪五味子片對(duì)阿爾茨海默病小鼠具有較好的治療作用，可有效改善氧化應(yīng)激水平，值得進(jìn)行深入研究。

參芪五味子片；阿爾茨海默?。谎趸瘧?yīng)激

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s diseases，AD)又稱老年性癡呆，是臨床最為常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，該病的主要臨床表現(xiàn)為記憶力降低、人格改變、語(yǔ)言障礙及認(rèn)知功能減退等[1]。目前，AD的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確，其主要的病理特征為神經(jīng)元中出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)、老年斑沉積及海馬體中神經(jīng)元數(shù)目降低等[2]。近年來(lái)，諸多研究結(jié)果提示，海馬體氧化應(yīng)激出現(xiàn)紊亂可能是導(dǎo)致AD發(fā)生及發(fā)展的一類關(guān)鍵因素[3]。參芪五味子片具有寧心安神、健脾益氣的功效，常用于健忘、心悸氣短、少寐多夢(mèng)及倦怠乏力等癥[4]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究證實(shí)，該藥物具有較強(qiáng)的抗氧化、抗衰老及提高記憶力等活性[5]。盡管臨床針對(duì)參芪五味子片的研究較為廣泛，但對(duì)其治療AD的相關(guān)研究則較少涉及。APP小鼠(APP/V717轉(zhuǎn)基因小鼠)是藥物研究中較為成熟的AD模型[6]，本研究通過(guò)觀察參芪五味子片對(duì)APP小鼠的治療效果，為該藥物的臨床使用及AD的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑 參芪五味子片(康縣獨(dú)一味生物制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20103006，批號(hào)：2015020129)；多奈哌齊為本研究中陽(yáng)性藥，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào):98089212；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-Aoc)與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)檢測(cè)所需試劑盒均購(gòu)自武漢博士德有限公司，批號(hào):2014110313、2014122632、2015023052、2015022351；末端標(biāo)記法(TUNEL法)試劑盒購(gòu)自羅氏公司，批號(hào):90082325；Western印跡抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào):98061383。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組方法 50只APP小鼠，3月齡，體重(18.0±2.0)g，購(gòu)于陜西省疾控中心動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK(陜)2014-0122。根據(jù)參考文獻(xiàn)中相關(guān)方法，另選擇10只C57BL/6野生鼠作為本研究中空白對(duì)照小鼠，3月齡，體重范圍(18.0±2.0)g，購(gòu)自陜西省疾控中心動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK(陜)2013-1257。上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由西安交通大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為55%濕度、標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)、日常光照及自由飲水，本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作流程均嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》[7]中相關(guān)規(guī)定。10只C57BL/6野生鼠為空白組，50只APP小鼠隨機(jī)平均分為陽(yáng)性藥組、模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組，每組均為10只。

1.3 給藥方法 參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]中對(duì)于參芪五味子片小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的一般給藥劑量，本課題中，高、中、低劑量組小鼠每天分別灌胃給予1.44、0.72、0.36 g/kg參芪五味子片；陽(yáng)性藥組則每天灌胃給予10 mg/kg多奈哌齊；空白組與模型組每天灌胃給予等量生理鹽水。各組給藥時(shí)間均為2個(gè)月。

1.4 Morris水迷宮方法 采用Morris水迷宮檢測(cè)各組小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力，將水迷宮劃分為4個(gè)象限，在第3象限(目標(biāo)象限)中放置一個(gè)位于水面下0.8 cm的平臺(tái)(直徑30 cm)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中平臺(tái)與水迷宮的位置均保持不變。

各次實(shí)驗(yàn)中，將小鼠由第1、2、4象限分別放入水池，并訓(xùn)練小鼠順利找到平臺(tái)，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)。若2 min內(nèi)小鼠仍未找到平臺(tái)，則應(yīng)引導(dǎo)小鼠游至平臺(tái)，且于平臺(tái)停留1 min以強(qiáng)化記憶。各組小鼠均連續(xù)訓(xùn)練5 d，每天記錄小鼠潛伏期，在訓(xùn)練的第6天撤去平臺(tái)，對(duì)各組小鼠穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)與第3象限停留時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 小鼠血清及海馬體中氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)方法 水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后，利用尾靜脈取血法取各組小鼠靜脈血并分離血清，取血完成后，利用頸椎脫臼法處死小鼠，取其海馬體平均分為2份，留取一份備用，將另一份海馬體置于生理鹽水中，利用玻璃勻漿器將其制備成10%的組織勻漿，在高速離心機(jī)中離心10 min(3 000 r/min)后吸取其上清液，根據(jù)相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)中方法，分別對(duì)血清及勻漿中SOD、MDA、T-Aoc、GSH-Px含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 小鼠海馬體細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 取“1.5”項(xiàng)中海馬體組織，固定并利用蠟塊切片，根據(jù)TUNEL法試劑盒說(shuō)明書(shū)中相關(guān)方法，采用末端標(biāo)記法檢測(cè)各組小鼠海馬體細(xì)胞凋亡情況，其中凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞顯棕褐色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分別采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行兩兩相比較及組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參芪五味子片對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響 在第1天的訓(xùn)練中，除空白組外，其他各組小鼠潛伏期基本一致(P>0.05)，空白組潛伏期較其余各組縮短(P<0.05)。在第2～5天的訓(xùn)練中，各組潛伏期均呈降低趨勢(shì)，且陽(yáng)性藥組、高劑量、中劑量及空白組小鼠的潛伏期較模型組縮短，各組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組水迷宮潛伏期結(jié)果比較

在第6天的訓(xùn)練中，陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組及空白組小鼠穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)均明顯多于模型組，且第3象限停留時(shí)間較模型組延長(zhǎng)，各組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠第3象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)比較

注：*與模型組比較

2.2 參芪五味子片對(duì)AD小鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響 空白組、陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組小鼠血清中SOD、GSH-PX、T-Aoc的水平均明顯高于模型組，而MDA低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、表3。

2.3 參芪五味子片對(duì)AD小鼠海馬體氧化應(yīng)激水平的影響 空白組、陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組小鼠海馬體中SOD、GSH-PX、T-Aoc的水平均明顯高于模型組，MDA低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4、表5。

2.4 各組小鼠TUNEL染色結(jié)果 模型組及低劑量組小鼠海馬體中存在較多陽(yáng)性染色的神經(jīng)元細(xì)胞，且其細(xì)胞核主要呈現(xiàn)固縮深染與棕黃色；空白組中幾乎無(wú)上述陽(yáng)性染色的神經(jīng)元細(xì)胞；而在陽(yáng)性藥組、高劑量組及中劑量組中存在少量的且呈散在的凋亡神經(jīng)元細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

表2 各組小鼠血清SOD、MDA比較

注：*與模型組比較

表3 各組小鼠血清T-Aoc、GSH-Px比較

注：*與模型組比較

表4 各組小鼠海馬體中SOD、MDA比較

注：*與模型組比較

表5 各組小鼠海馬體中T-Aoc、GSH-Px比較

注：*與模型組比較

圖2 各組小鼠TUNEL染色結(jié)果(×400)

3 討論

AD是一種多發(fā)于老年患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其起病隱襲且呈慢性進(jìn)行性發(fā)展，患者主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、記憶障礙等精神神經(jīng)癥狀，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，最終導(dǎo)致患者死亡[9]。盡管AD的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有較多的研究結(jié)果顯示，該病的發(fā)生可能與機(jī)體氧化應(yīng)激紊亂密切相關(guān)[10]。參芪五味子片是臨床常用的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥物，主要成分包括南五味子、黨參、黃芪及酸棗仁等，全方具有寧心、安神、健脾及益氣的功效，適用于健忘、失眠、心悸、氣短、多夢(mèng)、乏力及自汗等癥，在臨床上被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)衰弱、焦慮及失眠等疾病的治療[11-12]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究證實(shí)，方中南五味子、黨參及黃芪均是臨床常用的滋補(bǔ)藥，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激紊亂均具有較好的調(diào)節(jié)作用，尤其是五味子及酸棗仁，可有效修復(fù)過(guò)氧化所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[13]。APP小鼠是AD研究中常用的一種模型，而其野生型C57BL/6小鼠則多作為空白對(duì)照被廣泛應(yīng)用[14]。

本研究采用Morris水迷宮法考察各組小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，結(jié)果顯示，與模型組相比，APP小鼠經(jīng)過(guò)高、中劑量參芪五味子片治療后，其潛伏期明顯縮短，第3象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)增多，提示參芪五味子片可有效改善APP小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，對(duì)AD癥狀的緩解具有重要意義。

此外，各組小鼠血清及海馬體氧化應(yīng)激水平檢測(cè)結(jié)果顯示，高、中劑量組小鼠的血清及海馬體中SOD、GSH-PX及T-Aoc的水平均明顯高于模型組，MDA則明顯低于模型組，提示參芪五味子片可有效調(diào)節(jié)APP小鼠整體及海馬體中氧化應(yīng)激水平，減輕由于過(guò)氧化所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

TUNEL染色能夠有效反映AD小鼠海馬體神經(jīng)元的凋亡情況[15]。本研究結(jié)果表明，模型組及低劑量組小鼠海馬體中存在較多的凋亡神經(jīng)元，而高、中劑量組小鼠則僅存在少量散在的凋亡神經(jīng)元，提示參芪五味子片可有效改善APP小鼠海馬體神經(jīng)元的凋亡情況。

本研究的局限性：首先，本文未對(duì)參芪五味子片治療AD的具體機(jī)制進(jìn)行深入探討；其次，在對(duì)小鼠血清及海馬體的氧化應(yīng)激水平考察中，僅選擇了部分較為典型的指標(biāo)作為檢測(cè)對(duì)象，而對(duì)其他的相關(guān)酶的檢測(cè)并未開(kāi)展，后續(xù)研究還應(yīng)予以完善；最后，本研究給藥劑量主要參考相關(guān)文獻(xiàn)中推薦劑量，但該劑量是否為AD治療中的最佳給藥劑量仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，參芪五味子片不僅可有效地改善AD小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，還能夠改善其氧化應(yīng)激水平，值得進(jìn)行深入研究。

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Effect of shenqi wuweizi tablets in the treatment of mice with Alzheimer′s diseases and its effects on the level of oxidative stress in serum and hippocampus of the mice

AI Liang

(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Yan′an University,Yan′an 716000,China)

Objective To study the treatment effects of shenqi wuweizi tablets in the treatment of mice with Alzheimer′s diseases and its effects on the level of oxidative stress in serum and hippocampus of the mice.Methods The 3-month APP mice (n=50) were randomly divided into model group,positive control group,high,middle and low dose group.Ten C57BL/6 mice were selected as blank control group.The mice of high,middle and low dose groups were treated with 1.44,0.72 and 0.36 g/kg shenqi wuweizi tablets,while the donepezil was used in the positive control group.The mice of blank control group and model group were given the same amount of normal saline,feeding time for 2 months.Morris water maze experiment was performed to test the learning and memory ability of mice.After the experiment,the serum and hippocampus of each group were collected,and the levels of SOD,MDA,T-Aoc and GSH-Px were detected.The TUNEL method was used to observe the apoptosis of hippocampus of mice.Results In the water maze test,the incubation period of mice in high,middle and low dose groups were obviously shorter than that of model group.Compared with model group,the levels of SOD,T-Aoc and GSH-Px in high,middle dose groups were higher,and MDA level was lower.TUNEL staining of the mice of model and low dose group appeared more positive staining of neurons,and only a small number of apoptotic neurons were observed in high and middle dose groups.Conclusion Shenqi wuweizi tablets has good therapeutic effect on mice with Alzheimer′s disease,which can effectively improve the level of oxidative stress,and it is worth studying in depth.

Shenqi wuweizi tablets；Alzheimer′s diseases；Oxidative stress

2016-06-30

延安大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科,陜西 延安 716000

10.14053/j.cnki.ppcr.201701005