律 澤,胡筱敏,安 婧,魏 煒

(1.東北大學(xué)資源與土木工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110819；2.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110016；3.沈陽(yáng)建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110168)

佳樂(lè)麝香與鎘復(fù)合污染對(duì)土壤微生物群落功能和豐度的影響

律 澤1,2,胡筱敏1*,安 婧2,魏 煒3

(1.東北大學(xué)資源與土木工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110819；2.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110016；3.沈陽(yáng)建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110168)

為考察佳樂(lè)麝香(HHCB)和鎘(Cd)復(fù)合污染對(duì)土壤微生物群落的影響，采用Biolog和qPCR技術(shù)對(duì)土壤微生物群落的功能多樣性和豐度進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，HHCB及其與Cd復(fù)合污染提高了土壤微生物對(duì)碳源的利用能力，6大類碳源利用中以對(duì)酯類利用效率最高，對(duì)糖類和羧酸類利用效率較低。HHCB污染下，Shannon、Simpson和McIntosh指數(shù)沒(méi)有顯著性變化，500、1000 mg·kg-1HHCB與Cd復(fù)合污染下三種指數(shù)顯著提高。HHCB加入后，土壤微生物的種群豐富度提高，優(yōu)勢(shì)種群增加，種群間的均一性被打破。500、1000 mg·kg-1HHCB及其與Cd復(fù)合污染顯著促進(jìn)了細(xì)菌生長(zhǎng)，HHCB污染顯著抑制了放線菌生長(zhǎng)。細(xì)菌的豐度隨HHCB濃度的增加而增加，真菌和放線菌的豐度則隨著HHCB濃度的增加而降低，放線菌受HHCB與Cd的影響比細(xì)菌和真菌更敏感。

佳樂(lè)麝香；鎘；復(fù)合污染；土壤微生物群落；功能和豐度

人工合成麝香作為香味添加劑已被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、化妝品和個(gè)人護(hù)理品中[1]。毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，這類化合物具有潛在的發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[2-3]。合成麝香能夠在人體組織積累，然后出現(xiàn)在母乳中，而且容易通過(guò)胎盤(pán)屏障進(jìn)入胚胎和胎兒體內(nèi)[4]。麝香酮可增加對(duì)致癌物的敏感性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)麝香會(huì)致使睪丸萎縮[5]。多環(huán)麝香化合物對(duì)出生24 h的青鳉魚(yú)均表現(xiàn)為高毒，96 h半致死濃度佳樂(lè)麝香高于吐納麝香和薩利麝香[6]。在有害物質(zhì)控制方案中，美國(guó)EPA將人工合成麝香中典型代表佳樂(lè)麝香(HHCB)列為大產(chǎn)量物質(zhì)予以重點(diǎn)關(guān)注[7]。HHCB已成為藥物和個(gè)人護(hù)理品類污染物(PPCPs)的重要組成部分，環(huán)境工作者越來(lái)越多地關(guān)注其在環(huán)境中的存在、分布、遷移轉(zhuǎn)化及潛在的毒性效應(yīng)[8-9]。

環(huán)境污染多具伴生性和綜合性，用單一污染的作用機(jī)理常常無(wú)法解釋環(huán)境中普遍存在的復(fù)合污染現(xiàn)象，過(guò)去依賴單一效應(yīng)制定的有關(guān)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法真實(shí)反映環(huán)境質(zhì)量要求[10]，關(guān)于復(fù)合污染的研究已經(jīng)成為當(dāng)前環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[11-13]。土壤是生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，也承載著多種環(huán)境污染物。HHCB是多環(huán)麝香中使用量最多的化合物之一，和吐納麝香一起共占多環(huán)麝香使用量的95%[14]。HHCB能夠通過(guò)污水灌溉和污泥農(nóng)田施用等多種途徑不斷輸入土壤中，從而提高其對(duì)土壤生物的污染暴露水平；并且由于HHCB具有較強(qiáng)的親脂性，其在土壤中可以長(zhǎng)期存在[15]。鎘(Cd)是重金屬污染土壤中一種常見(jiàn)的污染元素，主要來(lái)源為污水灌溉、污泥利用、金屬采礦和冶煉等[16]，動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育也受到Cd污染的影響，其在動(dòng)植物體內(nèi)有很強(qiáng)的積累性，還可以通過(guò)食物鏈危害人體健康[17]。多環(huán)麝香與重金屬Cd均來(lái)源于污水灌溉和污泥利用，二者共存于土壤環(huán)境中[18]，易對(duì)土壤環(huán)境造成復(fù)合污染。有研究表明，HHCB通過(guò)擾亂細(xì)胞防御系統(tǒng)來(lái)提高其他毒物的毒性效應(yīng)，且HHCB和Cd復(fù)合污染可以增強(qiáng)單一污染對(duì)動(dòng)物和植物的毒性[18-19]，因而已成為一種新型復(fù)合污染物并且在環(huán)境中具有潛在危害。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中非常重要的一部分，在有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)和植物養(yǎng)分利用過(guò)程中起著重要作用[20]。土壤生態(tài)學(xué)中把土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究作為熱點(diǎn)研究。土壤中微生物群落代謝功能的不同可以通過(guò)土壤微生物對(duì)Biolog微平板中各類碳源的利用情況的差異來(lái)反應(yīng)[21]。特定類群微生物的數(shù)量能被定量PCR(qPCR)準(zhǔn)確定量，高于1～ 10個(gè)拷貝的質(zhì)粒DNA以及100 cfu·mL-1的微生物量均可以被檢測(cè)到[22]，qPCR被廣泛用于檢測(cè)環(huán)境樣品是因?yàn)槠渚哂徐`敏度高、精確性好、特異性強(qiáng)和安全快速等優(yōu)點(diǎn)。為了探討HHCB和Cd復(fù)合污染對(duì)土壤微生物群落功能和豐度的影響，采用Biolog和qPCR相結(jié)合的方法，建立復(fù)合污染生態(tài)毒理診斷指標(biāo)，提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和修復(fù)基準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

采集地點(diǎn)：遼寧省沈陽(yáng)市石佛寺灌渠渠首(42° 08.606′N，123°20.712′E)，農(nóng)田土壤表層(0～20 cm)樣品，過(guò)2 mm篩備用。土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

1.2 供試藥品

HHCB購(gòu)于SIGMA-ALORICH公司，純度為50%[液體試劑，稀釋劑為鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)]，其分子式均為C18H26O，于實(shí)驗(yàn)室用丙酮配制為20 g· L-1HHCB溶液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤培養(yǎng)

本試驗(yàn)采用微宇宙試驗(yàn)。土壤預(yù)培養(yǎng)：用500 mL的塑料燒杯稱取土壤200 g(相當(dāng)于烘干土)，調(diào)節(jié)含水量至田間最大持水量的60%左右，為防止水分過(guò)量蒸發(fā)和空氣中的菌體進(jìn)入，采用具有透氣作用的薄膜封口，25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d。土壤染毒：設(shè)置HHCB實(shí)驗(yàn)濃度為0、100、500、1000 mg·kg-1，分別抽取0、1、5、10 mL配制好的20 g·L-1HHCB溶液加到200 g土壤中并混合均勻，待丙酮揮發(fā)干凈后，加入1 g·L-1的CdCl2溶液，使最終濃度為0、10 mg·kg-1，且2種污染物均勻分布在土壤中。實(shí)驗(yàn)組合方案如表2，共8個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。調(diào)節(jié)土壤含水量為田間最大含水量的60%，每2～3 d調(diào)一次水量，25℃恒溫恒水量避光培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10周。選取第2周土壤樣品用于土壤微生物群落功能多樣性試驗(yàn)，第10周土壤樣品用于測(cè)定微生物群落豐度試驗(yàn)。

表1 土壤理化性質(zhì)Table 1 The soil physical and chemical properties

表2 實(shí)驗(yàn)組合方案設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design combination

1.3.2 土壤微生物群落功能多樣性

分析采用Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)(Biolog，Hayward，CA，USA)。配制45 mL 0.145 mol·L-1的無(wú)菌生理鹽水，加入5 g新鮮土樣，180 r·min-1振蕩30 min，然后在超凈臺(tái)上用無(wú)菌生理鹽水稀釋1000倍，分別添加150 μL稀釋后的懸液于Biolog板孔中，3個(gè)土壤重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)，在第24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h測(cè)定各孔在590 nm波長(zhǎng)下的光吸收值。

1.3.3 土壤微生物數(shù)量-qPCR技術(shù)

樣品DNA的提取采用Fast DNA-SPIN KitFor Soil(MP Biomedicals，Santa Ana，CA)試劑盒，從0.5 g土壤中提取土壤基因組DNA，溶于50 μL水中，置于-20℃保存。

采用熒光qPCR測(cè)定細(xì)菌16S rRNA、真菌18S rRNA和放線菌特異基因的拷貝數(shù)。細(xì)菌擴(kuò)增引物為341F/758R(341F：CCTACGGGAGGCAGCAG，758R：CTACCAGGGTATCTAATCC)[23]，418 bp，退火溫度為55℃；真菌擴(kuò)增引物為 FR1/FF390(FF390：CGATAACGAACGAGACCT，F(xiàn)R1：AICCATTCAATCGGTAIT)[24]，390 bp，退火溫度為50℃；放線菌擴(kuò)增引物為243F/513R(243F：5′GGATGAGCCCGCGGCCTA 3′，513R：5′CGGCCGCGGCTGCTGGCACGTA 3′)[25]，271 bp，退火溫度為56℃。2×SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa)12.5 μL；前引物和后引物(10 pmol·μL)各為1 μL；50×ROX Reference Dye(TaKaRa)0.5 μL；DNA模板1 μL；水9 μL；反應(yīng)體系25 μL。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的基因拷貝數(shù)要據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，然后換算成每克干土的基因拷貝數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

式中：Ai為第i孔在590 nm處的吸光度值；A0為對(duì)照孔在590 nm處的吸光度值。

三種指數(shù)的計(jì)算公式分別為：

式中：Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率；ni為第i孔的相對(duì)吸光值。

菌種的拷貝數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行分析和作圖，選取Biolog Eco微平板培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行指數(shù)和碳源分析。采用SPSS 20.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用單因素方差分析中的LSD多重比較檢驗(yàn)不同處理間的結(jié)果差異顯著性，處理間差異顯著性用不同小寫(xiě)字母表示，顯著性水平設(shè)為0.05。實(shí)驗(yàn)作圖采用軟件Origin 8.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 HHCB與Cd污染對(duì)土壤微生物總體活性的影響

平均顏色變化率(AWCD)是反映土壤微生物代謝活性的重要指標(biāo)，微生物對(duì)碳源的利用率高低可以通過(guò)AWCD值的高低來(lái)表征。AWCD值越大，表明細(xì)菌密度越大、活性越高，反之則細(xì)菌密度越小、活性越低[26]。在培養(yǎng)第2周，HHCB單一污染條件下(圖1A)，AWCD值隨濃度變化趨勢(shì)是HHCB1000>HHCB500> HHCB100>CK。HHCB和Cd復(fù)合污染條件下(圖1B)：96 h之前 HHCB1000+Cd10>HHCB500+Cd10> HHCB100+Cd10>Cd10；96～168h之間HHCB500+Cd10> HHCB1000+Cd10>HHCB100+Cd10>Cd10；168h之后HHCB500+Cd10>HHCB100+Cd10>HHCB1000+Cd10> Cd10。HHCB單一和HHCB與Cd復(fù)合污染土壤微生物群落的AWCD值均高于對(duì)照組CK，表明加入HHCB提高了土壤微生物對(duì)碳源的利用能力。AWCD值均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明微生物利用碳源的總量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，其代謝能力增強(qiáng)。

2.2 HHCB與Cd污染對(duì)土壤微生物功能多樣性指數(shù)的影響

2.2.1 對(duì)Shannon豐富度指數(shù)的影響

Shannon指數(shù)是研究群落物種及其個(gè)體數(shù)和分布均勻程度的綜合指標(biāo)[27]。用于Biolog Eco微平板時(shí)，Shannon指數(shù)越高說(shuō)明可供土壤微生物利用的碳源種類就越多，物種豐富度就越高。HHCB單一污染條件下(圖2A)，與對(duì)照組CK相比差異都不顯著(P> 0.05)。HHCB和Cd復(fù)合污染條件下(圖2B)，HHCB100+ Cd10、HHCB500+Cd10和HHCB1000+Cd10分別顯著高于對(duì)照組 Cd10 10.51%、24.37%和 17.35%(P< 0.05)，表明HHCB的加入提高了復(fù)合污染土壤微生物代謝功能，增加了種群的豐富度。這可能是由于某些快速生長(zhǎng)的菌種，能利用提供的單一碳源，加快其自身的生長(zhǎng)、繁殖。

2.2.2 對(duì)Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)的影響

Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)反映了各物種種群數(shù)量的變化情況，指數(shù)越大，說(shuō)明群落內(nèi)物種數(shù)量分布越不均勻，優(yōu)勢(shì)種的地位越突出[28]。HHCB單一污染條件下(圖3A)，與對(duì)照組CK相比差異都不顯著(P>0.05)。HHCB和Cd復(fù)合污染條件下(圖3B)，與對(duì)照組Cd10相比，HHCB100+Cd10差異不顯著(P>0.05)，而HHCB500+Cd10和HHCB1000+Cd10則分別顯著高于對(duì)照組Cd10 96.60%和67.23%(P<0.05)，表明500 mg·kg-1和1000 mg·kg-1的HHCB加入顯著增加了復(fù)合污染土壤中優(yōu)勢(shì)種群，群落內(nèi)物種數(shù)量分布不均勻。這可能是由于某些菌種能夠充分利用單一碳源快速生長(zhǎng)而成為表征菌種，并且可能發(fā)展成為土壤的優(yōu)勢(shì)種群。

2.2.3 對(duì)McIntosh均一性指數(shù)的影響

圖1 HHCB與Cd單一、復(fù)合污染下土壤微生物AWCD變化情況Figure 1 The AWCD variation of soil microbial under the single and joint stress of HHCB and Cd

圖2 HHCB與Cd單一、復(fù)合污染對(duì)Shannon指數(shù)的影響Figure 2 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on Shannon index

McIntosh多樣性指數(shù)是群落物種均一性的度量，是依據(jù)土壤微生物群落物種多維空間上Euclidian距離的多樣性指數(shù)。HHCB單一污染條件下(圖4A)，與對(duì)照組CK相比差異都不顯著(P>0.05)。HHCB和Cd復(fù)合污染條件下(圖4B)，與對(duì)照組Cd10相比，HHCB100+Cd10差異不顯著(P>0.05)；HHCB500+ Cd10和HHCB1000+Cd10分別顯著高于對(duì)照組Cd10 120.59%和160.75%(P<0.05)。500、1000 mg·kg-1的HHCB加入使McIntosh指數(shù)升高，表明種群間的均一性被打破。

HHCB單一污染條件下，與對(duì)照組CK相比，不同濃度的三種指數(shù)沒(méi)有顯著性變化；HHCB和Cd復(fù)合污染條件下，與對(duì)照組Cd10相比，500、1000 mg· kg-1HHCB與Cd復(fù)合下的三種指數(shù)顯著提高。

2.3 HHCB與Cd污染條件下土壤微生物對(duì)不同類型碳源利用強(qiáng)度的影響

Biolog Eco微平板上含有31種碳源，要據(jù)碳源官能團(tuán)不同將其分為6類，主要包括：?jiǎn)翁?、糖苷、聚合糖類，氨基酸類，酯類，醇類，胺類和羧酸類。HHCB單一污染條件下(圖5A)，與對(duì)照組CK相比，只有HHCB500和HHCB1000處理的糖類和羧酸類利用顯著提高(P<0.05)，其余處理的碳源利用差異都不顯著(P>0.05)。HHCB和Cd復(fù)合污染條件下(圖5B)，與對(duì)照組Cd10相比，HHCB500+Cd10和HHCB1000+Cd10處理下酯類、醇類和羧酸類利用顯著提高，HHCB1000+Cd10處理下胺類的利用顯著提高，其余處理的碳源利用差異均不顯著。500、1000 mg·kg-1的HHCB與Cd復(fù)合污染提高了某些碳源的利用率?？傮w上，土壤微生物對(duì)6大類碳源的利用強(qiáng)度有所差異，其中對(duì)酯類的利用效率最高，對(duì)糖類和羧酸類碳源的利用強(qiáng)度較低。

2.4 HHCB與Cd污染條件下對(duì)土壤微生物豐度的影響

qPCR技術(shù)是一種核酸定量分析方法。相對(duì)定量是指不僅能測(cè)定目的基因，而且還能測(cè)定某一內(nèi)參基因，基因拷貝數(shù)的比較主要通過(guò)該內(nèi)參基因表達(dá)[29]。HHCB單一污染條件下(圖6A)，與對(duì)照組CK相比，HHCB100處理細(xì)菌的豐度差異不顯著(P>0.05)；HHCB500和HHCB1000處理分別顯著高于對(duì)照組CK 1.79%和1.94%(P<0.05)。HHCB和Cd復(fù)合污染條件下(圖6B)，與對(duì)照組Cd10相比，HHCB100+ Cd10處理下細(xì)菌的豐度差異不顯著；HHCB500+ Cd10和HHCB1000+Cd10處理分別顯著高于對(duì)照組Cd10 2.14%和2.45%；HHCB單一及其與Cd復(fù)合處理，細(xì)菌的豐度隨著HHCB濃度的增加而增加?？梢?jiàn)某些細(xì)菌可能利用HHCB作為碳源，促進(jìn)其自身快速的生長(zhǎng)、繁殖。

圖3 HHCB與Cd單一、復(fù)合污染對(duì)Simpson指數(shù)的影響Figure 3 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on Simpson index

圖4 HHCB與Cd單一、復(fù)合污染對(duì)McIntosh指數(shù)的影響Figure 4 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on McIntosh index

圖5 HHCB與Cd單一、復(fù)合污染對(duì)土壤微生物碳源利用強(qiáng)度的影響Figure 5 Utilization of carbon substrates by soil microbial community under the single and joint stress of HHCB and Cd

HHCB單一污染條件下(圖7A)，與對(duì)照組CK相比，不同濃度的HHCB處理真菌的豐度差異不顯著(P> 0.05)；HHCB和Cd復(fù)合污染條件下(圖7B)，HHCB1000+ Cd10處理下真菌的豐度顯著低于對(duì)照組Cd10 4.91% (P<0.05)。與對(duì)照組CK相比，不同濃度的HHCB與Cd復(fù)合處理真菌的豐度均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。HHCB的單一及其與Cd復(fù)合處理的真菌與對(duì)照組CK相比均未受到顯著影響，真菌的豐度隨著HHCB濃度的增加而降低。

圖6 HHCB與Cd單一、復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌豐度的影響Figure 6 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on the bacteria abundance

圖7 HHCB與Cd單一、復(fù)合污染對(duì)真菌豐度的影響Figure 7 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on the fungi abundance

HHCB單一污染條件下(圖8A)，HHCB100、HHCB500和HHCB1000處理放線菌的豐度顯著低于對(duì)照組CK 0.86%、6.31%和6.90%(P<0.05)，可見(jiàn)HHCB顯著抑制了放線菌生長(zhǎng)。HHCB和Cd復(fù)合污染條件下(圖8B)，HHCB100+Cd10和HHCB500+Cd10處理放線菌的豐度分別顯著高于對(duì)照組Cd10 7.21%和2.89%；HHCB1000+Cd10處理顯著低于對(duì)照組Cd10 5.72%；HHCB500+Cd10和HHCB1000+Cd10處理顯著低于對(duì)照組CK 4.49%和12.48%。HHCB的單一及其與Cd復(fù)合處理，與對(duì)照組CK相比，不同濃度處理的放線菌均受到抑制(HHCB100+Cd10除外)，其豐度隨著HHCB濃度的增加而降低，放線菌對(duì)HHCB和Cd的抑制作用比細(xì)菌和真菌更為敏感。本課題組用平板菌落計(jì)數(shù)的方法研究HHCB和Cd單一、復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌、真菌和放線菌的影響中也有類似的結(jié)果，放線菌受到顯著抑制作用[30-31]。

3 討論

圖8 HHCB與Cd單一、復(fù)合污染對(duì)放線菌豐度的影響Figure 8 Effect of the single and joint stress of HHCB and Cd on the actinomycetes abundance

本研究中HHCB單一及其與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤微生物功能和豐度的影響明顯不同，其原因可能是：(1)作用污染物不同，在單因子污染脅迫下，其本身的理化性質(zhì)基本決定了污染物對(duì)生物的毒害效應(yīng)，受暴露濃度水平的影響也極為重要，在多元復(fù)合污染條件下，污染物理化性質(zhì)的作用除外，起至關(guān)重要的作用是污染物的濃度組合[32]；(2)復(fù)合污染的聯(lián)合毒性機(jī)理與單一污染致毒機(jī)理明顯不同，有機(jī)物與重金屬的聯(lián)合毒性效應(yīng)產(chǎn)生機(jī)理研究包括競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)、螯合或絡(luò)合作用及沉淀作用、影響酶的活性、影響生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、干擾生物生理活動(dòng)和功能、干擾生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能等幾方面[33]。

Biolog試驗(yàn)結(jié)果表明，HHCB單一及其與Cd復(fù)合污染土壤微生物群落的AWCD值均高于對(duì)照組CK，表明加入HHCB提高了土壤微生物對(duì)碳源的利用能力。一些有機(jī)污染物能夠提高微生物的代謝活性，提高對(duì)碳源的利用能力。如張?chǎng)┑萚34]和吳小虎[35]研究表明，芐嘧磺隆施用初期及使用高濃度氟磺胺草醚處理粉砂質(zhì)壤土和黑土?xí)r，處理組的AWCD值高于對(duì)照組，都提高了微生物的碳源利用能力。

HHCB和Cd復(fù)合污染條件下，與對(duì)照組Cd10相比，500、1000 mg·kg-1HHCB與Cd復(fù)合的三種指數(shù)顯著提高。表明加入HHCB后，復(fù)合污染土壤的種群豐富度顯著提高，復(fù)合污染土壤中優(yōu)勢(shì)種群得到顯著增加，種群間的均一性被打破?？赡苡捎贖HCB的加入提高了復(fù)合污染土壤微生物代謝功能多樣性和碳源利用種類數(shù)，某些快速增長(zhǎng)的菌種，能利用提供的單一碳源，促進(jìn)其自身快速的生長(zhǎng)、繁殖，充分利用單一碳源快速生長(zhǎng)的表征菌種，可能發(fā)展成為土壤的優(yōu)勢(shì)種群，破壞種群的均一性。另外一種可能性推測(cè)是土壤中可能存在降解HHCB的微生物，HHCB的生物降解作用已經(jīng)得到不少研究的支持和證實(shí)[36-38]，HHCB的存在會(huì)促進(jìn)這些微生物的活性，從而導(dǎo)致其利用某些碳源的能力增加，三種指數(shù)也相應(yīng)得到提高。

細(xì)菌、真菌和放線菌在HHCB和Cd復(fù)合污染中受到不同程度的影響，可能是由于三種菌在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能方面都存在較大差異，且不同污染物對(duì)土壤中的微生物毒害效應(yīng)不一致而導(dǎo)致。500、1000 mg· kg-1HHCB單一及其與Cd復(fù)合污染顯著促進(jìn)了細(xì)菌的生長(zhǎng)，可能是由于HHCB污染土壤中產(chǎn)生HHCB降解菌，在高濃度組合和暴露條件下的復(fù)合污染生態(tài)毒理效應(yīng)，可導(dǎo)致特異微生物物種(如耐受和降解菌)的大量繁殖富集或微生物為了“抵御”污染毒性作用而產(chǎn)生的基因突變[10]，多環(huán)麝香對(duì)細(xì)菌的基因毒害作用不明顯，但具有一定的誘導(dǎo)性[39]。因此，HHCB污染土壤中細(xì)菌數(shù)量得到提高。

與對(duì)照組CK比，不同濃度處理的放線菌均受到了抑制作用(HHCB100+Cd10除外)，其豐度隨著HHCB濃度的增加而降低。土壤放線菌對(duì)多種有機(jī)和重金屬污染物脅迫的反應(yīng)敏感。沈國(guó)清等[40]和張慧等[41]的研究表明，多環(huán)芳烴與Cd的復(fù)合污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)的抑制率達(dá)40%左右；Luckenbach等[42]發(fā)現(xiàn)HHCB能夠抑制加利福尼亞貽貝對(duì)有毒物質(zhì)的自然抵抗力，減少異生質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，使有害物質(zhì)更容易累積于生物體。因此，HHCB存在有可能降低放線菌體內(nèi)某種轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，從而使有害物質(zhì)累積量增多，抑制放線菌生長(zhǎng)。

HHCB和Cd復(fù)合污染條件下，HHCB100+Cd10和HHCB500+Cd10處理下放線菌的豐度分別顯著高于對(duì)照組Cd10 7.21%和2.89%，其原因可能是：(1)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)功能的改變會(huì)影響復(fù)合污染物對(duì)生物體的毒性[33]。Moreau等[43]認(rèn)為菲對(duì)Zn在生物體內(nèi)蓄積的拮抗作用可能是因?yàn)榉聘淖兞巳苊阁w膜的穩(wěn)定性及功能，從而影響了溶酶體解除Zn毒害的作用。Sikkema等[44]提出了毒作用麻醉假設(shè)，認(rèn)為PAHs等脂溶性化合物可以同細(xì)胞膜上的脂溶性分子結(jié)合，從而影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和穿透性。HHCB同樣是脂溶性化合物，它也可能改變放線菌細(xì)胞膜的通透性，使Cd更不容易進(jìn)入微生物細(xì)胞，降低Cd對(duì)微生物的毒性。(2)有機(jī)絡(luò)合劑與被絡(luò)合物可形成生物體幾乎不能吸收、蓄積的絡(luò)合物形式，這一點(diǎn)是減毒的重要機(jī)制[45]。HHCB生物降解過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)有機(jī)酸，而有機(jī)酸又是一種很好的絡(luò)合劑，它能夠與具有配位能力的重金屬Cd產(chǎn)生絡(luò)合作用，形成較大絡(luò)合物，阻止其通過(guò)生物膜，從而拮抗Cd對(duì)生物的毒性。另外，Cd以二價(jià)離子態(tài)存在于土壤溶液中，易被靜電吸附，降低土壤表面負(fù)電荷，促進(jìn)土壤對(duì)HHCB的吸附固定。這些作用都可能減弱Cd與HHCB的生物有效性。(3)與DNA生成化學(xué)加合物(或加成物)常被視作致毒的重要機(jī)理[46]。Donnelly等[47]發(fā)現(xiàn)，隨著三硝基甲苯加入量的增大，苯并芘的毒性逐漸降低，其原因在于前者干擾了后者與DNA的結(jié)合。本研究中HHCB100+Cd10和HHCB500+Cd10處理下放線菌豐度高于Cd單一污染的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

HHCB單一污染及其與Cd復(fù)合污染提高了土壤微生物對(duì)碳源的利用能力，對(duì)6大類碳源的利用強(qiáng)度有所差異，其中對(duì)酯類的利用效率最高，對(duì)糖類和羧酸類碳源的利用強(qiáng)度較低。

HHCB單一污染條件下，Shannon、Simpson和McIntosh指數(shù)沒(méi)有顯著性變化；HHCB和Cd復(fù)合污染下，500、1000 mg·kg-1HHCB與Cd復(fù)合污染的三種指數(shù)顯著提高，HHCB加入后，土壤微生物可以快速消耗單一的碳源，復(fù)合污染土壤的種群豐富度顯著提高，優(yōu)勢(shì)種群增加，種群間的均一性被打破。

500、1000 mg·kg-1HHCB的單一污染及其與Cd復(fù)合污染顯著促進(jìn)了細(xì)菌的生長(zhǎng)，HHCB單一污染及其與Cd復(fù)合污染與對(duì)照組CK相比真菌生長(zhǎng)均未受到顯著影響，HHCB單一污染顯著抑制了放線菌生長(zhǎng)。細(xì)菌的豐度隨著HHCB濃度的增加而增加，而真菌和放線菌的豐度隨著HHCB濃度的增加而降低。放線菌受到HHCB和Cd的影響時(shí)表現(xiàn)得比細(xì)菌和真菌更為敏感。

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Joint effects of galaxolide and cadmium on soil microbial community function and abundance

Lü Ze1,2,HU Xiao-min1*,AN Jing2,WEI Wei3
(1.School of Resources and Civil Engineering,Northeastern University,Shenyang 110819,China;2.Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering,Institute of Applied Ecology,Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016,China;3.School of Municipal and Environmental Engineering,Shenyang Jianzhu University,Shenyang 110168,China)

In order to investigate the joint effects of galaxolide and cadmium on soil microbial community,soil microbial community function and abundance were studied by Biolog and qPCR methods in this paper.Results showed that the ability of utilizing carbon sources in soil microorganisms has been improved under HHCB and HHCB-Cd combined pollution,and the utilization efficiency of esters was the highest, while sugars and acids have lower utilization efficiency compared with others 6 kinds of carbon sources.There was no significant change in Shannon,Simpson and McIntosh indexes under HHCB pollution.While the indexes have significantly increased under the 500 and 1000 mg·kg-1HHCB-Cd combined pollution.The species richness and the dominant population were significantly promoted,and the homogeneity of the population was broken after HHCB addition in the combined pollution soil.It significantly promoted the growth of bacteria under 500 and 1000 mg·kg-1HHCB-Cd combined pollution,respectively.While HHCB has significantly inhibited the growth of actinomycetes.The abundance of bacteria was increased as the increasing of HHCB concentrations.However,the abundance of fungi and actinomycetes were decreased as the increasing of HHCB concentrations.In this study,actinomycetes were more sensitive than bacteria and fungi to the joint effects of HHCB and Cd.

galaxolide(HHCB);cadmium;combined pollution;soil microbial community；function and abundance

X171.5

A

1672-2043(2017)01-0066-10

10.11654/jaes.2016-1134

2016-09-02

律 澤(1982—)，女，遼寧錦州人，博士研究生，主要從事污染生態(tài)學(xué)和微生物生態(tài)研究。E-mail：lvze_2006@163.com

*通信作者：胡筱敏 E-mail：hxmin_jj@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21277150，31370523)

Project supported：T卜e National Natural Science Foundation of C卜ina(21277150，31370523)

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