鄒麗秋　匡雪君　孫超　陳士林

[摘要] 天然產(chǎn)物合成途徑解析既是本草基因組學研究的主要目標，也是天然產(chǎn)物合成生物學研究的重要基石。該文綜述了近期相關領域的研究進展，提出了天然合成生物合成途徑解析的一般策略：即首先通過同位素示蹤實驗結(jié)果和化學反應原理、已分離鑒定的中間產(chǎn)物等信息推測出可能的生物合成途徑；然后利用共表達分析和/或基因簇發(fā)掘篩選出途徑中的候選基因；最后對所有候選基因進行異源表達和酶活性檢測確定參與代謝途徑的酶，并可在原物種中進行該酶基因的抑制或過表達研究，進一步確認該酶在原物種體內(nèi)的功能。天然產(chǎn)物生物合成途徑的解析將有助于通過合成生物學技術為新藥研發(fā)提供新的化合物來源，并可為中草藥的分子育種研究提供“功能性分子標記”，加速優(yōu)良品種的選育，推動中藥農(nóng)業(yè)的發(fā)展。

[關鍵詞] 天然產(chǎn)物； 合成途徑； 合成生物學； 分子育種

Strategies of elucidation of biosynthetic pathways of natural products

ZOU Liqiu1， KUANG Xuejun1， SUN Chao1*， CHEN Shilin2*

（1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking

Union Medical College， Beijing 100193， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Elucidation of the biosynthetic pathways of natural products is not only the major goal of herb genomics， but also the solid foundation of synthetic biology of natural products. Here， this paper reviewed recent advance in this field and put forward strategies to elucidate the biosynthetic pathway of natural products. Firstly， a proposed biosynthetic pathway should be set up based on wellknown knowledge about chemical reactions and information on the identified compounds， as well as studies with isotope tracer. Secondly， candidate genes possibly involved in the biosynthetic pathway were screened out by coexpression analysis and/or gene cluster mining. Lastly， all the candidate genes were heterologously expressed in the host and then the enzyme involved in the biosynthetic pathway was characterized by activity assay. Sometimes， the function of the enzyme in the original plant could be further studied by RNAi or VIGS technology. Understanding the biosynthetic pathways of natural products will contribute to supply of new leading compounds by synthetic biology and provide "functional marker" for herbal molecular breeding， thus but boosting the development of traditional Chinese medicine agriculture.

[Key words] natural products； biosynthetic pathway； synthetic biology； molecular breeding

doi：10.4268/cjcmm20162206

天然產(chǎn)物是藥物研發(fā)的重要源泉，目前1/3以上的臨床用藥來源于天然產(chǎn)物及其衍生物，其中包括青蒿素、紫杉醇、長春堿和喜樹堿等重要藥物[1]。天然產(chǎn)物生物合成途徑解析，既是本草基因組學研究的主要目標，也是天然產(chǎn)物合成生物學研究的重要基石。雖然天然產(chǎn)物種類繁多，結(jié)構復雜，但是它們都是由乙酸、氨基酸、莽草酸等少數(shù)前體物質(zhì)通過幾條主要的上游次生代謝途徑合成的[2]。目前研究得比較清楚的途徑包括：甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA）、磷酸甲基赤蘚糖醇途徑（MEP）、莽草酸途徑（shinimate pathway）和丙二酸途徑（malonic acid pathway）等（圖1）。MVA和MEP途徑都可以生成萜類的結(jié)構單元異戊二烯，前者發(fā)生在胞質(zhì)中，后者發(fā)生在質(zhì)體中。莽草酸途徑以莽草酸為起始經(jīng)過多步酶促反應主要生成芳香族化合物。丙二酸途徑的主要次生代謝產(chǎn)物為脂肪酸、多酮、苯丙烷類等化合物。在生物體內(nèi)這些代謝途徑不是孤立存在的，不同次生代謝途徑間會有交叉，形成代謝網(wǎng)絡，例如，在擬南芥和金魚草等植物中發(fā)現(xiàn)，MVA和MEP途徑中的異戊烯焦磷酸（IPP）可以在胞質(zhì)和質(zhì)體間轉(zhuǎn)運參與不同的代謝途徑[34]。此外，一些結(jié)構復雜的化合物的生物合成可能需要不同代謝途徑的參與，例如長春堿生物合成的2個中間體環(huán)烯醚萜和色胺，分別來自MVA途徑和莽草酸途徑。

鑒于大多數(shù)天然產(chǎn)物都具有共同的上游代謝途徑，并且已研究得比較透徹，因此，對于某個或某類特定天然產(chǎn)物生物合成途徑的解析通常是指對其下游特異性分支代謝途徑的解析。天然產(chǎn)物生物合成途徑解析的一般策略是：首先根據(jù)化學反應原理和已分離鑒定的中間產(chǎn)物推測出可能的生物合成途徑，必要時可通過同位素示蹤對推測途徑進行進一步的確認；然后通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得相關基因的共表達信息，或通過基因組掃描發(fā)掘次生代謝相關的基因簇，從而發(fā)現(xiàn)并縮小候選基因的范圍；最后對所有候選基因進行異源表達和酶活性檢測確定酶的催化功能，對于遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟的物種，可在原物種中進行酶基因的抑制或過表達研究，進一步確認該酶在原物種體內(nèi)的功能（圖2）。通過對途經(jīng)中所有酶的發(fā)掘和功能確認，最終達到途徑解析的目的。

1 代謝途徑推測

根據(jù)已有的知識推測出一個可能的代謝途徑是天然產(chǎn)物生物合成途徑解析的第一步?；瘜W反應原理和機制，已分離得到中間產(chǎn)物的化學結(jié)構等都可以為合成途徑推測提供有用的線索。同位素示蹤法常被用于對途徑進行進一步的確認和校正。同位素標記的化合物與非標記化合物具有相同的生物學和化學性質(zhì)，但是具有不同的質(zhì)量，可以通過質(zhì)譜儀和核磁共振儀等質(zhì)量分析儀器來區(qū)分它們。因此，飼喂同位素標記的前體物質(zhì)后，檢測到的那些被同位素新標記的化合物被認為是代謝途徑的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物。

Peng Di等[5]將13C標記的苯丙氨酸作為底物加入丹參毛狀根培養(yǎng)體系中，利用UPLC/QTOF技術檢測到111種同位素標記的化合物，經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)8個化合物與丹參酚酸的生物合成相關。通過比較這8個含同位素化合物出現(xiàn)的先后順序，推測出丹參酚酸的合成途徑，并鑒定出第1個參與丹參酚酸生物合成的細胞色素P450（CYP98A14）。為了研究丹參酮合成途徑，Guo等[6]通過在大腸桿菌中共表達SmKSL，SmCPS和GGPPS基因，并通過在培養(yǎng)基中添加13C標記的葡萄糖獲得同位素標記的次丹參酮二烯，當用13C標記的次丹參酮二烯飼喂丹參毛狀根后，發(fā)現(xiàn)其中有13C標記的隱丹參酮和鐵銹醇合成，從而證明了次丹參酮二烯和鐵銹醇是丹參酮合成途徑的中間產(chǎn)物，這為后續(xù)丹參酮合成途徑的解析奠定了重要基礎。

2 候選基因篩選

高通量測序技術的快速發(fā)展，使得快速廉價獲得一個物種的基因信息成為可能。但是從數(shù)萬個基因中篩選出可能參與特定天然產(chǎn)物生物合成的候選基因依然是一項非常具有挑戰(zhàn)性的工作。目前基于轉(zhuǎn)錄組測序的共表達分析和基于基因組測序的基因簇發(fā)掘是篩選候選基因的2個主要方法。

2.1 共表達分析 同一個天然產(chǎn)物生物合成途徑中的基因往往是共表達的，即受到體外或體內(nèi)信號刺激后，同一個途徑的基因表達會同時上調(diào)或下調(diào)?；蚬脖磉_是生物對信號刺激最經(jīng)濟的應答方式，是生物長期進化和自然選擇的結(jié)果。利用共表達分析可以對參與某個特定途徑的基因進行篩選，縮小候選基因的范圍?；诟咄康霓D(zhuǎn)錄組測序分析不但可以獲得生物樣本在某個時刻的所有表達基因的信息，而且可以通過多個樣本之間基因表達的關聯(lián)分析獲得基因共表達信息[711]。

Karel等[12]對過表達轉(zhuǎn)錄因子ORCA2或ORCA3的長春花懸浮細胞轉(zhuǎn)錄組進行研究，發(fā)現(xiàn)有3個氧化還原酶、4個細胞色素P450和1個糖基轉(zhuǎn)移酶與基因GES/G8O有顯著的共表達趨勢，已知GES/G8O基因是長春花環(huán)烯醚萜途徑中的酶，該途徑是萜類吲哚生物堿合成途徑的重要組成部分。經(jīng)過進一步的功能驗證鑒定出4個酶參與了環(huán)烯醚萜途徑，分別是8羥基香葉醇氧化還原酶、環(huán)烯醚萜氧化酶、7脫氧馬錢苷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和7脫氧馬錢苷酸羥化酶，至此長春花環(huán)烯醚萜途徑中所有的酶都已被鑒定，從而為利用合成生物學手段生產(chǎn)有藥理活性的環(huán)烯醚萜及生物堿奠定了堅實的基礎。Guo等[6]通過對銀離子誘導的丹參毛狀根轉(zhuǎn)錄組進行測序和分析，發(fā)現(xiàn)有6個細胞色素P450基因與已鑒定的合成丹參酮骨架的2個酶SmCPS和SmKSL共表達，經(jīng)功能驗證發(fā)現(xiàn)其中一個細胞色素P450（CYP76AH1）能對次丹參酮二烯進行羥基化生成鐵銹醇。

2.2 基因簇發(fā)掘 在放線菌和真菌中，同一代謝途徑中的酶基因往往在基因組中是成簇存在的。近年來發(fā)現(xiàn)在高等植物中，某些代謝途徑中的酶基因也可以形成基因簇，這使得通過基因組序列測定尋找代謝途徑候選基因成為可能。對于基因組較小的物種，全基因組測序和組裝是發(fā)現(xiàn)基因簇的有效方法。但是對于基因組較大或遺傳背景不清晰的藥用植物，通過構建BAC文庫，利用途徑中已知基因為靶點，篩選可能含基因簇的BAC并進行測序是一種經(jīng)濟可行的快速獲得基因簇的方式。當然，根據(jù)已有的知識，多數(shù)植物次生代謝途徑的基因并不形成基因簇。因此基因簇發(fā)掘的方法在植物天然產(chǎn)物合成途徑候選基因篩選中具有較大的局限性。

諾斯卡品是一種來源于罌粟的具有抗癌活性的生物堿。Thilo Winzer等[13]對含諾斯卡品的HN1和不含諾斯卡品的HM1和HT1 3個罌粟品種進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)有10個基因僅在品種HN1中表達。用HM1與HN1進行雜交產(chǎn)生271株F2代，對F2代進行基因型及諾斯卡品含量分析，發(fā)現(xiàn)與HN1相關的特異基因與諾斯卡品的含量呈一定相關性，因此推測參與諾斯卡品生物合成的基因呈基因簇分布。為了驗證推測，構建了HN1的BAC文庫，篩選出含10個特異基因的6個BAC克隆，通過對這些BAC克隆進行測序和組裝得到一個401 kb的基因簇。通過對這10個基因的功能驗證解析出諾斯卡品的生物合成途徑。Andrew J King等[14]通過對蓖麻的基因組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)有8個細胞色素P450、2個乙醇脫氫酶、1個BAHD乙酰轉(zhuǎn)移酶與蓖麻烯和五針松素合成酶位于同一個基因簇上，通過在煙草中共表達蓖麻烯合成酶與發(fā)掘出的P450， 發(fā)現(xiàn)其中3個P450（CYP726A14，CYP726A17，CYP726A18）能催化蓖麻烯生成5羥基蓖麻烯或者5酮基蓖麻烯。

3 候選基因功能驗證

通過基因共表達分析和基因簇發(fā)掘可以有效縮小候選基因的范圍，減少候選基因功能驗證的工作量。由于天然產(chǎn)物的結(jié)構千差萬別導致其合成途徑中的酶具有豐富的多樣性，因此針對每一個酶的功能驗證實驗都具有一定的獨特性。候選基因的功能驗證需要綜合運用分子生物學和分析化學等實驗技術，是天然產(chǎn)物合成途徑解析中最關鍵也是最具有挑戰(zhàn)性的一步。

3.1 異源表達及酶活性檢測 將候選基因在異源表達系統(tǒng)中進行表達，成功表達的酶蛋白可以催化內(nèi)源性或外源性底物生成產(chǎn)物，通過LCMS或GCMS等技術對產(chǎn)物進行分析鑒定，從而確定酶的催化活性[1518]。目前常用于候選基因功能驗證的異源表達系統(tǒng)包括大腸桿菌、酵母、擬南芥和煙草等。

由于具有遺傳背景清晰、培養(yǎng)周期短、操作技術簡單等特點，使得大腸桿菌成為應用最廣泛的原核表達系統(tǒng)[1923]，一些天然產(chǎn)物合成相關的酶可以成功地在大腸桿菌中進行表達和鑒定，例如紫杉醇側(cè)鏈的?；D(zhuǎn)移酶。紫杉醇屬于二萜類化合物，是銷量最大的抗腫瘤天然藥物。紫杉醇除了含有一個三環(huán)紫杉烷的核心結(jié)構外，還具有由酰氧基組成的側(cè)鏈，而?；D(zhuǎn)移酶是紫杉醇側(cè)鏈形成的重要酶類。Walker等[24]從紅豆杉cDNA文庫中篩選出了9個可能參與紫杉醇生物合成的?；D(zhuǎn)移酶并在大腸桿菌中進行表達，發(fā)現(xiàn)只有TAX10能將底物Ndebenzoyl（3′RS）2′deoxytaxol轉(zhuǎn)化為2′deoxytaxol，表明該基因編碼紫衫烷C13側(cè)鏈N苯甲酰轉(zhuǎn)移酶，是參與紫杉醇最后一步?；孽；D(zhuǎn)移酶。

釀酒酵母是應用最廣泛的真核表達系統(tǒng)，對于一些在大腸桿菌中無法成功表達的酶基因，可以嘗試在釀酒酵母系統(tǒng)中進行表達。細胞色素P450由于是膜蛋白，很難在大腸桿菌中表達，因此釀酒酵母常常是細胞色素P450表達的首選系統(tǒng)[2529]。目前的抗瘧疾一線藥物青蒿素是倍半萜類化合物， 2006年Teoh等[30]從黃花蒿腺毛的cDNA文庫中篩選出一個細胞色素P450基因（CYP71AV1），并在釀酒酵母中進行了表達，發(fā)現(xiàn)該P450能催化三步連續(xù)的反應，使底物紫穗槐4，11二烯經(jīng)過青蒿醇，青蒿醛生成青蒿酸。

由于具有成熟高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，一些模式植物，如擬南芥、煙草等也常被用于途徑基因的異源表達和鑒定[31]。與原核生物大腸桿菌和低等真核生物釀酒酵母相比，這些模式植物在次生代謝合成途徑和蛋白的翻譯后修飾上與候選基因的來源植物具有更多的相似性，因此在植物蛋白的異源表達上具有一定的優(yōu)勢。例如，呋喃香豆素為苯丙烷類分子，其在保護植物免受蟲害方面具有重要作用。Fazeelat等[32]在產(chǎn)呋喃香豆素的蕓香中克隆到了1個CYP98A家族的CYP98A22。為了鑒定CYP98A22的功能，他們在釀酒酵母中進行異源表達但沒有成功。隨后利用農(nóng)桿菌介導的方法將CYP98A22基因?qū)霟煵?，成功表達出CYP98A22蛋白。通過加入不同的測試底物，發(fā)現(xiàn)CYP98A22對底物βcoumaroylquinate的親和性最高。

3.2 基因表達抑制 可以通過基因刪除或基因表達抑制全部或部分缺失酶的功能，然后檢測植物體內(nèi)各種次生代謝產(chǎn)物含量的變化，來進一步驗證酶在原植物體內(nèi)的生物活性。通常酶的功能缺失會導致上游底物的積累和下游產(chǎn)物的減少。用于基因功能缺失的方法較多，目前最常用是RNA干擾（RNAi）和病毒誘導的基因沉默技術（virusinduced gene silencing，VIGS）。RNAi和VIGS均屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscription gene silencing， PTGS）。

RNAi 是一種序列特異性的PTGS過程，通過雙鏈RNA引起具有相同序列的mRNA發(fā)生降解來抑制基因的表達[33]。在羅勒中丁香酚和木質(zhì)素享有共同的初始合成步驟，均在4香豆酸CoA連接酶（4CLs）的作用下將羥基肉桂酸轉(zhuǎn)化為它們的共同前提物質(zhì)，4CLs被認為是從苯丙烷代謝到木質(zhì)素、黃酮類化合物等幾大生物代謝的一個分支點[3435]。為了弄清丁香酚起始步驟的代謝流，Shubhra Rastogi等[36]克隆了圣羅勒Ocimum sanctum的Os4CL基因。利用RNAi技術短暫抑制基因Os4CL的表達，通過定量分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)RNAi處理后的葉片與對照相比丁香酚含量降低了31%，5個酚酸底物除了SIN外均有增加，其中COU增加量最大，與對照相比經(jīng)RNAi處理后的葉片COU增加了10倍，因此，在羅勒腺毛中高度表達的基因Os4CL通過對底物COU，F(xiàn)ER，CAF，CIN表現(xiàn)出不同的催化活性使得代謝流流向丁香酚。

VIGS是利用病毒將內(nèi)源基因同源序列導入植物中，通過PTGS引起靶基因沉默。近年來，關于長春花中MIA生物合成的限制性前體是萜類還是吲哚類頗有爭議。Krishna等[37]采用VIGS技術說明了這個問題，Krishna等克隆了香葉醇合成酶（GES）的特異片段并構建到病毒載體pTRV，對長春花進行了VIGS驗證，通過定量分析發(fā)現(xiàn)VIGS處理組的GES的表達量降低了80%，長春堿的含量降低了49%，文多靈降低了57%，而長春花堿則降低了60%，對VIGS處理組進行香葉醇飼喂發(fā)現(xiàn)MIA的含量顯著增加，以上實驗表明在長春花的葉中萜類是MIA生物合成的限制性前體。

3.3 基因過表達 基因過表達（overexpression）也常用于候選基因的功能驗證，通過檢測植物中代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的增加來確定酶的功能?；蜻^表達很少單獨使用，常結(jié)合RNAi實驗以更全面地驗證酶在原植物體內(nèi)的功能?；蜻^表達一般可以通過增加基因的拷貝數(shù)或者采用強啟動子來實現(xiàn)。

Wang等[38]從西洋參中克隆到了一個細胞色素P450（CYP6H）并進行了過表達和RNAi研究。RTPCR分析發(fā)現(xiàn)在過表達載體轉(zhuǎn)化的西洋參毛狀根中CYP6H表達量顯著增加，同時毛狀根中原人參二醇型皂苷（Rb1， Rb2， Rc， Rd）含量減少，原人參三醇型皂苷（Re，Rf， Rg1）含量增加，結(jié)合RNAi等實驗結(jié)果證明在西洋參中CYP6H能對原人參二醇的6位進行羥基化，將原人參二醇轉(zhuǎn)化為原人參三醇。

盡管生物合成途徑解析始終是中藥和天然產(chǎn)物研究領域的焦點，但是相關途徑的解析進展非常緩慢，一些具有重大商業(yè)價值的天然藥物，如紫杉醇、長春堿、喜樹堿等的合成途徑至今還未被完全解析。一直以來，遺傳信息的匱乏和候選基因篩選手段的缺失是限制天然產(chǎn)物途徑解析的2個主要瓶頸。隨著高通量測序技術的出現(xiàn)和生物信息學分析方法的逐步完善，使人們看到了克服兩大瓶頸的曙光。高通量測序技術導致測序成本急劇下降，使得廉價快速獲得基因信息成為可能。一些重要的藥用模式生物，如靈芝[3940]、丹參[41]和長春花[42]等的基因組相繼繪制完成。高精度的基因組圖譜可以提供準確的基因位置信息，為基因簇的發(fā)掘提供便利。而轉(zhuǎn)錄組測序和分析技術的進步使得在全基因組水平上進行共表達分析成為可能。隨著本草基因組學研究的進一步深入，和各種組學技術的綜合運用，天然產(chǎn)物合成途徑解析研究將進入一個快速發(fā)展的“黃金時期”。天然產(chǎn)物生物合成途徑解析將為天然產(chǎn)物合成生物學研究提供豐富的元件，推動該學科的發(fā)展，為天然藥物的生產(chǎn)和研發(fā)提供新的化合物來源；同時途徑解析也將為中草藥的分子育種研究提供“功能性分子標記”，加速優(yōu)良品種的選育，推動中藥農(nóng)業(yè)的發(fā)展[43]。

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[責任編輯 孔晶晶]