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拉莫三嗪納米脂質體的制備及腦靶向作用的研究

宋 寧1李穎寰2*

(1.首都醫(yī)科大學藥學院藥劑學系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學藥學院新藥藥理學系，北京 100069)

癲癇是一組以大腦神經(jīng)元異常放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病，具有突發(fā)性、反復發(fā)作的特點。全球大約1%的人口受癲癇困擾[1]，給病人個人、家庭和社會都造成了很大的危害和影響?？拱d癇藥物主要用于減輕癲癇發(fā)作的頻率和程度。拉莫三嗪(1amotrigine，LTG)是苯三嗪類的新一代廣譜抗癲癇藥物，其抗癲癇譜較廣，是治療特發(fā)性全面性發(fā)作和部分性發(fā)作的一線藥物，1991年上市，為口服片劑。拉莫三嗪口服時大部分被肝臟代謝，食物可以影響其吸收[2]，治療時需要逐漸增加藥物劑量，引起的皮疹可能發(fā)展成為Stevens-Johnson綜合征[3]，并已發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[4]。因此，有必要研究新型藥物遞送系統(tǒng)，將藥物有效遞送到病灶部位“腦”，提高抗癲癇藥物的療效，減少不良反應。

由于血腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)和一些生物因素的限制，阻擋了抗癲癇藥物進入大腦并維持有效的治療濃度[5]。另外有部分藥物被BBB上的分子外排泵重新泵回到血管內，使抗癲癇藥物在腦內的聚積能力下降。脂質體(liposome)是一種類生物膜的磷脂分散在水相中形成的雙分子層結構，粒徑大小可以從20納米到幾十微米，可作為疏水、親水以及兩親性藥物的載體。脂質體表面可進一步適當修飾，使其作用于特定的靶器官。脂質體具有很高的親脂性，可通過如被動轉運、與腦血管內皮細胞膜發(fā)生膜融合或通過內吞途徑轉運至腦實質。由于脂質體具有在人體內無毒、無免疫原性、可生物降解及緩釋等優(yōu)點而被廣泛用作藥物的載體[6]。因此本研究擬制備納米級別的拉莫三嗪納米脂質體(lamotrigine nano-liposome，LTG-NL)，旨在促進藥物跨過血腦脊液屏障，增強其抗癲癇的療效，減少不良反應。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器和實驗動物

拉莫三嗪(KS-1074，英國Key Organics公司)；卵磷脂(A0346624，美國Acros Organics公司)；Sephadex G-50(S8150，中國Solarbio公司)；膽固醇(中國Bjkebio公司)；吐溫80(103170，美國MP Biomedicals公司)；氯仿(中國北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司)；甲醇(美國Fisher Scientific公司)；其他試劑均為分析純。

超聲清洗機(KQ-500E型超聲波清洗器，中國昆山市超聲儀器有限公司)；探頭超聲儀(Vibra Cell CV18，美國SONICS公司)；旋轉蒸發(fā)儀(Laborota 4000，德國Heidolph Instruments公司)；激光納米粒度儀(ZetaPLUS Analyzer，美國Brookhaven Instruments Corp公司)；掃描電子顯微鏡(JSM-6360LV，日本Jeol公司)；透射電子顯微鏡(JSM-1230LV，日本Jeol公司)；高效液相色譜(high performance liquid chromatography， HPLC)儀(Waters e2695，美國Waters公司)；C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，Symmetry公司，美國)，組織勻漿器(PR-250，美國Pro公司)；離心濃縮儀(CentrlVap，美國Labconco公司)。

ICR小鼠84只，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物中心[許可證號：SCXK(京)2002-2003]。

1.2 實驗方法

1.2.1 拉莫三嗪納米脂質體的制備

采用薄膜分散法制備，將卵磷脂和膽固醇(摩爾比為5∶1)溶于含5%(體積分數(shù))甲醇的氯仿液，按照質量比為1∶10的藥脂比加入LTG，在旋轉蒸發(fā)儀上旋膜后，真空干燥器內過夜，然后用含吐溫80的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)水合30 min，探頭超聲5 min，最后得到帶乳光的混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆?。以粒徑和外觀(有無沉淀)為指標，考察膜材中卵磷脂與膽固醇的比例、藥脂比及吐溫的量對脂質體放置15 d穩(wěn)定性的影響，篩選LTG-NL的最優(yōu)處方。

1.2.2 拉莫三嗪納米脂質體的物理學表征

LTG-NL用PBS稀釋10倍后，采用激光納米粒度儀測定其粒徑；LTG-NL樣品用蒸餾水稀釋，將稀釋的樣品滴20 μL于蓋玻片上，37 ℃烘干后，噴金，進行掃描電鏡觀察。取10 μL稀釋的樣品置于銅網(wǎng)表面，下襯濾紙，37 ℃烘干后，固定電鏡電子束電壓為80 kV，移動坐標，調節(jié)放大倍數(shù)，進行透射電鏡觀察。

1.2.3 拉莫三嗪納米脂質體中藥物測定方法的確立

1)色譜條件：采用HPLC法，分析柱為C18色譜柱，流動相為甲醇∶5 mmol·L-1磷酸二氫鈉溶液(體積比為40∶60；pH6.25)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，進樣量10 μL，測定LTG-NL中的藥物。

2)標準曲線的建立和精密度、回收率的考察：精密稱取LTG 10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成儲備液。稀釋儲備液得到終質量濃度分別為0.5、1、2、4、8、10、16、20、24、32、40 μg·mL-1的標準溶液，HPLC檢測，以峰面積(A)為縱坐標，樣品質量濃度(C)為橫坐標，線性回歸，繪制標準曲線。將儲備液配成低、中、高3個質量濃度(2、10、20 μg·mL-1)的標準溶液，HPLC檢測，早、中、晚各測1次，連續(xù)檢測3 d，計算日內精密度、日間精密度和回收率。

1.2.4 拉莫三嗪納米脂質體包封率的測定

1)葡聚糖凝膠柱回收率的測定：將Sephadex G-50葡聚糖凝膠浸泡在蒸餾水中，溶脹過夜，濕法填柱，柱高17 cm，內徑1 cm，用蒸餾水洗脫平衡，分別取0.5、0.8、1.0 mL 3個劑量的LTG-NL各2份，其中第一份過凝膠柱接取90 mL洗脫液，用甲醇破乳并定容至100 mL，HPLC檢測藥物質量濃度得C1；第二份直接加甲醇破乳并定容至100 mL，檢測藥物質量濃度得C2，C1/ C2即為回收率。

2)包封率的測定：于葡聚糖凝膠柱加樣LTG-NL 0.5 mL，用蒸餾水洗脫，流速為1.5 mL·min-1，用EP管接收洗脫液，每管2 mL，分別用甲醇稀釋10倍破乳，0.45 μm微孔濾膜過濾后，檢測藥物質量濃度。另取LTG-NL 0.5 mL，直接加甲醇破乳后測定其中LTG為脂質體中的藥物總量，按下式計算藥物包封率：包封率=(脂質體中包封的藥物量/藥物總量)×100%。

1.2.5 拉莫三嗪納米脂質體小鼠體內藥物動力學及組織分布實驗

1)組織萃取方法：將84只ICR小鼠采用隨機數(shù)字表法分成2組(LTG組和LTG-NL組，n=6)，編號稱體質量，實驗前禁食不禁水，然后分別腹腔注射給予等量的LTG混懸液和LTG-NL液，劑量為8 mg·kg-1，分別于注射后15、30、60、90、120、180、240 min各時間點摘除小鼠眼球取血，置于抗凝管中，離心3 000 r/min，10 min，取上清液200 μL，加入400 μL甲醇，渦旋混勻，離心10 000 r/min，10 min后，取上清500 μL，濃縮干燥，加入200 μL甲醇復溶，0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣，HPLC檢測。取血后立即處死動物，取出腦組織，精密稱質量，加入pH7.4的PBS液勻漿(組織質量∶PBS體積=1∶4)，離心6 000 r/min，10 min，取上層離心液200 μL，加入400 μL甲醇，渦旋混勻，離心10 000 r/min，10 min后，取上清500 μL，濃縮干燥，加入200 μL甲醇復溶，0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣，HPLC檢測，色譜條件同含量測定。

2)方法學驗證：精密移取2.3.2項下的LTG儲備液，加入空白血漿或腦組織勻漿液，稀釋后得到LTG終質量濃度為0.25、0.5、1、2、4、8、10、16、20、24、32、40 μg·mL-1的溶液，同實驗方法項下操作，HPLC進樣，以峰面積(A)為縱坐標，樣品質量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線。取低、中、高3個濃度(LTG質量濃度分別為2、10、20 μg·mL-1)的血漿及各組織標準品溶液，同實驗方法項下操作，HPLC進樣，早、中、晚各測1次，連續(xù)檢測3 d，計算日內精密度、日間精密度及方法回收率。

用甲醇稀釋LTG儲備液，分別得到2、10、20 μg·mL-13個質量濃度的LTG標準品溶液，HPLC檢測，得到LTG純標峰面積；然后將這3個質量濃度的標準品溶液加入到空白血漿或各組織勻漿液中，混勻后同實驗方法項下操作，得到LTG血漿或組織峰面積，以(血漿或組織峰面積/純標峰面積)計算萃取回收率。

1.2.6 腦靶向作用評價

依據(jù)文獻[7]創(chuàng)建的一級消長型公式和廣義零級消長型公式，采用基于非線性最小二乘法的高斯-牛頓迭代法擬合出小鼠腦中拉莫三嗪的最適質量濃度方程，并繪制擬合曲線。

其中T為零級釋藥時間，k1代表曲線上升段速率常數(shù)，k2代表T時間后曲線下降段速率常數(shù)。

依據(jù)對數(shù)梯形法則計算質量濃度-時間曲線下面積(area under curve，AUC)，計算靶向效率(targe efficiency，TE)和靶向指數(shù)(target index，TI)，公式如下，評價腦靶向作用。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 拉莫三嗪納米脂質體處方篩選

采用單因素考察法，考察了固定藥脂比條件下，不同摩爾比的卵磷脂與膽固醇對脂質體的粒徑和穩(wěn)定性(外觀有無沉淀)的影響(表1)。可以看出，當藥脂比為1∶25時，制備的脂質體粒徑和穩(wěn)定性均較好；藥脂比為1∶20時，卵磷脂與膽固醇摩爾比為5∶1的LTG-NL穩(wěn)定性較好。固定卵磷脂與膽固醇的摩爾比為5∶1，比較了不同藥脂比對脂質體的粒徑和穩(wěn)定性的影響，結果顯示增大藥脂比為1∶15和1∶10后LTG-NL的穩(wěn)定性僅為1 d，隨即發(fā)生沉淀(表2)。繼續(xù)在處方中加入吐溫80，改善制劑穩(wěn)定性，分別比較了處方中不同吐溫80對LTG-NL粒徑和穩(wěn)定性(外觀有無沉淀)的影響(表3)，結果發(fā)現(xiàn)吐溫80的加入顯著降低了脂質體的粒徑，當藥脂比為1∶15時，加入0.5%～2%的吐溫80制備的脂質體粒徑和穩(wěn)定性均較好；當藥脂比提高到1∶10時，加入2%的吐溫80得到的脂質體穩(wěn)定性較好，可達到14 d?？紤]到提高藥脂比有利于降低成本，確定LTG-NL的處方為藥脂比為1∶10，卵磷脂與膽固醇的摩爾比為5∶1，吐溫80為2%，得到LTG質量濃度為1 mg·mL-1、脂質質量濃度為10 mg·mL-1的LTG-NL。

表1 磷脂與膽固醇比例對脂質體粒徑和穩(wěn)定性的影響

表2 藥脂比對脂質體粒徑和穩(wěn)定性的影響

表3 磷脂與膽固醇比例為5∶1時藥脂比和吐溫80的比例對脂質體粒徑和穩(wěn)定性的影響

2.2 拉莫三嗪納米脂質體的物理表征

LTG-NL的平均粒徑為(51.56±1.21)nm，粒徑小且分布窄(圖1)；掃描電鏡和透射電鏡下LTG-NL呈球形，粒徑大小均勻，與粒徑測定結果一致(圖2)。

2.3 拉莫三嗪納米脂質體測定結果

HPLC檢測結果顯示拉莫三嗪的出峰時間為9.7 min，在0～40 μg·mL-1質量濃度范圍內線性關系良好，回歸方程A=34547C-2819，R2=0.999 9。日內精

圖1 拉莫三嗪納米脂質體粒徑分布

LTG-NL：lamotrigine nano-liposome.

圖2 拉莫三嗪納米脂質體在掃描電鏡和透射電鏡下的形態(tài)圖

SEM：scanning electron microscope； TEM：transmission electron microscope；LTG-NL：lamotrigine nano-liposome.

密度RSD值為0.73%～1.72%，日間精密度相對標準偏差(relative stand deviation，RSD)值為1.59%～2.22%；回收率測定的平均值為98.42%，RSD值為0.53%～1.03%，均符合方法學要求。

2.4 拉莫三嗪納米脂質體的包封率測定結果

葡聚糖凝膠柱回收率為93.34%～99.22%，符合方法學要求。用該法測定LTG-NL的包封率時，接收液在約第26～38 mL處為脂質體部分，在第52～54 mL處為游離藥，洗脫曲線詳見圖3，按公式計算LTG-NL的包封率為(91.33±0.8)% (n=3)。

2.5 拉莫三嗪納米脂質體小鼠體內藥物動力學及組織分布

方法學研究結果顯示腦組織中雜質峰不干擾LTG的測定，血漿及腦組織HPLC檢測結果顯示拉莫三嗪在0～40μg·mL-1質量濃度范圍內線性關系良好，萃取回收率平均值為80.3%，日內精密度、日間精密度和方法回收率，均符合方法學要求。

圖4為給藥后小鼠血漿和腦組織的藥物分布動力學散點圖，顯示LTG-NL組的血藥濃度-時間曲線明顯高于LTG組，在腦中的分布量顯著高于LTG組；LTG-NL組在1～3 h腦組織中的藥物濃度基本持平，遠遠高于LTG組，析因方差分析統(tǒng)計結果顯示血漿藥物濃度和腦組織藥物濃度的主效應均為P<0.01，說明應用LTG和LTG-NL后兩者的血漿藥物濃度和腦組織藥物質量濃度差異有統(tǒng)計學意義。由此可見，相較于LTG組，LTG-NL組可以顯著延長LTG在腦組織的作用時間。

圖3 拉莫三嗪納米脂質體包封率測定的洗脫曲線

2.6 小鼠腦靶向作用評價

圖5顯示了腦組織中游離LTG組和LTG-NL組的藥物質量濃度經(jīng)時變化擬合曲線，2組的最適質量濃度方程均為廣義零級消長型公式，可以看出擬合曲線基本通過實測點，擬合結果良好。LTG組和LTG-NL組的擬合參數(shù)A(6.6vs8.0)，k1(8.6vs7.0)和k2(0.2vs0.3)均在同一個數(shù)量級，體現(xiàn)為2組制劑在腦組織中的經(jīng)時曲線的上升段和下降段斜率基本相同，平臺期的零級釋藥時間T值在LTG-NL組為3.1 h，遠大于游離LTG組的0.9 h，顯示LTG-NL顯著延長了藥物在腦組織的駐留時間，具有較好的腦靶向治療作用。表4中列出了相應的AUC值，據(jù)此分別計算得到靶向參數(shù)TE和TI，LTG組的TE僅為0.9，而LTG-NL組的TE為1.1(大于1)，說明LTG-NL輸送到腦組織中的藥物量超過了血漿藥物量，顯著提高了LTG 在腦組織的質量濃度，具有腦靶向性；靶向指數(shù)TI值顯示LTG-NL組在腦的AUC值是LTG組的1.5倍，表明LTG-NL具有明顯的腦靶向性。

3 討論

拉莫三嗪是治療部分性發(fā)作癲癇的主要藥物，但是近年來臨床上出現(xiàn)了對拉莫三嗪耐藥的難治性癲癇病人，如果僅靠加大藥物劑量，則不可避免地會出現(xiàn)藥物的毒性作用。研究[5]顯示，耐藥的原因為血腦脊液屏障上的多藥轉運蛋白通過其外排泵的功能，將多種抗癲癇藥物泵出血腦脊液屏障外，使藥物難以到達腦內作用靶區(qū)，癲癇發(fā)作不能被有效控制。因此，科學家們開始從藥劑學方面尋求解決辦法。已有文獻報道卡馬西平固體脂質納米粒[8]和乙琥胺殼聚糖納米粒[9]的制備。本實驗結果顯示，LTG-NL能夠很好地將LTG轉運入腦，表明納米脂質體可作為LTG良好的藥物傳遞系統(tǒng)。采用薄膜分散法制備LTG-NL的方法簡單，得到的LTG-NL粒徑小、分布均勻。在脂質體的處方中加入表面活性劑吐溫80，一方面可以改善難溶性藥物與脂質成分的相容性，減少脂質體的沉淀，提高脂質體的包封率和穩(wěn)定性，同時吐溫80促進脂質體透過血腦脊液屏障進入腦內[10]；另一方面，文獻[10]顯示吐溫80兼有聚乙二醇柔性的特點，制備得到的柔性納米脂質體由于吐溫80在脂質體表面形成立體位阻屏障，在血液中不易被血漿蛋白識別、攝取，從而有效提高了到達靶組織的藥物量。另有文獻[11]報道吐溫80可抑制血腦脊液屏障的P糖蛋白，從而抑制藥物的外排，增加腦內藥物的質量濃度。本實驗結果顯示，LTG-NL組小鼠腦內藥物質量濃度呈現(xiàn)擬零級的釋放動力學過程，零級釋藥時間T值為3.1 h(LTG組僅為0.9 h)，AUC值也為LTG組的1.5倍，靶向效率TE值為1.1，顯著延長了腦中藥物的質量濃度和作用時間。因此，LTG-NL是一種具有發(fā)展前景的腦靶向遞藥系統(tǒng)。

圖4 小鼠腹腔注射拉莫三嗪混懸液和拉莫三嗪納米脂質體8 mg·kg-1后血漿及腦組織中拉莫三嗪的藥時曲線圖

LTG：lamotrigine； LTG-NL：lamotrigine nano-liposome.

圖5 拉莫三嗪混懸液和拉莫三嗪納米脂質體給藥后>小鼠腦內拉莫三嗪濃度擬合曲線

Dots represent experimental data (n=6) and lines represent best-fit curves.LTG：lamotrigine； LTG-NL：lamotrigine nano-liposome.

表4 拉莫三嗪混懸液和拉莫三嗪納米脂質體用藥后小鼠血漿及腦藥時曲線下面積

AUC：area under ROC curve；LTG：lamotrigine； LTG-NL：lamotrigine nano-liposome.

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編輯 孫超淵

癲癇病臨床醫(yī)學研究北京市重點實驗室開放課題資助項目(2014DXBL01)。This study was supported by Opening Foundation of Beijing Key Laboratory of Epilepsy(2014DXBL01).

時間：2017-01-17 23∶21

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2321.006.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.024]

2016-06-15)

*Corresponding author， E-mail：huan694@163.com