師文娟 戚智鋒 劉克建

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心 腦血管病研究室，北京 100053)

· 腦血管病、認(rèn)知障礙的基礎(chǔ)及臨床研究 ·

常壓高濃度氧下調(diào)電壓依賴性陰離子通道蛋白對腦缺血-再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用

師文娟 戚智鋒 劉克建*

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心 腦血管病研究室，北京 100053)

目的 觀察常壓高濃度氧治療(normobaric hyperoxia， NBO)對腦缺血-再灌注大鼠電壓依賴性陰離子通道蛋白(voltage-dependent anion channel ， VDAC)以及凋亡蛋白細(xì)胞色素C(cytochrome C， CytC)和活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)的影響，初步探討其作用機(jī)制。方法將15只健康成年雄性SD大鼠(280～320 g)采用數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)組(Sham)、正常氧濃度組(Normoxia)和NBO組，采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞模型，模型大鼠缺血1.5 h，再灌注24 h。Sham組和Normoxia組大鼠術(shù)后呼吸普通空氣，NBO 組大鼠術(shù)后至再灌注前呼吸100%常壓氧氣。采用Western blotting方法，檢測腦缺血半影區(qū)VDAC、CytC和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果1)與Sham組相比，Normoxia組缺血側(cè)半影區(qū)VDAC顯著升高(P<0.05)；與Normoxia組相比，NBO組缺血側(cè)半影區(qū)VDAC顯著降低(P<0.05)；2)與Normoxia組相比，NBO組缺血側(cè)半影區(qū)凋亡蛋白CytC和cleaved caspase-3顯著減少(P<0.05)。結(jié)論NBO治療可能通過調(diào)節(jié)缺血側(cè)半影區(qū)電壓依賴性陰離子通道蛋白VDAC的表達(dá)來抑制腦缺血誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，從而實現(xiàn)腦神經(jīng)保護(hù)作用。

腦缺血-再灌注；常壓高濃度氧；電壓依賴性陰離子通道蛋白；凋亡

線粒體是神經(jīng)細(xì)胞中極為重要的細(xì)胞器，不僅對物質(zhì)能量代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理活動具有重要調(diào)節(jié)作用，而且在調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中起決定性作用。線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道蛋白(voltage-dependent anion channel， VDAC)是線粒體依賴性凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白，與細(xì)胞生存密切相關(guān)[1-2]。研究[3]顯示缺血缺氧后VDAC表達(dá)上調(diào)，嚴(yán)重影響線粒體的正常功能，因此有效調(diào)控VDAC蛋白的表達(dá)及其功能，對于減輕缺血損傷具有重要意義。常壓高濃度氧(normobaric hyperoxia ， NBO)治療是一種通過提高腦缺血半影區(qū)組織氧分壓，直接改善缺血腦組織氧合狀態(tài)的有效易行的療法[4-5]。NBO治療可以顯著減少大腦缺血組織梗死體積，可能是通過緩解腦缺血導(dǎo)致的線粒體代謝功能障礙、降低腦缺血半影區(qū)細(xì)胞凋亡水平發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[6]。然而，對于NBO治療調(diào)控細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制尚不完全清楚，NBO對線粒體依賴性凋亡的關(guān)鍵蛋白VDAC有何影響？筆者推測NBO抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，可能是通過調(diào)控線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道蛋白VDAC的表達(dá)水平來實現(xiàn)的，本研究旨在利用大鼠腦缺血1.5 h 再灌注24 h 模型，研究NBO治療對腦缺血半影區(qū)VDAC以及相關(guān)凋亡蛋白的影響，探究NBO治療潛在的神經(jīng)保護(hù)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

VDAC抗體(CST公司，美國)，CytC抗體(BD公司，美國)，cleaved caspase-3抗體(CST公司，美國)，β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋公司)，手術(shù)顯微鏡 ( Carl Zeiss公司，德國 )， SPF級雄性SD大鼠15只，體質(zhì)量280～320 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0001]。

1.2 動物模型制作及取材

采用數(shù)字表法將SD大鼠隨機(jī)分為Sham組(n=3)、Normoxia組(n=6)和NBO組(n=6)。稱量大鼠體質(zhì)量后，先使用5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉大鼠，后使用2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷混合70%(體積分?jǐn)?shù))N2O及30%(體積分?jǐn)?shù))O2維持大鼠麻醉狀態(tài)。借鑒改良的Longa線栓法[7]制備大鼠MCAO缺血再灌注模型：于大鼠頸部正中切口，鈍性分離組織，暴露右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動脈；電凝頸外動脈后，在頸外動脈殘端剪口，將線栓插入頸內(nèi)動脈，至線栓頂端距離頸總動脈分叉處約1.8～2.0 cm且遇阻力感時停止。手術(shù)過程中監(jiān)測大鼠心率、肛溫及平均動脈壓，保持各項生理參數(shù)在正常范圍。阻斷血流1.5 h后，拔出線栓電凝血管切口恢復(fù)血流灌注。Sham組大鼠進(jìn)行手術(shù)及插栓操作后即刻拔出線栓，并電凝血管恢復(fù)血供。NBO組大鼠于缺血5 min后，置于通入100%(體積分?jǐn)?shù)) O2的麻醉盒中，其他2組大鼠置于空氣環(huán)境。再灌注24 h后，使用水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)心臟灌注PBS溶液沖凈血管內(nèi)的血液，斷頭取腦。于鼠腦視交叉處作冠狀切片，向前囟方向切2 片，小腦方向切4 片，每片厚度約2 mm。將第2片和第4片腦組織進(jìn)行TTC染色，留取第3片腦組織用作Western blotting檢測。

1.3 Western blotting檢測

選取缺血側(cè)半影區(qū)腦組織，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑后置于冰上勻漿，冰浴30 min充分裂解后于4 ℃、12 000 g，離心30 min，吸出上清液體，采用BCA法測定蛋白濃度。在樣品中加入上樣緩沖液，煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，以90 V恒定電壓轉(zhuǎn)膜90 min。印跡膜在5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 牛奶中封閉1 h后，置于合適稀釋度的一抗溶液中4 ℃孵育過夜，VDAC抗體(1∶1 000)，CytC抗體(1∶1 000)，cleaved-caspase-3抗體(1∶1 000)，β-actin抗體(1∶1 000)。吸出一抗孵育液，以TBST漂洗5 min，重復(fù)3次；加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。吸去二抗，以TBST漂洗5 min，重復(fù)3次；在膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，使用Chemi Scope化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)掃描分析。蛋白水平用VDAC、CytC或cleaved caspase-3與相應(yīng)β-actin的條帶灰度比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NBO治療對大鼠腦缺血梗死體積的影響

TTC 染色結(jié)果顯示，NBO組大鼠腦缺血梗死體積明顯小于Normoxia組(P<0.05)：NBO組腦缺血梗死體積比例為(65.94±4.29)%，Normoxia組腦缺血梗死體積比例為(38.28±5.12)%。典型 TTC 染色如圖1 所示。

圖1 缺血再灌注大鼠腦組織TTC染色

TTC: triphenyl tetrazolium chlorid； NBO:normobaric hyperoxia.

2.2 NBO治療對大鼠腦缺血半影區(qū)線粒體外膜電壓離子通道蛋白的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示：與Sham組相比，Normoxia組缺血側(cè)半影區(qū)VDAC蛋白顯著升高(Sham組：1.00±0.00，n=3；Normoxia組：2.20±0.32，n=6，P<0.05)；與Normoxia組相比，NBO組缺血側(cè)半影區(qū)VDAC蛋白明顯降低(Normoxia組：2.20±0.32；NBO組：1.37±0.19，n=6，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明NBO抑制了缺血-再灌注大鼠缺血損傷引起的VDAC表達(dá)上調(diào)(圖2)。

2.3 NBO治療對大鼠腦缺血半影區(qū)凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示：與Sham組相比，Normoxia組缺血側(cè)半影區(qū)CytC蛋白顯著升高；而NBO組缺血側(cè)半影區(qū)CytC蛋白明顯降低；與Normoxia組相比，NBO組缺血側(cè)半影區(qū)CytC蛋白顯著減少(Normoxia組：2.60±0.46；NBO組：1.36±0.25，n=6，P<0.05)。

圖2 Western blotting檢測大鼠腦缺血半影區(qū)VDAC蛋白水平

Compared with the sham group (n=3)， VDAC was increased in normoxia group significantly (n=6)(#P<0.05vssham group)， and VDAC is significantly reduced in ischemic penumbra of NBO group (n=6)， compared with the normoxia group (n=6)(*P<0.05vsnormoxia group). VDAC: voltage-dependent anion channel; NBO: normobaric hyperoxia.

與Normoxia組相比，NBO組缺血側(cè)半影區(qū)cleaved caspase-3蛋白顯著減少(Normoxia組：1.66±0.22；NBO組：1.07±0.13，n=6，P<0.05)。說明NBO減少了缺血-再灌注大鼠缺血損傷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，(圖3)。

圖3 Western blotting檢測大鼠缺血半影區(qū)CytC蛋白及cleaved caspase-3蛋白水平

Both of CytC and Cleaved Caspase-3 are significantly decreased in ischemic penumbra of NBO group (n=6)， compared with normoxia group (n=6) (*P<0.05vsnormoxia group ). CytC: cytochrome C； NBO: normobaric hyperoxia.

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞在缺血缺氧條件下的物質(zhì)和能量代謝異常是造成大腦缺血性損傷的主要原因，而線粒體作為細(xì)胞能量代謝的活動中心，同時也在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡過程中起決定性作用[8-9]。因此，缺血導(dǎo)致的線粒體代謝障礙是影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[10-12]。

電壓依賴性陰離子通道蛋白VDAC在線粒體外膜中極為豐富，是能量代謝分子進(jìn)出線粒體的必經(jīng)通道，在調(diào)節(jié)線粒體與胞質(zhì)間的物質(zhì)和能量代謝中發(fā)揮著重要作用，與細(xì)胞的生存密切相關(guān)[13]。既往研究[14]表明VDAC在線粒體依賴性凋亡中起關(guān)鍵作用，缺血缺氧條件下VDAC表達(dá)水平病理性上調(diào)，可能致使其結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常[15]。VDAC表達(dá)水平的升高會引起線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)變、線粒體腫脹、外膜破裂等不可逆損傷[16-17]，導(dǎo)致線粒體能量代謝紊亂；并且線粒體外膜完整性破壞會釋放駐留在膜間隙中的凋亡分子細(xì)胞色素C[18]，進(jìn)而激活caspase-3，從而實現(xiàn)線粒體介導(dǎo)的一系列細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)[19]。因此，保持線粒體穩(wěn)定的能量代謝水平，抑制線粒體通透性的病理性開放將可能是有效的腦損傷保護(hù)手段。

研究[20]表明NBO治療可通過改善缺血半影區(qū)組織血氧的量和缺血細(xì)胞的能量代謝能力來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，因此筆者推測NBO對于緩解缺血導(dǎo)致的線粒體代謝障礙也有積極作用，而作為線粒體通透性以及線粒體依賴性凋亡的核心蛋白，VDAC很可能是NBO治療的潛在作用對象。本研究顯示早期給予NBO治療顯著降低了VDAC病理性表達(dá)上調(diào)，從而降低線粒體外膜通透性，減少細(xì)胞色素C的釋放及caspase-3的激活，表明VDAC是NBO治療減緩缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的潛在靶點。筆者的研究有助于進(jìn)一步理解NBO治療腦缺血的可能機(jī)制，也為NBO聯(lián)合其他治療方式提供了指示。

綜上所述，本研究通過觀察NBO治療對電壓依賴性陰離子通道VDAC 以及細(xì)胞色素C釋放和活化型半胱天冬酶-3表達(dá)的影響，推測 NBO治療可能通過抑制VDAC的過度表達(dá)，減少凋亡信號細(xì)胞色素C釋放和caspase-3的激活，降低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性凋亡損傷，從而發(fā)揮對腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

[1] Shoshan-Barmatz V， Ben-Hail D. VDAC， a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacological target[J]. Mitochondrion， 2012， 12(1): 24-34.

[2] Mertins B， Psakis G， Essen L O. Voltage-dependent anion channels: the wizard of the mitochondrial outer membrane[J]. Biol Chem， 2014， 395(12)：1435-1442.

[3] Liao Z， Liu D， Tang L， et al. Long-term oral resveratrol intake provides nutritional preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury: involvement of VDAC1 downregulation[J]. Mol Nutr Food Res， 2015， 59(3)：454-464.

[4] Liu S， Liu W， Ding W， et al. Electron paramagnetic resonance-guided normobaric hyperoxia treatment protects the brain by maintaining penumbral oxygenation in a rat model of transient focal cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab， 2006， 26(10):1274-1284.

[5] Wu O， Benner T， Roccatagliata L， et al. Evaluating effects of normobaric oxygen therapy in acute stroke with MRI based predictive models[J]. Med Gas Res， 2012， 2(1): 5.

[6] Dong W， Qi Z， Liang J， et al. Reduction of zinc accumulation in mitochondria contributes to decreased cerebral ischemic injury by normobaric hyperoxia treatment in an experimental stroke model[J]. Exp Neurol， 2015， 272:181-189.

[7] Tajiri N， Dailey T， Metcalf C， et al. In vivo animal stroke models: a rationale for rodent and non-human primate models[J]. Transl Stroke Res， 2013， 4(3):308-321.

[8] 劉曉婷，王延讓，張明. 線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志， 2013， 30(2): 182-184.

[9] Norberq E， Orrenius S， Zhivotovsky B. Mitochondrial regulation of cell death: processing of apoptosis-inducing factor (AIF)[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2010， 396(1): 95-100.

[10]房亞蘭, 羅玉敏,趙詠梅. 大黃對缺血性腦血管病的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2015，36(5)：718-722.

[11]岳志偉, 劉強(qiáng),陳乃耀. 創(chuàng)傷性腦損傷和線粒體功能障礙[J]. 中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2016，19(4) ：645-650.

[12]馮政哲, 張海峰,于瀛,等.線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在兔顱內(nèi)動脈瘤生成中的作用[J]. 中國腦血管病雜志, 2015,12(1) :32-36.

[13]Shoshan-Barmatz V， De Pinto V， Zweckstetter M， et al. VDAC， a multi-functional mitochondrial protein regulating cell Life and death[J]. Mol Aspects Med， 2010， 31(3): 227-285.

[14]Park E， Lee G J， Choi S， et al. The role of glutamate release on voltage-dependent anion channels (VDAC) -mediated apoptosis in an eleven vessel occlusion model in rats[J]. PLoS One， 2010， 5(12): e15192.

[15]Yang M， Camara A K， Wakim B T， et al. Tyrosine nitration of voltage-dependent anion channels in cardiac ischemia-reperfusion: reduction by peroxynitrite scavenging[J].Biochim Biophys Acta， 2012， 1817(11): 2049-2059.

[16]Yu Z， Liu N， Li Y， et al. Neuroglobin overexpression inhibits oxygen-glucose deprivation-induced mitochondrial permeability transition pore opening in primary cultured mouse cortical neurons[J]. Neurobiol Dis， 2013， 56: 95-103.

[17]Ren R， Zhang Y， Li B， et al. Effect of β-amyloid (25-35) on mitochondrial function and expression of mitochondrial permeability transition pore proteins in rat hippocampal neurons[J]. J Cell Biochem， 2011， 112(5)：1450-1457.

[18]Matsumura M， Tsuchida M， Lsoyama N， et al. FTY720 mediates cytochrome c release from mitochondria during rat thymocyte apoptosis[J]. Transpl Immunol， 2010， 23(4): 174-179.

[19]Eloy L， Jarrousse A S， Teyssot M L， et al. Anticancer activity of silver-N-heterocyclic carbene complexes: caspase -independent induction of apoptosis via mitochondrial apoptosis-inducing factor (AIF)[J]. Chem Med Chem， 2012， 7(5): 805-815.

[20]Sun L， Strelow H， Mies G， et al. Oxygen therapy improves energy metabolism in focal cerebral ischemia [J]. Brain Res， 2011，1415 (1):103-108.

編輯 陳瑞芳

Normobaric hyperoxia protect cerebral ischemia/reperfusion injured rats by downregulating voltage-dependent anion channel protein

Shi Wenjuan， Qi Zhifeng， Liu Kejian*

(XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity，BeijingGeriatricMedicalResearchCenter，CerebrovascularDiseasesResearchInstitute，Beijing100053，China)

Objective To observe the effect of normobaric hyperoxia (NBO) on expression of voltage-dependent anion channel (VDAC)， cytochrome C (CytC) and cleaved caspase-3 induced by cerebral ischemia-reperfusion injury in rats， and preliminarily explore the mechanism of NBO treatment on prevention of apoptosis. Methods Fifteen healthy adult male Sprague-Dawley (SD) rats (280-320 g) were divided randomly into three groups: Sham group (n=3)， Normoxia group (n=6) and NBO group (n=6). A model operation of MCAO was performed using intraluminal suture method. The rats underwent MCAO for 1.5 h plus 24 h reperfusion. After model operation the rats of sham group and normoxia group breathed normal air， and instead NBO group rats breathed 100% oxygen until reperfusion. Western blotting was used to test the expression of VDAC， CytC and cleaved caspase-3 protein in ischemic penumbra region. Results Western blotting results showed that compared with the sham group， the VDAC protein expression of ischemic penumbra was increased (P<0.05) in the normoxia group， and compared with the normoxia group， the expression of VDAC protein in ischemic penumbra region was statistically significantly reduced (P<0.05) in NBO group. Compared with the normoxia group， the expressions of CytC protein and cleaved caspase-3 protein in ischemic penumbra region were statistically significantly decreased (P<0.05) in NBO group. Conclusion NBO treatment may inhibit cerebral ischemia-induced apoptosis by downregulating the excessive expression of voltage-dependent anion channel protein in ischemic penumbra region， thus to play a protective role in the ischemia/reperfusion injured brain.

cerebral ischemia-reperfusion; normobaric hyperoxia(NBO); voltage-dependent anion channel(VDAC); apoptosis

國家自然科學(xué)基金項目(81620108011，81571175)，北京市科技新星項目(Z141107001814045)資助。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81620108011，81571175)， Beijing Nova Program (Z141107001814045).

時間：2017-01-17 23∶22

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2322.008.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.009]

R 743.3

2016-11-28)

*Corresponding author， E-mail：kliu@salud.unm.edu