汪曉磊 馬建民 孟照洋 尹 奕 王艷玲

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院眼科，北京 100050;2.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院眼科，北京 100730)

· 眼病診療新技術 ·

急性高眼壓模型中p75NTR>抑制劑對視網膜神經節(jié)細胞作用的研究

汪曉磊1*馬建民2孟照洋1尹 奕1王艷玲1

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院眼科，北京 100050;2.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院眼科，北京 100730)

目的 驗證通過抑制p75NTR(p75 neurotrophin receptor)可降低急性高眼壓(acute ocular hypertension, AOH)對視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells, RGCs)的損傷作用。方法應用大鼠急性高眼壓模型，玻璃體腔注射p75NTR抑制劑(TAT-Pep5)，按建模后1、3、5 d取材，分為正常對照組、假手術組、急性高眼壓組、急性高眼壓+TAT-Pep5組。采用免疫熒光技術、Western blotting等方法檢測急性高眼壓模型中相關蛋白的表達變化。TdT介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)染色檢測細胞凋亡情況。結果急性高眼壓模型視網膜Müller細胞上proNGF表達增加。注射p75NTR抑制劑TAT-Pep5后急性高眼壓視網膜上cleaved-caspase 3蛋白量減少，并且RGCs凋亡數(shù)目減少。結論視網膜神經節(jié)細胞損傷可引起proNGF表達增加，選擇性阻斷Müller細胞上的p75NTR或干預其信號傳導通路，可以減少急性高眼壓模型中RGCs凋亡。

急性高眼壓；p75NTR；神經生長因子前體；TAT-Pep 5抑制劑；Müller細胞

青光眼作為一種最常見的不可逆性致盲眼病，其有效防治成為防盲、治盲和公共衛(wèi)生工作的重點。河北邯鄲的流行病學調查[1]結果顯示我國30歲以上人群中，由于青光眼導致的盲目占9.7%，預計2020年我國青光眼病人將高達2 800萬。

青光眼特征性損害的病理基礎是在各種損傷因素作用下導致的視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells, RGCs)變性死亡[2]。在青光眼中啟動RGCs凋亡的具體機制尚不清楚。研究[3-4]證實proNGF通過與p75NTR(p75 neurotrophin receptor)和Sortilin結合形成三聚體，進而介導了視網膜發(fā)育過程中RGCs的凋亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)急性高眼壓大鼠視網膜中，p75NTR和Sortilin蛋白表達量增加。本課題擬驗證通過抑制p75NTR可降低急性高眼壓對視網膜神經節(jié)細胞的損傷作用，從而為青光眼視神經保護的研究提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康Sprague-Dawley雄性大鼠，體質量200～250 g、8～10 周，SPF 級別，由首都醫(yī)科大學動物部提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)：2012-0001。采用數(shù)字表法隨機分為正常對照組(Ctrl，n=10)、假手術組(Sham，n=10)，急性高眼壓組(acute ocular hypertension，AOH，n=20)和急性高眼壓加玻璃體注藥組(AOH+TAT，n=20)，按處理時間分為1、3、5 d，隨機選用一眼作為實驗眼。免疫熒光染色選處理后5 d做觀察。每組動物n=5。小鼠源性單克隆p75NTR(美國Santa Cruz公司)，兔源性多克隆cleaved-caspase 3抗體(美國Cell signaling公司)，兔源性多克隆proNGF抗體(美國Sigma公司)，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠IgG、FITC標記山羊抗兔IgG、TRITC標記山羊抗兔IgG、TRITC 標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)，β-actin小鼠源性單克隆抗體(美國Proteintech公司)，TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)，TAT-Pep5(美國Calbiochem公司)。

1.2 動物模型制作

所有實驗操作均遵循美國視覺與眼科學研究會(American Society for Vision and Ophthalmology,ARVO)有關眼科和視覺科學實驗動物使用規(guī)范，并得到首都醫(yī)科大學動物管理委員會的許可。實驗前首先排除動物眼部或全身性病變。參照文獻[5]，大鼠10%(質量分數(shù))水合氯醛腹腔注射麻醉后，復方托吡卡胺滴眼液散大瞳孔，倍諾喜眼液點眼表面麻醉。將27號針頭沿大鼠眼球顳側角鞏膜緣刺入前房，針頭另一端連接500 mL 0.9%(質量分數(shù))氯化鈉注射液，使眼內壓達110 mmHg( 1 mmHg=0.133 kPa)，術眼出現(xiàn)球結膜水腫、角膜水腫、虹膜及視網膜顏色蒼白、血管斷流等指征為缺血開始標志，持續(xù)1 h。術眼用紅霉素眼膏防止感染。手術完成后，各組分別在術后1、3、5 d過量麻醉處死動物，冰浴下取術眼。急性高眼壓處理后 3 h給藥。用10 μL微量注射器(hamilton)經穿刺口進入玻璃體腔，緩慢推注5μL TAT-Pep5。Sham組僅做前房穿刺，不升高眼壓。

1.3 免疫熒光染色

分別應由兔源性多克隆proNGF抗體(1∶200)、鼠源性單克隆p75NTR(1∶400)4℃過夜，室溫孵育1 h；加1∶400的二抗溶液，室溫下避光1h；滴加Propidium iodide溶液，室溫避光；加蓋玻片，指甲油封固，4℃避光保存。用Olympus FV1000共聚焦顯微鏡采集照片。

1.4 Western blotting法檢測

摘取大鼠眼球，完整分離視網膜組織。參照Sigma公司提供的蛋白抽提試劑及方法，參照BCA試劑盒說明。取總蛋白樣品，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白電泳；轉膜，漂洗，封閉，漂洗。應用兔源性多克隆proNGF抗體(1∶1 000)、兔源性多克隆cleaved-caspase 3抗體(1∶1 000)和鼠源性β-action(1∶20 000)4℃過夜，室溫孵育30 min。應用HRP標記的二抗(1∶4 000)孵育，室溫1h。TTBS漂洗3次。電化學發(fā)光法顯色發(fā)光、膠片曝光。應用圖像分析軟件Quantity One，對膠片中蛋白條帶進行灰度值分析，并以β-actin 蛋白為內參，計算各組蛋白與β-actin 的灰度比值，進行半定量分析。

1.5 TUNEL檢測

視網膜切片經干燥、水化、固定，乙醇∶乙酸(2∶1)處理5 min；0.2%(體積分數(shù))Triton-100破膜；Equibibration buffer 作用5～10 min；TdT孵育37度水浴75 min，混合物配比：平衡液45 μL、核苷混合物5 μL、rTdT酶1 μL；2×SSC 15 min終止反應(20μL +180μL PBS)；封片，觀察。每個視網膜切片選取10個視野進行計數(shù)分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 急性高眼壓對大鼠視網膜中proNGF和p75NTR表達的影響

通過免疫熒光共標結果顯示，proNGF和p75NTR在Müller細胞中共表達，主要集中在Müller細胞的終足和突觸(圖1A)。Western blotting 法檢測結果顯示proNGF蛋白條帶對應的27 000相對分子質量。與正常對照組(Ctrl,100%)比較，假手術組(Sham)、術后1 d、3 d、5 d大鼠視網膜組織內proNGF蛋白的表達量分別為99.2±0.01、240.15±31.18、260.29±12.61、202.77±0.36。急性高眼壓模型視網膜內proNGF蛋白的表達量升高(P<0.05，n=5)(圖1B、C)。

圖1 急性高眼壓模型視網膜中proNGF和p75NTR表達情況

A: colocalization of proNGF (green) and p75NTR(red) in retinas(n=5) by Confocal microscopy images; B:proNGF protein expression in AOH retinas(n=5) by Western blotting; C:quantitative analysis of proNGF protein expression levels(n=5);*P<0.05vsCtrl；P75NTR：p75 neurotrophin receptor；AOH：acute ocular hypertension.Ctrl：control group.

2.2 p75NTR抑制劑TAT-Pep5對急性高眼壓視網膜中RGCs凋亡的影響

采用TUNEL染色標記凋亡細胞，探討TAT-Pep5對急性高眼壓視網膜中RGCs影響。在AOH組視網膜中的RGCs凋亡細胞數(shù)目顯著增加，而AOH+TAT-Pep5組凋亡細胞數(shù)減少(圖2)。

2.3 p75NTR抑制劑TAT-Pep5降低急性高眼壓視網膜中cleaved-caspase 3蛋白的表達

Western blotting檢測結果顯示cleaved-caspase 3對應的17 000相對分子質量。與正常對照組(Ctrl,100%)比較，假手術組(Sham)、AOH組、AOH+TAT-Pep5組大鼠視網膜組織內cleaved-caspase 3蛋白的表達量分別為99.2±0.01、327.22±12.61、150±30.52。AOH+TAT-Pep5組、AOH組中的cleaved-caspase 3蛋白的表達量高于正常對照組(P<0.05，n=5)。Cleaved-caspase 3蛋白表達量在AOH組中明顯高于AOH+ TAT-Pep5組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，n=5)(圖3)。

圖2 p75NTR抑制劑對急性高眼壓視網膜上RGCs凋亡的影響

A:TUNEL staining were performed 5 days after AOH;B:The results showed that AOH caused significant increase of TUNEL-positive cells, but TAT-Pep5 could abolish this effect (n=5).*P<0.05vsAOH;P75NTR：p75 neurotrophin receptor；AOH：acute ocular hypertension；RGCs：retinal ganglion cells.

圖3 抑制p75NTR對AOH大鼠視網膜內cleaved-caspase 3蛋白表達水平影響

A:Western blotting results showed the effect of TAT-Pep5 on cleaved-caspase 3protein expression in retinas at 5 d after AOH; B: Quantitative analysis of cleaved-caspase 3 protein expression levels.*P<0.05vsCtrl,#P<0.05vsAOH group.P75NTR：p75 neurotrophin receptor；AOH：acute ocular hypertension;Ctrl：control group.

3 討論

研究[6-7]表明神經營養(yǎng)因子影響成熟神經元的變性。神經營養(yǎng)因子家族包括神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經營養(yǎng)因子3(neurotrophin 3，NT-3)、神經營養(yǎng)因子4/5(neurotrophin 4/5，NT-4/5)。

神經營養(yǎng)因子有兩類細胞表面受體[8]。一類原肌球蛋白激酶受體家族(tropomyosin related kinase，Trk)，主要與成熟神經營養(yǎng)因子結合，TrKA是NGF的受體，TrKB是BDNF和NT-4/5的受體，TrKC是NT-3的受體。另一類是p75NTR，是一種重要的神經元信號蛋白，可與全部的神經營養(yǎng)因子結合[9]。Kaplan等[10]研究結果顯示： proNGF可以同時激活p75NTR和 Sortilin這兩種細胞表面蛋白，繼而介導神經元細胞的凋亡。研究[11-16]發(fā)現(xiàn)，p75NTR和sortilin參與proNGF引起的成年嚙齒類視網膜神經節(jié)細胞凋亡。

本研究結果表明在視網膜中proNGF主要表達在Müller細胞。在急性高眼壓后1、3、5d的視網膜中，proNGF皆有表達，主要表達在Müller細胞和內層的視網膜。p75NTR主要表達于Müller細胞體和軸突中。

本研究發(fā)現(xiàn)在急性高眼壓動物模型視網膜中proNGF表達增高，成熟視網膜中p75NTR主要表達于Müller細胞終足，而不是RGCs。這就提示在急性高眼壓模型中proNGF也可能通過與p75NTR和Sortilin結合形成三聚體，進而介導了視網膜高眼壓損傷中RGCs的凋亡。為了驗證p75NTR信號通路對RGCs凋亡的影響，本研究使用了p75NTR的抑制劑TAT-Pep5。本實驗結果顯示選擇性阻斷p75NTR信號通路后急性高眼壓視網膜中RGCs凋亡數(shù)量減少；視網膜上RGCs凋亡數(shù)量在AOH+TAT-Pep5組與AOH組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明p75NTR抑制劑在一定程度上影響RGCs凋亡。本研究結果顯示在急性高眼壓視網膜中cleaved-caspase 3蛋白表達增加；而在用p75NTR抑制劑處理后，急性高眼壓視網膜中cleaved-caspase 3蛋白表達較AOH組明顯降低。這些發(fā)現(xiàn)說明急性高眼壓可造成內源性的proNGF表達增加，而proNGF可能通過與p75NTR結合從而參與調控RGCs的凋亡；而在阻斷p75NTR后可以減少細胞凋亡，從而促進RGCs細胞的存活。

本研究結果表明，通過選擇性阻斷Müller細胞上的p75NTR或干預其信號傳導通路，可以減少急性高眼壓模型中RGCs凋亡。本研究可能為保護RGCs的研究提供理論和實驗依據(jù)。

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編輯 慕 萌

Roles of p75NTRinhibitor on retinal ganglion cells in a rat model of acute ocular hypertension

Wang Xiaolei1*, Ma Jianmin2, Meng Zhaoyang1, Yin Yi1, Wang Yanling1

(1.DepartmentofOphthalmology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China; 2.DepartmentofOphthalmology,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100730,China)

Objective To explore the role of p75NTRinhibitor on suppressing retinal ganglion cells (RGCs) apoptosis in a rat model of acute ocular hypertension. Methods The acute ocular hypertension (AOH) rat model was established, and animals were divided into control (Ctrl), sham operation, AOH, AOH+ TAT-Pep5 treated groups (1,3 and 5d subgroups). Immunofluorescent staining was performed to detect the expression of proNGF and p75NTR. Western blotting was used to detect the protein expression levels of proNGF and cleaved-caspase 3. TUNEL assay was used to detect cell apoptosis. Results The expression of proNGF was increased in acute ocular hypertension model. When the p75NTRwas blocked by its inhibitor (TAT-Pep5), the number of death RGCs (TUNEL positive cell number) were less than that of AOH group. The results of Western blotting showed that the protein expression levels of cleaved-caspase 3 could be up-regulated in retina from AOH group or down-regulated in retina from AOH+TAT-Pep5 group when compared with that of Ctrl and AOH groups. Conclusion RGCs injury can increase proNGF expression. p75NTRblockade can potentiate the survival of RGCs.

acute ocular hypertension；p75NTR；proNGF；TAT-Pep 5 inhibitor；Müller cell

首都醫(yī)科大學基礎-臨床科研合作基金(14JL32)，首都醫(yī)科大學重點實驗室開放研究課題(2015YKSJ02)。This study was supported by Clinical-Basic Cooperation Program from Capital Medical University(14JL32)，Beijing Ophthalmology and Visual Sciences Key Laboratory (2015YKSJ02).

時間：2017-01-17 23∶49

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2349.022.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.005]

R 775

2016-11-28)

*Corresponding author， E-mail：wang1xiaolei@126.com