李小明，銀堯明，羅 穎，王 霞張 華

（1.遂寧市糧食質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，四川遂寧 629000；2.重慶市糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗站重慶 400037；3.四川巴中國家糧食質(zhì)量檢測站，四川巴中 636000）

糧食中真菌毒素快速定量檢測方法應用比較研究

李小明1，銀堯明1，羅 穎1，王 霞2張 華3

（1.遂寧市糧食質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，四川遂寧 629000；2.重慶市糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗站重慶 400037；3.四川巴中國家糧食質(zhì)量檢測站，四川巴中 636000）

采用便攜式真菌毒素快速定量檢測儀對玉米中黃曲霉毒素B1和嘔吐毒素進行定量檢測，同時與酶聯(lián)免疫法對比檢測結果。結果顯示黃曲霉毒素B1快速定量檢測卡檢出限為1.75 μg／kg；準確性與所采用酶聯(lián)免疫法無顯著差異；檢測結果變異系數(shù)范圍在7%～11.2%之間，平均變異系數(shù)為8. 7%；定量檢測儀臺間無顯著差異。嘔吐毒素快速定量檢測卡檢測限為0.078 mg／kg；定量檢測儀臺間無顯著差異；采用便攜式定量檢測儀具有簡單、快速、成本低、能實現(xiàn)現(xiàn)場操作且實時上傳數(shù)據(jù)并記錄監(jiān)測地點位置等優(yōu)勢，具有較好的推廣使用價值，特別適用于衛(wèi)生調(diào)查、研究、篩查等現(xiàn)場使用。

膠體金；黃曲霉毒素B1；嘔吐毒素；玉米；快速定量

真菌毒素是一種由霉菌或真菌產(chǎn)生的次生代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中［1］，主要有黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、赭曲霉毒素等。根據(jù)聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計，全世界每年約25%的谷物被霉菌所污染［2］。真菌毒素是一類具有致癌、致畸、致突變性的毒性極強的化合物，人們攝入被污染的食品后，會對人體健康產(chǎn)生極大損害。針對糧食質(zhì)量安全問題，《糧食管理流通條例》和糧食衛(wèi)生標準都明確規(guī)定糧食收購要對真菌毒素進行檢驗，但中國糧油種植區(qū)分布廣泛，糧食收購多集中在縣以下單位的收儲庫點，時間短，收購量大，無法及時利用現(xiàn)行國家標準規(guī)定的方法檢測糧食中真菌毒素含量［3］。

現(xiàn)有真菌毒素的定量分析一般采用薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和高效液相色譜法（HPLC）。3種方法均須在實驗室條件下嚴格控制條件，進行復雜的樣品前處理，才能出具結果，無法適應現(xiàn)場收購快速檢驗的需要。因此，建立簡便、高效、低成本的現(xiàn)場快速篩選檢測方法迫在眉睫［4］。近幾年，隨著生物技術應用的不斷突破，一種基于酶聯(lián)免疫反應原理的快速檢測方法——膠體金檢測技術應運而生，這項技術產(chǎn)品能在一定范圍內(nèi)準確、快速檢測真菌毒素的含量，適用于現(xiàn)場操作［5］。

為了驗證黃曲霉毒素B1（AFB1）與嘔吐毒素（DON）膠體金快速定量檢測卡在糧食中的適用性，本實驗對真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)與ELISA方法進行對比驗證。旨在開發(fā)簡便、快捷、準確，尤其前處理簡單，適用于現(xiàn)場快速的真菌毒素分析方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

參考糧食衛(wèi)生標準，確定本驗證實驗糧種為玉米，考慮到加標樣品的毒素分布、均勻性等影響，本驗證實驗全部采用射洪縣潼射鎮(zhèn)的樣品進行驗證，驗證毒素為AFB1和DON，供AFB1檢測用樣品為94份，供DON檢測用樣品為91份。

1.2 材料與設備

AFB1和DON膠體金快速定量測試卡：成都盛泰爾生物醫(yī)藥科技有限公司；Elisa試劑盒：美國Romer公司。

1.3 樣品處理

驗證用樣品為陽性玉米樣品，經(jīng)粗碎與連續(xù)多次用四分法縮減至0.5～1kg，然后全部粉碎全部通過20目篩，混勻。

稱取2 g樣品于提取瓶中，加入4 mL提取劑A，振搖5 min，靜置3 min，使用注射器和微孔濾膜過濾，收集1～1.5 mL樣液于1.5 mL塑料管中備用。取100 μL樣液加入樣品緩沖液400 μL混勻，待檢。

同時按照Elisa測試方法進行對比試驗。

1.4 樣品檢測

從檢測卡袋中取出檢測卡，在卡上做好樣品編號標記；用移液器吸取120 μL待檢樣液，滴入加樣孔中，加樣后開始計時，15 min放入手持式讀卡儀讀取結果。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉毒素B1

使用真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)和Elisa試劑盒共檢測94個樣品，其中有55個樣品AFB1含量小于2 μg／kg，39個樣品AFB1含量超過2 μg／kg。

2.1.1 方法的檢出限（LOD）

按照《糧油檢驗糧食中黃曲霉毒素B1測定膠體金快速定量法》（LS／T 6111—2015），用真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)測定7個低含量樣品中的AFB1檢測值，通過公式ˉX＋3×SD（ˉX為樣品的算術平均值，SD為樣品的標準偏差）計算出方法檢出限為1.75 μg／kg，見表1。

表1 AFB1快速定量檢測系統(tǒng)檢出限測試結果 μg／kg

2.1.2 準確性

用真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)分別測定39個不同AFB1含量樣品，測定結果與國標GB／T 5009. 22—2003第二法酶聯(lián)免疫法檢測結果進行配對t檢驗比較2種方法是否存在顯著性差異，經(jīng)計算t＝1.32，t雙尾臨界（0.05，39）＝2.02，t＜t雙尾臨界（0.05，39），說明AFB1快速定量檢測系統(tǒng)檢測結果與國標GB／T 5009.22—2003酶聯(lián)免疫結果無顯著性差異，見表2。

表2 AFB1快速定量檢測系統(tǒng)準確性對比結果 μg／kg

序號 樣品編號AFB1快速定量檢測系統(tǒng)檢測結果 酶聯(lián)免疫結果17 SN340 10 11 18 SN327 44 46.9 19 SN343 52 55 20 SN256 28 28 21 SN275 18 22.7 22 SN331 21 21.2 23 SN250 15 13.7 24 SN336 61 65 25 SN322 35 32.7 26 SN310 10 9.8 27 SN298 2.3 3.9 28 SN305 40 39.8 29 SN329 30 31.1 30 SN267 40 35.9 31 SN213 6.7 6.9 32 SN342 5 5.6 33 SN26 33 27.3 34 SN247 60 68 35 SN164 16 12.9 36 SN173 19 23 37 SN272 58 58 38 SN130 61 67 39 SN323 39 41.6

2.1.3 重復性

用真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)在相同實驗條件下，使用不同檢測卡檢測相同樣本，重復測定玉米高、中、低三種樣品，每個樣品重復檢測6次，測定結果見表3，重復測定的變異系數(shù)范圍在7%～11.2%之間，平均變異系數(shù)為8.7%。

表3 AFB1快速定量檢測系統(tǒng)重復性結果

2.1.4 臺間差

分別用2臺真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)儀器同時對39個不同AFB1含量樣品進行檢測，測定結果采用配對t檢驗來比較2臺儀器間是否存在顯著性差異，經(jīng)計算t＝0.26，t雙尾臨界（0.05，39）＝2.02，t＜t雙尾臨界（0.05，39），說明不同AFB1快速定量檢測系統(tǒng)的檢測結果無差異，見表4。

表4 AFB1快速定量檢測系統(tǒng)臺間對比結果 μg／kg

2.2 嘔吐毒素

使用真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)和Elisa試劑盒共檢測91樣品，其中有87個樣品DON含量小于0.25 mg／kg，4個樣品DON含量超過0.25 mg／kg。2.2.1 方法的檢出限（LOD）

按照《糧油檢驗糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定膠體金快速定量法》（LS／T 6113—2015），用真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)測定7個低含量樣品中的DON含量，通過公式ˉX＋3×SD（ˉX為樣品的算術平均值，SD為樣品的標準偏差）計算出其檢出限為0.078 mg／kg，見表5。

表5 DON快速定量檢測系統(tǒng)檢出限測試結果 mg／kg

2.2.2 準確性

用真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)分別測定4個不同DON含量樣品，測定結果與國標GB／T 5009. 22—2003第二法酶聯(lián)免疫法檢測結果進行配對t檢驗比較2種方法是否存在顯著性差異，經(jīng)計算t＝0.44，t雙尾臨界（0.05，4）＝2.78，t＜t雙尾臨界（0.05，4），說明DON快速定量檢測系統(tǒng)檢測結果與國標GB／T 5009.22—2003酶聯(lián)免疫結果無顯著性差異，見表6。

表6 DON快速定量檢測系統(tǒng)準確性對比結果 mg／kg

但是由于樣品收集太少且沒有超標（國標為1 mg／kg）和高值樣品，因此需要更多陽性樣品對準確性進行進一步驗證。

2.2.3 臺間差

分別用2臺真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)儀器同時對4個不同DON含量樣品進行檢測，測定結果采用配對t檢驗來比較2臺儀器間是否存在顯著性差異，經(jīng)計算t＝ 0.39，t雙尾臨界（0.05，4）＝2.78，t＜t雙尾臨界（0.05，4），說明不同DON快速定量檢測系統(tǒng)的檢測結果無差異，見表7。

表7 DON快速定量檢測系統(tǒng)臺間對比結果 mg／kg

3 結論

膠體金快速定量檢測卡法檢測玉米中黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素含量前處理簡單，僅有加樣、層析、讀數(shù)這3個步驟，在25 min之內(nèi)就能完成一個樣品的測定，方法要求條件低，操作簡單，適用于現(xiàn)場快速定量初篩檢測。其中黃曲霉毒素B1檢測的檢出限、準確性、重復性、臺間差等參數(shù)分析均能滿足測定要求；嘔吐毒素由于未收集到足夠的陽性樣品，未對重復性進行考察，準確性也需要更多陽性樣品進行確認，但是檢出限和臺間差等參數(shù)均滿足測定要求。

［1］施兆鵬，朱旗，毛清黎，等.糧食真菌毒素污染的預防與脫毒［J］.食品科學，2003（8）：264－268.

［2］段文仲，呂紅英，龐津霞.動物源性食品中黃曲霉毒素污染的控制研究［J］，動物科學，2009（7）：206－208.

［3］鞠興榮，萬忠民，陳建偉.糧食安全控制體系的建立［J］.糧食儲藏，2009（3）：18－21.

［4］姜翠翠，邱松山，李波，等.糧食中真菌毒素的檢測及脫毒方法探討［C］.“食品加工與安全”學術研討會暨2010年廣東省食品學會年會會議論文集，2010.

［5］張道宏，李培武，張奇，等.污染糧油食品的主要真菌毒素及膠體金免疫層析技術在快速檢測中的應用［J］.中國油料作物學報，2010（4）：577－582.

Comparative study on the rapid quantitative detection of mycotoxins in grain

LI Xiaoming1，YIN Yao－ming1，LUO Ying1，Wang Xia2，Zhang Hua3
（1.Suining food quality supervision and inspection station，Suining Sichuan 629000；2.Chongqing grain and oil quality supervision and inspection station，Chongqing 400037；3.Bazhong national food quality monitoring station，Bazhong Sichuan 636000）

The aflatoxin B1and deoxynivalenol in corn was quantitatively detected by portable mycotoxin rapid quantitative detector，the result was compared with that by enzyme linked immunosorbent assay. The results showed that the detection limit of aflatoxin B1was 1.75 μg／kg by rapid quantitative detection card.The accuracy had no significant difference between the two methods；weight measurement range of the coefficient of variation between 7%～11.2%，the average coefficient of variation was 8.7%；no significant difference among the quantitative detectors.The detection limit was 0.078 mg／kg by deoxynivalenol rapid quantitative detection card；no significant difference among the quantitative detectors.The portable quantitative detector has the advantages of simple，fast，low cost，can realize site operation and upload real－time data and recording monitoring site location，which is worth promotion，particularly being used in the health survey，research，screening and other field.

colloidal gold；aflatoxin B1；vomitoxin；maize；rapid quantitative

TS 207.3

A

1007－7561（2017）01－0054－04

2016－06－23

李小明，1974年出生，男，大學本科，工程師.