劉 逍，滕戰(zhàn)偉，婁玉杰

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

蛋氨酸對70日齡吉林白鵝產(chǎn)絨性能及IGF-Ⅰ基因mRNA相對表達量的影響

劉 逍，滕戰(zhàn)偉，婁玉杰*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

本試驗旨在探索日糧中添加蛋氨酸水平對吉林白鵝產(chǎn)絨性能及IGF-Ⅰ基因mRNA相對表達量的影響。選擇200只健康、體重均勻的28日齡吉林白鵝作為試驗對象，采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，分為4個處理組，包括1個對照組和3個處理組，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)10只鵝，在飼糧中分別添加0.25%、0.5%、0.75%的蛋氨酸，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，自由采食飲水，試驗期43 d。結(jié)果表明：70日齡時，各處理組的吉林白鵝的千朵重均顯著高于對照組（P＜0.05），絨朵長度和絨枝細度均差異不顯著（P＞0.05），但是隨著蛋氨酸水平的增加，各組千朵重、絨朵長度和絨枝細度有增加的趨勢，并且Ⅲ組最佳，Ⅳ組略低于Ⅲ組，且高于Ⅱ組和Ⅰ組；70日齡吉林白鵝各個部位的千朵重、絨朵長度及絨枝細度從高到低依次為胸部、腹部、背部；不同蛋氨酸處理組的鵝皮膚中IGF-Ⅰ基因mRNA相對表達量均顯著高于對照組（P＜0.05），Ⅲ組最高，Ⅳ組略低于Ⅲ組，但顯著高于Ⅱ組及Ⅰ組（P＜0.05），胸部的相對表達量明顯高于背部和腹部。因此，適量的添加蛋氨酸可以提高鵝的產(chǎn)絨性能以及IGF-Ⅰ基因mRNA的相對表達量。

吉林白鵝；產(chǎn)絨性能；蛋氨酸；IGF-Ⅰ

近年來，隨著人民生活水平的不斷增高，人們對羽絨制品的需求量越來越大。中國是世界上最大的羽絨生產(chǎn)國、出口國和消費國[1]。鵝羽絨具有保暖性強、柔軟等特點，因此，提高鵝羽絨的產(chǎn)量和質(zhì)量已成為鵝羽絨發(fā)展中的重要問題。蛋氨酸是一種含硫氨基酸，它是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位之一，也是禽類的第一限制性氨基酸。含硫氨基酸能夠提高合成角蛋白的強度，改善羽毛的質(zhì)量[2]。類胰島素生長因子-Ⅰ（IGF-I）是一類小分子多肽物質(zhì)，它廣泛分布在毛囊、毛乳頭等部位。有試驗表明，它可以促進體外培養(yǎng)的毛囊生長，適宜的蛋氨酸水平可以提高IGF-I基因的表達量[3]。本試驗擬通過研究在飼糧中添加不同水平蛋氨酸對吉林白鵝產(chǎn)絨性能及IGF-I基因表達的影響，探討蛋氨酸對羽絨生長的調(diào)控作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及日糧配方 選擇健康體重均勻的4周齡健康、體重（1156.53±38.37）g、公母各半的吉林白鵝200只作為試驗動物。飼養(yǎng)試驗期為2015年5-7月，試驗在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院養(yǎng)殖基地進行，試驗期為43 d。日糧參照美國NRC（1994）標(biāo)準(zhǔn)[4]，和實際生產(chǎn)情況進行日糧配制，飼料配方見表1。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 本試驗采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，隨機分為4個處理組，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)10只鵝，在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.25%、0.5%、0.75%的蛋氨酸，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，試驗期每天飼喂2次，06:00、16:00各1次，自由采食和飲水，每天觀察鵝的表現(xiàn)，及時記錄采食情況。

1.3 樣品采集 試驗鵝飼養(yǎng)到70日齡時，每個處理每個重復(fù)隨機選取1只試驗鵝屠宰，屠宰后選用干拔羽毛的方法，分別在鵝的背、胸、腹采集羽絨以及羽毛，裝袋，作為試驗樣品。采集背、胸、腹部皮膚，裝入凍存管，迅速放入-80℃液氮內(nèi)儲存，為提取皮膚總RNA做準(zhǔn)備。

1.4 產(chǎn)絨性能測定及方法

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4.1 千朵重的測定 在每個部位隨機選取1 000朵絨羽，用萬分之一電子天平稱重[5]。

1.4.2 朵絨長的測定 用千分卡尺量取絨朵根部至尖部長度。

1.4.3 絨朵絨小枝的細度的測定 用顯微投影儀測每根羽枝的直徑，每只鵝每個部位測定50根羽小絲。

1.5 IGF-I基因mRNA相對表達量的測定及方法

1.5.1 主要試劑及儀器 氯仿，異丙醇，無水酒精，DEpC水，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、SYBRRpremix，Ex TaqTM熒光染料（TaKaRa公司）,PCR Marker DL 2 000和瓊脂糖。Biofuge primo R型低溫離心機（美國Thermo公司）；StepOneplusTM熒光定量PCR儀；Powerpac Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Nanodrop2 000型分光光度計（美國Thermo公司）；Gel Doc 2 000型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.5.2 引物設(shè)計 參照 GenBank上IGF-I基因相關(guān)序列，序列號為DQ490222。利用Primer5.0設(shè)計引物，引物序列見表2。

1.5.3 方法 提取皮膚組織的總RNA[6]，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，用核酸定量儀測定總RNA濃度以及吸光度D260/D280的值，此值在1.8～2.0中間說明RNA純度較高，適宜進行下一步的試驗。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)測定IGF-I的表達量[7]，反應(yīng)體系：dH2O 6 μL，上下游引物以及樣品各2 μL，ROXReference Dye 0.4 μL，SYBRR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s,變性95℃ 5 s,退火60℃ 30 s,延伸95℃15 s , 60℃ 1 min，95℃15 s，35個循環(huán)。

1.5.4 相對定量分析法公式 F=2-△△Ct△△Ct=（待測目的基因平均Ct值-待測內(nèi)參基因平均Ct值）-（對照目的基因平均Ct值-對照內(nèi)參基因平均Ct值）[8]

1.6 統(tǒng)計分析 試驗采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件中的One-Way Anova模塊進行單因素數(shù)據(jù)分析，顯著性檢驗應(yīng)用Duncan′s法，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同蛋氨酸水平對70日齡吉林白鵝產(chǎn)絨性能的影響

2.1.1 不同蛋氨酸水平對70日齡吉林白鵝千朵重的影響 如表3所示，與對照組相比較，各試驗組均顯著提高了70日齡吉林白鵝背部、胸部及腹部的千朵重（P＜0.05），Ⅲ組最重，Ⅳ略低于Ⅲ組，但顯著高于Ⅱ組和Ⅰ組。70日齡吉林白鵝各個部位的千朵重從高到低依次為胸部、腹部、背部。

表2 引物信息

表3 不同蛋氨酸水平的70日齡吉林白鵝千朵重 g

2.1.2 不同蛋氨酸水平對70日齡吉林白鵝絨朵長度的影響 如表4顯示，不同蛋氨酸水平對絨朵長度的影響均不顯著。但隨著蛋氨酸添加量的逐漸升高，70日齡吉林白鵝的絨朵長度也逐漸增長，Ⅲ組最長，Ⅳ組稍低于Ⅲ組，但是高于Ⅱ組和Ⅰ組，并且70日齡吉林白鵝胸部絨朵長度高于背部和腹部。

表4 不同蛋氨酸水平的70日齡吉林白鵝絨朵長度 mm

2.1.3 不同蛋氨酸水平對70日齡吉林白鵝絨枝細度的影響 由表5可見，蛋氨酸的添加水平對70日齡吉林白鵝絨枝細度影響差異不顯著。但是，與絨朵長度一樣，隨著蛋氨酸水平的提高，絨枝細度有增加的趨勢，并且Ⅲ組最大，Ⅳ組略低于Ⅲ組，但是高于Ⅱ組以及Ⅰ組，70日齡吉林白鵝各個部位的絨枝細度從大到小依次為胸部、腹部、背部。

表5 不同蛋氨酸水平的70日齡吉林白鵝絨枝細度 μm

2.2 不同蛋氨酸水平對70日齡吉林白鵝皮膚IGF-I基因mRNA相對表達量的影響 由圖1可見，3條RNA條帶清晰，無RNA降解，純度較高，可以進行熒光定量PCR。如圖2顯示，IGF-I基因擴增曲線表明擴增過程中沒有非特異性擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物單一，符合試驗要求。如表6顯示，各處理組的鵝皮膚中IGF-I基因mRNA相對表達量均顯著高于對照組（P＜0.05），且Ⅲ組最高，Ⅳ組略低于Ⅲ組，但顯著高于Ⅱ組及Ⅰ組（P＜0.05）。胸部的相對表達量明顯高于背部和腹部。

表6 不同蛋氨酸水平的70日齡吉林白鵝皮膚中IGF-I基因mRNA相對表達量

圖1 RNA鑒定圖譜

圖2 擴增曲線

3 討 論

3.1 不同蛋氨酸水平對70日齡吉林白鵝產(chǎn)絨性能的影響 本試驗對70日齡吉林白鵝不同蛋氨酸添加水平的產(chǎn)絨性能影響做了研究，主要測定了鵝背部、胸部以及腹部皮膚千朵重、絨朵長度以及絨枝細度3個指標(biāo)，能充分的衡量羽絨的性能。而影響產(chǎn)絨性能主要有環(huán)境作用，營養(yǎng)代謝和遺傳差異3個方面[9]。本研究結(jié)果顯示，不同的蛋氨酸添加水平顯著提高了70日齡吉林白鵝的千朵重，而絨朵長度和絨枝細度也有增加的趨勢，并且都為Ⅲ組最高。Qi等[10]分析了含硫氨基酸對動物毛發(fā)生長的作用，指出因為硫可以刺激合成代謝，從而增加了合成角蛋白所需要的底物，因此含硫氨基酸對動物毛發(fā)生長有益。陳伯友等[11]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加蛋氨酸安哥拉兔的產(chǎn)毛量明顯增高。袁紹有等[12]研究表明，在皖西白鵝活拔鵝毛后的精料補充料中添加適量的蛋氨酸有利于鵝新生羽毛、羽絨的生長。這為證明蛋氨酸可以提高鵝的產(chǎn)絨性能提供依據(jù)。但是0.75%蛋氨酸添加組雖高于0.25%添加組以及對照組，卻略低于0.5%添加組,可能是因為蛋氨酸含有毒性[10]如果過量，則會抑制羽毛的發(fā)育。而且在其他水禽中，不同著生部位之間也存在差異[13]。并且多項研究表明[5,14-16]，胸部的產(chǎn)絨性能高于腹部和背部。本試驗研究結(jié)果與其一致，70日齡吉林白鵝的千朵重、絨朵長以及絨枝細度，均表現(xiàn)為胸部最好，腹部其次，背部最低，這是因為胸腹部為主要的產(chǎn)絨部位。

3.2 不同蛋氨酸水平對70日齡吉林白鵝皮膚IGF-I基因mRNA相對表達量的影響 在本試驗條件下，提高日糧中蛋氨酸的添加水平，可以提高鵝皮膚中IGF-I的表達量，但是Ⅳ組略低于Ⅲ組，高于Ⅱ組和Ⅰ組。毛囊是鵝羽毛生長發(fā)育的基石，而毛囊的發(fā)生起源于皮膚上皮細胞和間質(zhì)細胞的相互作用[17]。Zhou等[18]研究發(fā)現(xiàn)，給懷孕的母兔日糧中添加適宜蛋氨酸，可以對仔兔的毛囊發(fā)育有刺激作用，能增加毛發(fā)纖維直徑。Hamideh[19]研究表明，胚蛋注射蛋氨酸，可以增加雞胚毛囊密度和直徑。由此可以證明，適量的添加蛋氨酸對毛囊的生長有促進作用。孫永峰等[20]認(rèn)為，IGF-I參與調(diào)控了皮膚組織中毛囊的生長發(fā)育，并且不同產(chǎn)絨形狀的鵝種IGF-I時空表達特異性不同。張海華[3]表示，適宜的蛋氨酸水平對IGF-I的表達量有顯著提高的效果。以上與本研究一致，適宜的蛋氨酸水平可以顯著提高IGF-I基因mRNA的相對表達量。而Ⅳ組略低于Ⅲ組，同樣也可能因為蛋氨酸具有毒性[10]，過量的蛋氨酸會抑制毛囊的發(fā)育。由于本試驗的產(chǎn)絨性能趨勢和IGF-I基因mRNA表達量趨勢一致，因此，蛋氨酸是否通過IGF-I對鵝毛囊的調(diào)控從而改善其產(chǎn)絨性能有待進一步的研究。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為0.73%時，70日齡吉林白鵝的產(chǎn)絨性能最佳。70日齡吉林白鵝各個部位的產(chǎn)絨性能從高到低依次為胸部、腹部、背部。隨著蛋氨酸水平的增加，70日齡吉林白鵝皮膚中IGF-I基因的mRNA表達量趨勢與產(chǎn)絨性能相同，飼糧蛋氨酸水平為0.73%時最佳。

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S835.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-075

2016-06-13；

2016-07-15

國家自然科學(xué)基金（31372331）

劉逍（1992-），女，吉林松原人，碩士，E-mail: 444077553@qq.com

*通訊作者：婁玉杰，E-mail: lyjjlau@163.com