趙潔茹， 范 超， 鄭煦暘， 秦 源， 張沛欣， 李夢苑， 王亞寧， 張 穎， 郝春秋， 賈戰(zhàn)生

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院 傳染科， 西安 710038)

無剛毛鱗甲復合體同源物樣蛋白2在慢性丙型肝炎患者中的表達及其與血清球蛋白的關系

趙潔茹， 范 超， 鄭煦暘， 秦 源， 張沛欣， 李夢苑， 王亞寧， 張 穎， 郝春秋， 賈戰(zhàn)生

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院 傳染科， 西安 710038)

目的 探討慢性丙型肝炎(CHC)患者和健康志愿者外周血CD4+CXCR5+PD-1+T淋巴細胞與血清球蛋白之間的相關性，明確外周血濾泡輔助性T淋巴細胞(Tfh)轉(zhuǎn)錄因子無剛毛鱗甲復合體同源物樣蛋白(Ascl)2的表達在慢性HCV感染過程中的作用。方法 選取2015年10月-2016年5月第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院收治的住院或門診初治CHC患者46例，另選取實驗室健康成年實驗人員以及本院健康體檢者32例作為健康對照組。應用流式細胞技術(shù)分析外周血中Tfh細胞在CD4+T淋巴細胞中所占比例及其亞群(CD4+CXCR5+PD-1+T淋巴細胞)變化，應用全自動生化分析儀檢測血清球蛋白水平，并通過real-time PCR檢測Tfh細胞中Ascl2 mRNA表達情況；分析各指標變化與HCV感染的相關性。計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析。結(jié)果 CHC患者外周血Tfh細胞與B淋巴細胞呈正相關(r=0.582 3，P=0.011 2)，外周血B淋巴細胞與球蛋白呈正相關(r=0.450 9，P=0.031 6)，Tfh細胞與球蛋白呈正相關(r=0.583 5，P=0.038 3)；CHC患者外周血Tfh細胞中Ascl2 mRNA表達顯著高于健康對照組(1.019±0.666 vs 6.437±5.776，t=4.552,P=0.001 9)。結(jié)論 Tfh細胞與CHC患者血清中球蛋白的產(chǎn)生有一定的聯(lián)系，轉(zhuǎn)錄因子Ascl2可能參與HCV感染過程中Tfh細胞的分化發(fā)育。

肝炎， 丙型， 慢性； T淋巴細胞； B淋巴細胞； 轉(zhuǎn)錄因子； 血清球蛋白類

目前，世界范圍內(nèi)大約有1.8億慢性丙型肝炎(CHC)患者[1]，每年因CHC死亡的人數(shù)高達50萬[2]。感染HCV后，只有約15%的感染者可以產(chǎn)生有效的抗病毒免疫反應[3]，自發(fā)清除病毒。其余大部分感染者HCV持續(xù)感染，易引發(fā)肝硬化，甚至肝癌。雖然直接抗病毒藥物(DAA)對CHC的治療效果非常明顯[4]，但HCV特異性細胞免疫反應仍需深入研究。

臨床上，部分CHC患者存在不同程度的球蛋白水平升高，約36%～55%的CHC患者合并混合型冷球蛋白血癥以及多型球蛋白增高，從而引起自身免疫損傷[5]。病毒特異性CD4+T淋巴細胞可以引起多克隆B淋巴細胞活化，導致特異性中和抗體產(chǎn)生缺乏[6]。有研究[7-8]表明，與健康對照組相比，B淋巴細胞可表現(xiàn)出更強的活化表型。然而，CD4+T淋巴細胞在HCV感染應答過程中如何誘導B淋巴細胞產(chǎn)生抗體仍有待研究。Schaerli等[9]和Breitfeld等[10]報道一個CD4+T淋巴細胞亞群，該群細胞高表達CXCR5，可在生發(fā)中心輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體，被稱為濾泡輔助性T淋巴細胞(Tfh)。由于部分其他T淋巴細胞亞群也可一過性表達CXCR5，故常應用PD-1和ICOS作為Tfh細胞鑒別的標記分子[11]。有研究[12]表明，CD4+CXCR5+Tfh 細胞可能參與了CHC患者的機體免疫應答。Tfh細胞可在分化水平及分化后發(fā)育水平受到調(diào)節(jié)，多種轉(zhuǎn)錄因子在此過程中發(fā)揮重要作用。目前認為B細胞淋巴瘤因子 (B-cell lymphoma，Bcl) 6是促進Tfh細胞分化發(fā)育最主要的轉(zhuǎn)錄因子[13]。近期有實驗[14]表明，轉(zhuǎn)錄因子無剛毛鱗甲復合體樣蛋白(achaete-scute homologue，Ascl)2在Tfh細胞的分化發(fā)育中較Bcl6發(fā)揮更為重要的作用。本研究主要探討CHC患者Tfh細胞中Ascl2的表達情況及其與球蛋白的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年10月-2016年5月本院收治的住院或門診初治CHC患者46例作為HCV組，其中基因1b型29例，2a型17例，HCV RNA載量為(2.091±0.469)×107IU/ml，入選CHC患者均排除其他病毒感染(HIV、HBV等)及自身免疫性疾病，入選前6個月均未接受抗病毒治療。另選取實驗室健康成年實驗人員以及本院健康體檢者32例作為健康對照組(HC組)。兩組間年齡、性別分布差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。本研究通過了醫(yī)院倫理委員會批準，全部患者與健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離外周血單個核細胞(PBMC) 收集所有研究對象外周血樣，采用Ficoll密度梯度離心法從全血中分離人PBMC。將所得PBMC存于細胞凍存液中(含90%胎牛血清、10%二甲基亞砜)，并置于液氮中保存。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測Tfh細胞與CD19+B淋巴細胞比例 將凍存的PBMC復蘇、洗滌，用含10%胎牛血清、90%RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2條件下；30 min后取出，調(diào)整細胞數(shù)至106/管，離心，棄上清，每管加入100 μl PBS，加入小鼠抗人 PerCP-cy5.5-CXCR5mAb (Biolegend公司) ，APC-CD4mAb和PE-CD279 mAb (PD-1) (BD Bioscience公司)，F(xiàn)ITC-CD3mAb和PE-cy7-CD19 mAb(BD Bioscience公司)；對照管分別加入各色的同型對照mAb；并采用 BD CompBeads設單染色管用于調(diào)補償，4 ℃避光孵育30 min。每管加入2 ml PBS，300 g離心10 min，棄上清，再次洗滌，加500 μl PBS重懸細胞。染色細胞使用BD FACS Aria 流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo7. 6 軟件分析結(jié)果。

1.2.3 采用免疫磁珠法(MACS)分離CD4+CXCR5+Tfh細胞 選用德國美天旎公司的磁珠，將分離出的PBMC進行細胞計數(shù)，每107個細胞加10 μl CD4+T Biotin-Antibody Cocktail，充分混勻，4 ℃避光孵育5 min，每107個細胞加30 μl MACS緩沖液及20 μl CD4+T Micro Bead Cocktail，充分混勻，4 ℃避光孵育10 min，安裝好分選柱(根據(jù)細胞數(shù)量，分選選用LS柱子)、磁鐵塊和磁力架,每次1 ml MACS緩沖液潤洗柱子，用500 μl MACS 緩沖液重懸細胞并將細胞懸液過柱，每次1 ml MACS 緩沖液洗柱3次，未被磁珠結(jié)合的細胞即為CD4+T淋巴細胞，收集流出液，離心，將離心所得細胞按每107個細胞加40 μl MACS 緩沖液重懸，加PE-CXCR5 mAb染色，4 ℃避光孵育15 min，加2 ml MACS 緩沖液洗滌，用30 μl MACS緩沖液重懸細胞，加入20 μl抗PE磁珠，4 ℃避光孵育10 min，安裝好分選柱(根據(jù)細胞數(shù)量，分選選用MS柱子)、磁鐵塊和磁力架，每次500 ml MACS緩沖液潤洗柱子，取出孵育細胞，加2 ml MACS緩沖液洗滌，以500 μl MACS緩沖液重懸，將細胞懸液過柱，細胞懸液流盡后， MACS緩沖液500 ml/次潤洗柱子，待最后一次MACS緩沖液流盡，迅速加入500 μl MACS 緩沖液并取下柱子，置于15 ml離心管上，用活塞迅速將與磁珠結(jié)合的細胞推出，1500 r/min離心20 min，所得細胞即為CD4+CXCR5+Tfh細胞。

2 結(jié)果

2.1 CHC患者外周血Tfh細胞頻數(shù)與B淋巴細胞頻數(shù) 流式細胞術(shù)檢測各組樣本中CD4+CXCR5+Tfh細胞占CD4+T淋巴細胞比例、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh亞群細胞占CD4+CXCR5+Tfh 細胞的比例以及CD3-CD19+細胞百分比(圖1)。HCV組CD4+CXCR5+Tfh(7.417±3.963)較HC組(3.678±1.932)顯著升高(t=3.727，P=0.000 6) (圖2a)；HCV組CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細胞(23.370±9.704)較HC組(12.620±7.144)顯著升高(t=4.056，P=0.000 2)(圖2b)。HCV組CD3-CD19+B淋巴細胞(7.368±3.975)較HC組(3.496±1.877)升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.794，P=0.005)(圖2c)。

2.2 CHC患者外周血Tfh細胞與血清球蛋白之間的關系 CHC患者外周血Tfh細胞與B淋巴細胞呈正相關(r=0.582 3，P=0.011 2)(圖3a)，外周血B細胞與球蛋白呈正相關(r=0.450 9，P=0.031 6)(圖3b)，Tfh細胞與球蛋白呈正相關(r=0.583 5，P=0.038 3)(圖3c)。

2.3 CHC患者外周血Tfh細胞中Ascl2基因表達情況 采用real-time PCR檢測CD4+CXCR5+Tfh細胞中Ascl2 mRNA的表達，結(jié)果顯示，與HC組相比，HCV組外周血Tfh細胞中Ascl2 mRNA表達明顯升高(1.019±0.666 vs 6.437±5.776，t=4.552,P=0.001 9)(圖4)。

圖1 流式細胞技術(shù)檢測Tfh細胞及B淋巴細胞的比例 每個樣本至少獲取50 000個細胞

圖2 CHC患者外周血Tfh細胞頻數(shù)與B淋巴細胞頻數(shù) a：CD4+CXCR5+T淋巴細胞占CD4+T淋巴細胞的比例；b：CD4+CXCR5+PD-1+T淋巴細胞占CD4+CXCR5+T淋巴細胞比例；c：CD3-CD19+B淋巴細胞所占比例

圖3 CHC患者外周血Tfh細胞與血清球蛋白之間的相關性

a：HCV組中CD19+B淋巴細胞與Tfh細胞的關系；b：CD19+B淋巴細胞與球蛋白的關系；c：Tfh細胞與球蛋白的相關性

圖4 HCV組與HC組外周血Tfh細胞中Ascl2 mRNA的表達

3 討論

慢性肝炎患者尤其CHC患者常伴有球蛋白水平異常升高，嚴重者可表現(xiàn)為冷球蛋白血癥。既往觀點認為，循環(huán)球蛋白水平升高是由于肝功能受損，導致異質(zhì)抗原增多刺激B淋巴細胞過度增殖，產(chǎn)生過量Ig。但臨床所見球蛋白水平升高與肝損傷程度不完全相關，提示病毒感染條件下的B淋巴細胞分化、抗體產(chǎn)生及Ig類型轉(zhuǎn)換失衡可能有其他誘因。

本研究發(fā)現(xiàn)CHC患者外周血B淋巴細胞與Tfh細胞呈正相關，B淋巴細胞與血清球蛋白呈正相關，Tfh細胞與血清球蛋白呈正相關。在免疫應答過程中，效應B淋巴細胞介導的體液免疫應答需要CD4+T淋巴細胞的輔助，而其中的Tfh細胞是為效應B淋巴細胞提供輔助的最主要細胞，在B淋巴細胞增殖分化、抗體產(chǎn)生和Ig類型轉(zhuǎn)換等功能中都發(fā)揮重要作用[15]，據(jù)此推測，B淋巴細胞與CHC患者血清球蛋白的產(chǎn)生有關，Tfh細胞可能在此過程中起到輔助B淋巴細胞的作用。

Tfh細胞可在兩個層面受到免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，即分化水平調(diào)節(jié)及分化后調(diào)節(jié)。在抗原決定的初始T淋巴細胞活化發(fā)生后，CD4+T淋巴細胞進入分化的關鍵階段，這個階段的分化方向主要決定于CD4+T淋巴細胞所處的微環(huán)境，并通過影響如相關轉(zhuǎn)錄因子的表達水平實現(xiàn)最終分化[16-17]。近期研究[18]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Ascl2在Tfh分化早期向GC的遷移過程中發(fā)揮作用，其重要性很可能不亞于所熟知的Bcl6。Ascl2是一個堿性/螺旋-環(huán)-螺旋基元轉(zhuǎn)錄因子，Wnt信號通路的靶基因。研究[14]認為，Ascl2在Tfh中的表達上調(diào)先于Bcl6，并能誘導CXCR5，下調(diào)趨化因子受體7。Ascl2對Tfh細胞的分化具有“Bcl6非依賴性”的促進作用，可抑制輔助性T淋巴細胞1和輔助性T淋巴細胞17的生成。

為進一步明確Tfh細胞在CHC患者體內(nèi)的免疫機制，本實驗研究了轉(zhuǎn)錄因子Ascl2在CHC患者外周血Tfh細胞的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)CHC患者外周血Tfh細胞(CD4+CXCR5+T淋巴細胞)中Ascl2的表達與健康人相比明顯升高。這說明Ascl2可能與HCV感染者Tfh細胞的分化發(fā)育有關，因此推測Ascl2可能參與了HCV感染者體內(nèi)球蛋白的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Tfh細胞與CHC患者血清中球蛋白的產(chǎn)生有一定的聯(lián)系，轉(zhuǎn)錄因子Ascl2可能參與HCV感染過程中Tfh細胞的分化發(fā)育。筆者后續(xù)計劃擴大病例數(shù)，將CHC患者按疾病嚴重程度分組，分析Ascl2的表達與病毒基因型之間的相關性，深入研究Ascl2的表達與血清球蛋白之間相關性以及敲除與過表達Ascl2基因后Tfh細胞對血清球蛋白生成情況的影響，進一步探討Ascl2在CHC患者血清球蛋白生成過程中的作用機制。

[1] ROBAEYS G, ROB B, AZAR DG, et al. Global distribution and prevalence of hepatitis[J]. J Hepatol, 2016, 16： 30418-30414.

[2] LANINI S, EASTERBROOK PJ, ZUMLA A, et al. Hepatitis C： global epidemiology and strategies for control[J]. Clin Microbiol Infect, 2016, 22(10): 833-838.

[3] BARATHAN M, GOPAL K, MOHAMED R, et al. Chronic hepatitis C virus infection triggers spontaneous differential expression of biosignatures associated with T cell exhaustion and apoptosis signaling in peripheral blood mononucleocytes[J]. Apoptosis, 2015, 20(4): 466-480.

[4] KEATING GM. Daclatasvir: a review in chronic hepatitis C[J]. Drugs, 2016, 76(14): 1381-1391.

[5] WANG Y, ZHANG Y, JIA ZS. Recent treatment advances for hepatitis C virus-related mixed cryoglobulinemia[J]. J Clin Hepatol, 2012, 28(8): 628-632. (in Chinese) 王宇, 張穎, 賈戰(zhàn)生. 丙型肝炎病毒相關性混合型冷球蛋白血癥的治療進展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2012, 28(8): 628-632.

[6] RECHER M, LANG KS, HUNZIKER L, et al. Deliberate removal of T cell help improve[J]. Nat Immunol, 2004, 5(9): 934-942.

[7] BARBARA O, ANTONELLA C, STEFANIA V, et al.Enhanced B-cell differentiation and reduced proliferative capacity[J]. J Hepatol, 2011, 55(1): 53-60.

[8] RACANELLI V, FRASSANITO MA, LEONE P, et al. Antibody production and in vitro behavior of CD27 defined B cell subsets persistent hepatitis C virus infection changes the rules[J]. J Virol, 2006, 80(8): 3923-3934.

[9] SCHAERLI P, WILLIMANN K, LANG AB, et al. CXC chemokine receptor 5 expression defines follicular homing T cells with B cell helper function[J]. J Exp Med， 2000, 192(11): 1553-1562.

[10] BREITFELD D, OHL L, KREMMER E, et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production[J]. J Exp Med， 2000, 192(11): 1545-1552.

[11] MESQUITA D Jr, CRUVINEL WM, RESENDE LS, et al. Follicular helper T cell in immunity and autoimmunity[J]. Braz J Med Biol Res, 2016, 49(5): e5209.

[12] WANG Y, MA ZY, GUO YH, et al. Investigation of CD4+CXCR5+follicular helper T cell frequency and expression of related functional molecules in peripheral blood of hepatitis C virus patients[J]. J Clin Hepatol, 2013, 29(5)： 379-382. (in Chinese) 王宇, 馬志遠, 郭永紅, 等. 濾泡性輔助性T淋巴細胞與HCV感染的相關性[J]. 臨床肝膽病雜志, 2013, 29(5): 379-382.

[13] QI H, LIU D, MA W, et al.Bcl-6 controlled TFH polarization and memory: the known unknowns[J]. Curr Opin Immunol, 2014, 28: 34-41.

[14] LIU X, CHEN X, ZHONG B, et al. Transcription factor achaete-scute homologue 2 initiates follicular T-helper-cell development[J].Nature, 2014, 507(7493): 513-518.

[15] VINUESA CG, LINTERMAN MA, YU D, et al. Follicular helper T cells[J]. Annu Rev Immunol, 2016, 20(34): 335-368.

[16] KITANO M, MORIYAMA S, ANDO Y, et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity[J]. Immunity, 2011, 34(6): 961-972.

[17] SCHMITT N, UENO H. Regulation of human helper T cell subset differentiation by cytokines[J]. Curr Opin Immunol, 2015, 34: 130-136.

[18] YAN KS, KUO CJ. Ascl2 reinforces intestinal stem cell identity [J]. Cell Stem Cell, 2015, 16(2): 105-106.

引證本文：ZHAO JR, FAN C, ZHENG XY, et al. Expression of achaete-scute homologue 2 and its correlation with serum globulin in patients with chronic hepatitis C[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(1): 67-71. (in Chinese) 趙潔茹， 范超， 鄭煦暘， 等. 無剛毛鱗甲復合體同源物樣蛋白2在慢性丙型肝炎患者中的表達及其與血清球蛋白的關系[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(1): 67-71.

(本文編輯：劉曉紅)

Expression of achaete-scute homologue 2 and its correlation with serum globulin in patients with chronic hepatitis C

ZHAOJieru,FANChao,ZHENGXuyang,etal.

(DepartmentofInfectiousDiseases,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China)

Objective To investigate the correlation between peripheral CD4+CXCR5+PD-1+T cells and serum globulin in chronic hepatitis C (CHC) patients and health volunteers, and to clarify the role of the expression of achaete-scute homologue 2 (Ascl2), the transcription factor in peripheral follicular helper T (Tfh) cells, in the process of chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Methods A total of 46 previously untreated CHC patients who were admitted to Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, from October 2015 to May 2016 were enrolled, and 32 healthy laboratory technicians and persons who underwent physical examination in our hospital were enrolled as healthy control group. Flow cytometry was used to measure the percentage of Tfh cells in CD4+T cells and the change in its subset (CD4+CXCR5+PD-1+T cells) in peripheral blood, an automatic biochemical analyzer was used to measure the serum globulin level, and real-time PCR was used to measure the mRNA expression of Ascl2 in Tfh cells. The association between the changes in these parameters and HCV infection was analyzed. The independent samplest-test was used for the comparison of continuous data between groups, and the Pearson correlation analysis was also performed. Results In CHC patients, peripheral Tfh cells were positively correlated with B lymphocytes (r=0.582 3,P=0.011 2), peripheral B lymphocytes were positively correlated with globulin (r=0.450 9,P=0.031 6), and Tfh cells were positively correlated with globulin (r=0.583 5,P=0.038 3). CHC patients had significantly higher mRNA expression of Ascl2 in peripheral Tfh cells than the healthy control group (1.019±0.666 vs 6.437±5.776,t=4.552,P=0.001 9). Conclusion Tfh cells may be involved in the production of serum globulin in CHC patients, and the transcription factor Ascl2 may participate in the differentiation and development of Tfh cells in the process of HCV infection.

hepatitis C， chronic； T-lymphocytes； B-lymphocytes； transcription factors； serum globulins

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.01.014

2016-09-08；

2016-10-08。

國家自然科學基金項目(81471541)

趙潔茹(1991-) ，女，主要從事丙型肝炎相關研究。

賈戰(zhàn)生，電子信箱：jiazsh@fmmu.edu.cn。

R512.63

A

1001-5256(2017)01-0067-05