洪馬林，付 橙，黃 三，周 沛，粟 碩，李守軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省寵物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

廣州地區(qū)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒分離鑒定及全基因組遺傳分析

洪馬林，付 橙，黃 三，周 沛，粟 碩，李守軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省寵物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

【目的】分析廣州地區(qū)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus, FPLV)的自然重組、跨宿主傳播以及流行變異情況。【方法】采集疑似感染貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的貓糞便樣品進(jìn)行細(xì)胞分離，并對(duì)陽(yáng)性病料提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增獲得病毒的全基因組序列，并與GenBank中相關(guān)的參考毒株序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，同時(shí)對(duì)VP2基因與NS1基因的主要氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行差異分析?！窘Y(jié)果】成功獲得2株貓泛白細(xì)胞減少癥病毒及其全基因組序列。遺傳進(jìn)化分析顯示，廣州地區(qū)分離的貓泛白細(xì)胞減少癥病毒FPLV-GZ01、FPLV-GZ02與我國(guó)其他分離毒株FPLV-XJ01、FPLV-HRB屬同一分支，提示FPLV-GZ01、FPLV-GZ02由FPLV-XJ1進(jìn)化而來(lái)；NS1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，F(xiàn)PLV存在與CPV-447重組的可能。主要氨基酸位點(diǎn)分析顯示，F(xiàn)PLV在VP2基因中的主要氨基酸位點(diǎn)上的遺傳變異比CPV保守；在NS1基因上發(fā)現(xiàn)FPLV-GZ01、FPLV-GZ02分別存在不同程度的氨基酸位點(diǎn)突變?！窘Y(jié)論】廣州地區(qū)分離的貓泛白細(xì)胞減少癥病毒仍在不斷地重組進(jìn)化。

貓泛白細(xì)胞減少癥病毒； 細(xì)小病毒； 分離鑒定； 全基因組； 遺傳分析

細(xì)小病毒(Parvovirus)是一種單股負(fù)鏈的線(xiàn)狀DNA病毒，屬于細(xì)小病毒科Parvoviridae細(xì)小病毒屬Parvovirus，病毒粒子在電子顯微鏡下呈圓形或六邊形，無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)，核衣殼為軸對(duì)稱(chēng)的二十面體[1]。隨著細(xì)小病毒的不斷遺傳進(jìn)化，病毒基因組序列也在不斷地發(fā)生突變，其宿主特異性、跨物種傳播、自然重組等生物學(xué)特性存在改變的可能。細(xì)小病毒基因組含有2個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)：第1個(gè)ORF位于基因組的5′端，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2；第2個(gè)ORF位于基因組的3′端，編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2。2個(gè)ORFs分別含有各自獨(dú)立的啟動(dòng)子，非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA終止于共同的Poly(A)信號(hào)，并且可以通過(guò)mRNA的可變剪接形成不同的翻譯模板。VP2蛋白是衣殼蛋白的主要成分，是主要的抗原蛋白，具有凝血活性和介導(dǎo)細(xì)小病毒感染宿主細(xì)胞的作用。NS1蛋白是最主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)細(xì)小病毒的復(fù)制具有重要的調(diào)節(jié)作用。病毒基因的中間部分，存在著500 bp的間隔區(qū)；而基因組的兩側(cè)，存在著與復(fù)制密切相關(guān)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且高度磷酸化，這種結(jié)構(gòu)可能與保護(hù)病毒基因組不被降解有關(guān)[2-3]。

貓泛白細(xì)胞減少癥是由貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PLV)引起的一種高度接觸性急性傳染病，以高熱、嘔吐、白細(xì)胞嚴(yán)重減少和腸炎為特征，而犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV) 引起的犬科動(dòng)物的一種急性傳染病，以劇烈嘔吐、 出血性腸炎、白細(xì)胞顯著減少及心肌炎為主要特征，幼犬較易發(fā)病。FPLV和CPV均屬于細(xì)小病毒屬成員，它們?cè)谒拗魈禺愋陨洗嬖谝欢ǖ牟町?。FPLV是目前細(xì)小病毒屬中感染范圍最寬、致病性最強(qiáng)的一種[4]。FPLV在自然條件下感染貓科和鼬科以及多種野生動(dòng)物，如虎、豹、獅子和浣熊，但以體型較小的貓科動(dòng)物最為易感。此外，在猴子中也分離出FPLV。CPV主要感染犬、貓[5-6]。隨著宿主間的相互接觸以及細(xì)小病毒的不斷遺傳變異，宿主范圍也出現(xiàn)了一定的變化，CPV的宿主范圍由最開(kāi)始的單一犬群感染向犬、貓科動(dòng)物等多種動(dòng)物感染發(fā)展。在進(jìn)化過(guò)程中，CPV出現(xiàn)了CPV-2、CPV-2a、new CPV-2a、CPV-2b、new CPV-2b、CPV-2c等基因型，而目前鮮見(jiàn)對(duì)FPLV進(jìn)行基因分型，這可能與CPV的VP2基因核苷酸突變率遠(yuǎn)高于FPLV有關(guān)[7-8]。病毒VP2基因的一些突變使得病毒能夠有效感染新的宿主，并在其間傳播，適應(yīng)性進(jìn)化的逐漸積累導(dǎo)致了細(xì)小病毒的廣泛流行[9]。此外，由于FPLV的基因組序列較小，因此可將FPLV的遺傳進(jìn)化過(guò)程作為研究細(xì)小病毒進(jìn)化以及病毒跨種傳播的重要模型[10]。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)疑似感染貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的貓糞便樣品進(jìn)行細(xì)胞分離，將成功分離到貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的病料提取基因組DNA后，進(jìn)行全基因組序列測(cè)定分析，以弄清貓泛白細(xì)胞減少癥病毒主要基因VP2與NS1的突變情況，闡明廣州地區(qū)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒在遺傳進(jìn)化方面的情況。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年12月—2015年5月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院采集疑似感染貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的病貓糞便樣品11份。

F81細(xì)胞系由廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

pZeroBack載體、Fast HiFidelity Polymerase高保真酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、糞便基因組DNA提取試劑盒均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收純化試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液為Hyclone公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的分離 稱(chēng)取貓糞便樣品0.2 g，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，制成質(zhì)量比為1∶9的懸浮液，5 000 r·min-1離心15 min，上清液用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，收集濾液，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。將處理好的上清液按照?xì)胞培養(yǎng)液總體積的1/10接種于F81細(xì)胞系，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞作為對(duì)照，每日觀察細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)情況。如未出現(xiàn)CPE，則待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后進(jìn)行正常傳代。若經(jīng)過(guò)盲傳5代后仍不產(chǎn)生CPE,則視為陰性;若CPE達(dá)到80%以上，則經(jīng)-80 ℃/37 ℃反復(fù)凍融3次后收毒，置于-80 ℃條件下保存。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上FPLV(登錄號(hào)：M38246)的參考序列設(shè)計(jì)6對(duì)分段擴(kuò)增FPLV全基因組序列的引物(表1)，設(shè)計(jì)好的引物送廣州華大基因科技股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 貓泛白細(xì)胞減少癥病毒全基因分段引物
Tab.1 Segmented primers for the complete genome of FPLV

引物名稱(chēng)引物序列(5′→3′)FPLV?1F：GAATGATAGGCGGTTTGTGTGR：TCTTCTGCAATTTCTCTGAGCFPLV?2F：GCAGAAGATAGTGAATGGGTGR：TTGGTTGTGTATGTTCAGGTCFPLV?3F：TTATGACAACTAATGAAAATAR：TTTTAGTTGGTTTTGTTGGTCFPLV?4F：TGATACACCAGATCATCCATCR：TATTTGTTTGCCATGTATGTGFPLV?5F：GAAAATTCTGTGCCAGTACACR：TACCTTTCCACCAAAAATCTGFPLV?6F：AAGACTTCATGTAAATGCACCR：AGATTGATACTTATGGTAAGG

1.2.3 病毒基因組DNA提取、擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定 糞便樣品DNA提取參考天根糞便基因組DNA提取試劑盒操作手冊(cè)，提取的DNA用無(wú)核酸酶的水溶解，置-20 ℃條件下保存。利用各分段PCR引物，以提取的基因組DNA為模板，分段擴(kuò)增全基因組序列。50 μL反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，5×Fast HiFidelity PCR Buffer 10 μL，F(xiàn)ast HiFidelity Polymerase 1 μL，20×Fast PCR Enhancer 2.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR產(chǎn)物以0.01 g·mL-1瓊脂糖凝膠電泳分離，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；純化后的目的基因片段與pZeroBack載體連接、轉(zhuǎn)化，將經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的待測(cè)菌液送廣州華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，每個(gè)克隆送3個(gè)陽(yáng)性菌液，并對(duì)測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒，-20 ℃條件下保存。

1.2.4 序列測(cè)定與分析 將測(cè)序獲得的序列用DNAstar軟件包中的Edit-seq和SeqMan程序進(jìn)行整理，并拼接成線(xiàn)性的全基因組序列。使用Bioedit軟件進(jìn)行序列匹配和多重序列比對(duì)(Clustal W法)；MEGA5軟件用于遺傳進(jìn)化分析，并與從GenBank上收集的26個(gè)參考序列(表2)進(jìn)行比較，采用Neighbor-joining (NJ，Replication=1 000)法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表2 26株細(xì)小病毒參考序列
Tab.2 Reference sequences of 26 parvovirus strains

毒株登錄號(hào)基因型年份來(lái)源國(guó)CPV?NM19296CPV?21995USACPV?M38M38245CPV?21996USACPV?F261FJ005261CPV?2b2009GermanyCPV?339AY742933newCPV?2a2005NewZealandCPV?447AY742934newCPV?2b2005USACPV?U6AY742935newCPV?2a2005GermanyCPV?395AY742936newCPV?2b2005USACPV?EFEF011664newCPV?2a2006ChinaCPV?NJ01EU310373newCPV?2a2008ChinaCPV?410EU659119newCPV?2b2008USACPV?13EU659118newCPV?2a2008USACPV?579EU659116CPV?22008USACPV?Y1AD26079CPV?2a2008JapanCPV?LZ2JQ268284newCPV?2b2013ChinaCPV?UY349KM457129CPV?2c2014UruguayCPV?UY135KM457112CPV?2c2014UruguayFPLV?M382M38246FPLV1996USAFPLV?X55X55115FPLV2005USAFPLV?XJ1EF988660FPLV2007ChinaFPLV?8bEU659114FPLV2008USAFPLV?367EU659111FPLV2008USAFPLV?889EU659113FPLV2008USAFPLV?KAEU659115FPLV2008USAFPLV?464EU659112FPLV2008USAFPLV?HRBKP280068FPLV2015ChinaFPLV?MG132KP769859FPLV2015Belgium

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

將病料上清液同步接種于F81細(xì)胞，并通過(guò)帶毒傳代的方法成功獲得了2株FPLV，編號(hào)為FPLV-GZ01和FPLV-GZ02。對(duì)照組的F81細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈不規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)，連接緊密(圖1A)，而接種病料上清液的試驗(yàn)組則在連續(xù)傳代3次后出現(xiàn)CPE，其表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、細(xì)胞圓縮、 胞間聯(lián)系減少、細(xì)胞脫落等病變現(xiàn)象(圖1B)。

A：對(duì)照組的F81細(xì)胞；B：試驗(yàn)組的F81細(xì)胞。

2.2 序列測(cè)定結(jié)果及相似性分析

將實(shí)驗(yàn)室獲得的2株FPLV的核苷酸、氨基酸序列與表2中的參考序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PLV-GZ01株NS1基因與其他毒株的核苷酸序列相似性為98.9%～99.6%，氨基酸序列相似性為98.7%～99.4%；VP2基因的核苷酸序列相似性為98.0%～99.5%，氨基酸序列相似性為97.1%～99.8%；全基因組的核苷酸序列相似性為87.6%～99.4%。FPLV-GZ02株NS1基因的核苷酸序列相似性為98.8%～99.8%，氨基酸序列相似性為98.8%～99.7%；VP2基因的核苷酸序列相似性為97.9%～99.8%，氨基酸序列相似性為96.9%～99.8%；全基因組的核苷酸序列相似性為82.4%～99.0%。表明分離毒株FPLV-GZ01、FPLV-GZ02與參考毒株之間的差異較小，相似性高，且NS1基因的核苷酸序列相似性高于VP2基因和全基因組的核苷酸序列相似性。

2.3 VP2、NS1基因及全基因組的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將實(shí)驗(yàn)室獲得的2株FPLV序列與表2中的26株細(xì)小病毒序列進(jìn)行核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析(圖2～圖4)。結(jié)果表明，在VP2、NS1基因與全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上，分別形成FPLV與CPV 2個(gè)大的分支。FPLV-GZ01與FPLV-GZ02均處在FPLV分支上，屬于FPLV，其中FPLV-GZ02與FPLV-HRB的親緣關(guān)系最接近，且FPLV-GZ02與FPLV-HRB組成的分支與FPLV-GZ01屬于同一分支。此外FPLV-GZ01、FPLV-GZ02與FPLV-HRB組成的分支與FPLV-XJ1接近。

圖2 細(xì)小病毒VP2基因的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

Fig.2 The phylogenetic tree based on nucleotide sequences of parvovirusVP2 gene

圖3 細(xì)小病毒NS1基因的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

Fig.3 The phylogenetic tree based on nucleotide sequences of parvovirusNS1 gene

圖4 細(xì)小病毒全基因組的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

Fig.4 The phylogenetic tree based on nucleotide sequences of the complete genomes of parvovirus

2.4 主要氨基酸位點(diǎn)的分析

分別選取FPLV-M382、CPV-N、CPV-Y1A 、CPV-NJ01、CPV-F261、CPV-410和CPV-UY349作為FPLV、CPV-2、CPV-2a、new CPV-2a、CPV-2b、new CPV-2b和 CPV-2c的參考毒株，并與FPLV-GZ01、FPLV-GZ02進(jìn)行NS1和VP2基因的主要氨基酸位點(diǎn)比對(duì)(表3、表4)。

在VP2基因中主要的氨基酸位點(diǎn)上，與FPLV-M382相比，F(xiàn)PLV-GZ01和FPLV-GZ02沒(méi)有出現(xiàn)突變，提示FPLV VP2蛋白的功能在進(jìn)化過(guò)程中較少發(fā)生改變；與CPV-N、CPV-Y1A、CPV-NJ01、CPV-F261、CPV-410和CPV-UY349相比，F(xiàn)PLV-GZ01、FPLV-GZ02、FPLV-M382在第80、93、103、323、564、568位點(diǎn)上出現(xiàn)氨基酸位點(diǎn)的宿主差異變化，表明VP2蛋白可能在不同宿主上表現(xiàn)出功能差異(表3)。在NS1基因中的部分氨基酸位點(diǎn)上，F(xiàn)PLV-GZ01分別在第546、584位點(diǎn)上出現(xiàn)新的氨基酸突變，F(xiàn)PLV-GZ02僅在第546位點(diǎn)上出現(xiàn)新的氨基酸突變，這些新的突變是否能引起NS1基因的功能甚至是細(xì)小病毒的生物學(xué)特性改變有待進(jìn)一步研究(表4)。

表3VP2基因中主要的氨基酸位點(diǎn)分析
Tab.3 Analysis of major amino acid sites of theVP2 gene

毒株氨基酸位點(diǎn)808793103300305323426564568核酸類(lèi)型FPLV?GZ01KMKVADDNNAFPLVFPLV?GZ02KMKVADDNNAFPLVFPLV?M382KMKVADDNNAFPLVCPV?NRMNAADNNSGCPV?2CPV?Y1ARLNAGYNNSGCPV?2aCPV?NJ01RLNAGYNNSGnewCPV?2aCPV?F261RLNAGYNDSGCPV?2bCPV?410RLNAGYNDSGnewCPV?2bCPV?UY349RLNAGYNESGCPV?2c

表4NS1基因中的部分氨基酸位點(diǎn)分析
Tab.4 Analysis of partial amino acid sites of theNS1 gene

毒株氨基酸位點(diǎn)248546584核酸類(lèi)型FPLV?GZ01TPAFPLVFPLV?GZ02TPTFPLVFPLV?M382TSTFPLVCPV?NISTCPV?2CPV?Y1AISTCPV?2aCPV?NJ01ISTnewCPV?2aCPV?410ISTnewCPV?2bCPV?UY349ISTCPV?2c

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用F81細(xì)胞對(duì)收集的疑似感染FPLV的貓糞便樣品進(jìn)行細(xì)胞分離。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組出現(xiàn)了細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、細(xì)胞圓縮、胞間聯(lián)系減少、細(xì)胞脫落等病變現(xiàn)象，與亢文華等[11]的報(bào)道相符。由于細(xì)小病毒的復(fù)制需要在宿主細(xì)胞分裂期才能滿(mǎn)足宿主細(xì)胞為其提供復(fù)制所需的酶等條件，因此采取同步接毒的方法分離病毒。通過(guò)對(duì)FPLV-GZ01和FPLV-GZ02的序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)在核苷酸相似性、氨基酸相似性分析上，VP2基因比NS1基因變化差異大，表明VP2基因作為細(xì)小病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)小病毒分類(lèi)、宿主特異性等方面具有重要作用。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，廣州地區(qū)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒分離株FPLV-GZ01、FPLV-GZ02與我國(guó)其他地區(qū)的貓泛白細(xì)胞減少癥病毒分離株FPLV-XJ1、FPLV-HRB同在一個(gè)大分支上，且該大分支上又形成幾個(gè)小的分支，顯示FPLV-GZ01、FPLV-GZ02、FPLV-HRB毒株可能由早期的FPLV-XJ1毒株遺傳進(jìn)化而來(lái)，而FPLV-GZ01、FPLV-GZ02毒株處在FPLV-XJ1與FPLV-HRB毒株之間，是否表明FPLV-HRB毒株可能由廣州地區(qū)分離株FPLV-GZ01、FPLV-GZ02進(jìn)化而來(lái)，還需要進(jìn)一步的研究。從宿主差異上來(lái)看，VP2、NS1基因與全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，總體上看貓泛白細(xì)胞減少癥病毒與犬細(xì)小病毒單獨(dú)形成2個(gè)大的分支，具有明顯的宿主特異性，但NS1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示CPV-447與FPLV形成的大分支處在同一分支上，這可能是由于CPV-447的NS1基因存在與貓泛白細(xì)胞減少癥病毒NS1基因重組的可能，這與Ohshima等[12]報(bào)道的FPLV-XJ1毒株出現(xiàn)CPV和FPLV的重組進(jìn)化現(xiàn)象相符。為了進(jìn)一步證明不同宿主細(xì)小病毒出現(xiàn)的重組現(xiàn)象，需要更深入的研究。

細(xì)小病毒中的VP2蛋白作為細(xì)小病毒衣殼的主要蛋白，在宿主差異方面起到關(guān)鍵作用，本研究選取了10個(gè)與宿主范圍、抗原性和血凝性相關(guān)的VP2基因中的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，其中第80、564、568位點(diǎn)與FPLV能否在貓?bào)w內(nèi)繁殖有關(guān)，而影響CPV在犬內(nèi)繁殖的氨基酸位點(diǎn)為第93、103、323位點(diǎn)[13-14]。此外，有報(bào)道在VP2基因的第300位氨基酸位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)天冬氨酸(D)突變，此位點(diǎn)突變株首先報(bào)道于越南的貓?bào)w內(nèi)，隨后在犬體內(nèi)也出現(xiàn)此氨基酸位點(diǎn)的突變株[15]。VP2基因的主要氨基酸位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，廣州地區(qū)分離株FPLV-GZ01、FPLV-GZ02與參考毒株FPLV-M382相比，在這10個(gè)氨基酸位點(diǎn)上均一致，并沒(méi)有出現(xiàn)氨基酸突變，表明FPLV-GZ01、FPLV-GZ02毒株僅在貓?bào)w內(nèi)復(fù)制，尚不具備跨犬傳播的可能，但VP2基因其他氨基酸位點(diǎn)、病毒其他基因或宿主基因的改變是否會(huì)引起細(xì)小病毒的跨宿主傳播還有待更深入的研究。與CPV相比，F(xiàn)PLV在VP2基因的遺傳進(jìn)化上更為保守，說(shuō)明貓泛白細(xì)胞減少癥病毒在遺傳進(jìn)化上相對(duì)較慢。在NS1基因的序列比對(duì)中，與FPLV-M382相比，發(fā)現(xiàn)FPLV-GZ02在第546位點(diǎn)出現(xiàn)由絲氨酸(S)向脯氨酸(P)的突變，而FPLV-GZ01除了在546位點(diǎn)上具有相同的氨基酸突變外，同時(shí)還在第584位點(diǎn)上出現(xiàn)了由蘇氨酸(T)向丙氨酸(A)的突變，NS1基因中第546、584位氨基酸位點(diǎn)的功能還有待于進(jìn)一步研究，對(duì)于這2個(gè)位點(diǎn)的突變是否能引起貓泛白細(xì)胞減少癥病毒宿主特異性改變、是否能引起與其他細(xì)小病毒發(fā)生基因重組等情況值得研究。

本研究通過(guò)收集疑似感染貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的貓糞便樣品進(jìn)行細(xì)胞分離，提取陽(yáng)性病料的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，對(duì)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒進(jìn)行相似性、遺傳進(jìn)化、主要氨基酸位點(diǎn)的分析，表明廣州地區(qū)的貓泛白細(xì)胞減少癥病毒在不斷地進(jìn)化。為此，對(duì)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有利于掌握該地區(qū)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的流行變異情況，不僅為該地區(qū)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的預(yù)防和控制提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)，而且對(duì)研究細(xì)小病毒的生物學(xué)特性、評(píng)估疫苗保護(hù)水平等具有重要意義。

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【責(zé)任編輯 李曉卉】

Isolation，identification and sequence analysis of complete genome of feline panleukopenia virus in Guangzhou area

HONG Malin，F(xiàn)U Cheng，HUANG San，ZHOU Pei，SU Shuo，LI Shoujun

( College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Prevention and Control for Severe Clinical Animal Diseases/Guangdong Technological Engineering Research Center for Pet，Guangzhou 510642，China)

【Objective】 To study the natural recombination，cross host transmission and prevalence of feline panleukopenia virus(FPLV)in Guangzhou area.【Method】Cells were isolated from stool samples of cats seemingly infected with FPLV，genome DNAs were extracted from positive samples，and complete virus genome sequences were amplified by PCR and were compared with relevant reference sequences from GenBank using genetic evolution analysis. The major amino acid sites were analyzed for differences betweenVP2 gene andNS1 gene. 【Result】Two FPLV strains were successfully isolated and the complete genome sequences of FPLV were obtained. The genetic evolution analysis indicated that FPLV-GZ01 and FPLV-GZ02 which were isolated from Guangzhou area belonged to the same branch with the other isolated strains FPLV-XJ1 and FPLV-HRB, and implied FPLV-GZ01 and FPLV-GZ02 evolved from FPLV-XJ01. TheNS1 gene phylogenetic analysis demonstrated that FPLV might have recombined with CPV-447. Analysis of major amino acid sites indicated that FPLV was more conservative than CPV in the genetic variation of theVP2 gene. FPLV-GZ01 and FPLV-GZ02 had different degrees of mutation in the amino acid sites of theNS1 gene. 【Conclusion】The feline panleukopenia viruses isolated from Guangzhou area have been still recombining and evolving.

feline panleukopenia virus； parvovirus； isolation and identification； complete genome； genetic analysis

2016- 03- 09優(yōu)先出版時(shí)間：2016-12-28

洪馬林(1989—)，男，碩士研究生，E-mail：malinhongmark@foxmail.com; 通信作者：李守軍(1968—)，男，教授，博士，E-mail：shoujunli@scau.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0501004);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303042)

S852.65

A

1001- 411X(2017)01- 0009- 06

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20161228.0937.026.html

洪馬林，付 橙，黃 三，等.廣州地區(qū)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒分離鑒定及全基因組遺傳分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(1):9- 14.