馮樹丹, 李曉慧,, 汪洋洲, 張 軍, 徐文靜, 張正坤, 王德利, 李啟云,*

1 哈爾濱師范大學(xué), 哈爾濱 150025 2 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,公主嶺 136100 3 東北師范大學(xué), 長(zhǎng)春 130024

二種交配型球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟的生態(tài)控制作用

馮樹丹1, 李曉慧1,2, 汪洋洲2, 張 軍2, 徐文靜2, 張正坤2, 王德利3, 李啟云2,*

1 哈爾濱師范大學(xué), 哈爾濱 150025 2 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,公主嶺 136100 3 東北師范大學(xué), 長(zhǎng)春 130024

利用生物種間互做關(guān)系抑制農(nóng)業(yè)害蟲的暴發(fā)是生物防治的重要手段。為探討二種交配型內(nèi)共生球孢白僵菌與玉米之間的互惠關(guān)系及其形成的共生體在亞洲玉米螟控制中的生態(tài)效應(yīng),以玉米為宿主植物,以球孢白僵菌孢子懸浮液進(jìn)行灌根,在溫室內(nèi)構(gòu)建了二種交配型(MAT1-1-1型,B5；MAT1-2-1型,B2)球孢白僵菌-玉米共生體,并研究了共生體對(duì)玉米的生長(zhǎng)、對(duì)亞洲玉米螟的產(chǎn)卵選擇和幼蟲發(fā)育及其對(duì)球孢白僵菌生物學(xué)特性的影響。結(jié)果顯示：通過葉片離體培養(yǎng)、ITS基因和交配型基因MAT檢測(cè),均能檢測(cè)到白僵菌的內(nèi)生定殖；MAT1-2-1型B2菌株定殖檢出率高,MAT1-1-1型B5菌株在混合型接種中定殖有優(yōu)勢(shì)?；厥蘸蟮那蜴甙捉┚渲睆胶投玖o顯著性變化,但其產(chǎn)孢量都顯著提高其中回收B5處理組來源菌株的產(chǎn)孢量提高最顯著。接種過球孢白僵菌的玉米植株地上部生長(zhǎng)速度、生物量和地下根系生物量均優(yōu)于對(duì)照組,其中根系干重明顯增加,而地上植株干重也相對(duì)增加。MAT1-1-1型菌株B5對(duì)共生體玉米植株地上高度促生長(zhǎng)貢獻(xiàn)明顯；MAT1-2-1型菌株B2對(duì)共生體玉米植株地下干重增加貢獻(xiàn)明顯。總體上球孢白僵菌內(nèi)生定殖對(duì)玉米地下根系生物量影響大于對(duì)地上植株生物量的影響。在產(chǎn)卵選擇性試驗(yàn)中,各處理組亞洲玉米螟的產(chǎn)卵量顯著少于對(duì)照組。共生體對(duì)亞洲玉米螟產(chǎn)卵具有明顯的趨避作用,MAT1-2-1型菌株B2對(duì)產(chǎn)卵的趨避作用明顯,而MAT1-2-1型菌株B5的趨避作用較弱。在人工接種幼蟲的試驗(yàn)中,處理組回收的亞洲玉米螟幼蟲存活率均顯著低于對(duì)照組,其中,B5組回收幼蟲的存活率最低,僅為38.33%；處理組的化蛹率與對(duì)照組差異不顯著,但B5組的回收幼蟲化蛹率顯著低于B2組和對(duì)照組,僅為34.77%,這說明MAT1-1-1型B5菌株對(duì)玉米螟幼蟲發(fā)育抑制最明顯。上述結(jié)果表明,不同交配型球孢白僵菌內(nèi)生定殖效率有差異,在經(jīng)過內(nèi)生定殖后在產(chǎn)孢量方面有顯著性提高,兩個(gè)交配型菌株在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)具有協(xié)同增效作用；兩個(gè)交配型菌株均能夠通過內(nèi)生定殖與玉米形成共生體并促進(jìn)玉米植株的生長(zhǎng),這顯示球孢白僵菌和玉米之間已經(jīng)建立具有互惠關(guān)系的共生體。這種共生體通過趨避亞洲玉米螟產(chǎn)卵、抑制幼蟲存活和降低化蛹率等方面的潛力雖然不一樣,但都有助于對(duì)亞洲玉米螟的可持續(xù)生態(tài)防治,也證明了共生體的建成有效提高了玉米的生態(tài)適應(yīng)性,為利用球孢白僵菌內(nèi)共生性實(shí)施亞洲玉米螟防控提供了新思路。

球孢白僵菌；交配型；亞洲玉米螟；生態(tài)控制

在自然與農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中,生物種間關(guān)系是復(fù)雜的。例如,昆蟲病原真菌對(duì)昆蟲種群數(shù)量起著重要的調(diào)控作用,可以利用這一特性開展對(duì)農(nóng)作物害蟲的生物防治或生態(tài)調(diào)控。已有研究表明,一些昆蟲病原真菌除可以直接應(yīng)用于害蟲防治外,還能夠在自然狀態(tài)下或人工接種方式內(nèi)生定殖在植物中形成共生體,不僅導(dǎo)致植株生長(zhǎng)過程中的一系列生理生化變化,影響其代謝活動(dòng)和營(yíng)養(yǎng)利用效率等,起到促生作用、提高其抗逆性(抗病蟲和抗非生物脅迫等)和生態(tài)適應(yīng)性,亦直接或間接地影響著宿主病原菌或昆蟲的生長(zhǎng)與發(fā)育,從而深刻地影響著三者生態(tài)系統(tǒng)的生物結(jié)構(gòu)和組成[1-6]。

通常把能夠在植物中能夠定植生長(zhǎng)的昆蟲病原菌稱為內(nèi)生真菌。其中,球孢白僵菌Beauveriabassiana是目前研究最多的植物內(nèi)生昆蟲病原真菌之一,其能夠直接或間接地影響植物的代謝過程,同時(shí)對(duì)植物相關(guān)的害蟲本身、種群參數(shù)及其植物病害也有著雙重的控制和影響[7-17]。Bing和Lewis在1991年首次利用白僵菌植物內(nèi)生性開展了害蟲防治研究[7],他們用球孢白僵菌分生孢子懸液對(duì)玉米葉面進(jìn)行噴施開展歐洲玉米螟Ostrinianubilalis(Hübner)防治研究,表明葉面處理組能極大程度的降低歐洲玉米螟蛀孔數(shù)量。其后,1992年,他們采用莖基部注射的方法接種處于散粉期的玉米,發(fā)現(xiàn)注射的球孢白僵菌能夠侵入到玉米植株中,并沿著植株維管束向上擴(kuò)散[18-19]。他們調(diào)查發(fā)現(xiàn)1623條死亡歐洲玉米螟幼蟲中只有65條僵蟲,且在這些玉米植株中也未發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌分生孢子的存在,因此,他們推測(cè)定殖在玉米植株體內(nèi)的球孢白僵菌可能是分泌大量對(duì)歐洲玉米螟具有毒性的物質(zhì)而非孢子感染途徑控制歐洲玉米螟。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于利用內(nèi)生球孢白僵菌控制亞洲玉米螟種群機(jī)理和應(yīng)用的研究很少。本實(shí)驗(yàn)室張軍[20]建立了球孢白僵菌不同交配型分子鑒定體系。隨后,李曉慧等[21]利用不同交配型球孢白僵菌構(gòu)建了球孢白僵菌-玉米共生體。結(jié)果顯示不同交配型球孢白僵菌在亞洲玉米螟定殖檢測(cè)率有差異,且定殖回收后的球孢白僵菌交配型基因MAT1-1-1發(fā)生了變異,而交配型基因MAT1-2-1無變異。據(jù)此推測(cè),在內(nèi)生定殖過程中球孢白僵菌菌株與玉米植株之間會(huì)產(chǎn)生相互作用；不同交配型菌株之間也產(chǎn)生了相互作用。而且這種相互作用在提高玉米生態(tài)適應(yīng)性和對(duì)生態(tài)控制亞洲玉米螟的同時(shí),也在一定程度上引起了球孢白僵菌的表型和遺傳背景的改變。為此,選取前期工作中所使用的兩種球孢白僵菌菌株BbOFDH1-5(MAT1-1-1型,B5)和BbDPSD2(MAT1-2-1型,B2),在玉米幼苗期灌根接種,比較回收菌株與釋放原始菌株的生物學(xué)特性和毒力,比較研究不同交配型球孢白僵菌菌株對(duì)玉米植株生長(zhǎng)及其共生體抗蟲活性的影響。這將為今后改進(jìn)生態(tài)防治中的球孢白僵菌育種技術(shù)、應(yīng)用劑型、施用方式與策略提供新思路。

1 材料和方法

1.1 供試菌株與昆蟲

供試球孢白僵菌為 BbOFDH1-5和BbDPSD2菌株,交配型分別為單一的MAT1-1-1型(B5)和MAT1-2-1型菌株(B2)。菌種和亞洲玉米螟,均為本實(shí)驗(yàn)室分離保存培養(yǎng)或飼養(yǎng)。

1.2 玉米種植及球孢白僵菌接種處理

選用吉單209玉米種子,以1%的次氯酸鈉表面消毒5 min,無菌水沖洗5次,播入裝有滅菌基質(zhì)(田間土壤與營(yíng)養(yǎng)土體積比1∶1,121℃滅菌1.5 h)的花盆中。每盆保證1株苗。

待玉米幼苗長(zhǎng)到三葉期時(shí),對(duì)玉米幼苗進(jìn)行灌根接種處理。接種白僵菌孢子懸液的濃度為1×107個(gè)孢子/mL,每株接種20 mL。

1.3 內(nèi)生-球孢白僵菌的分離與鑒定

1.3.1 內(nèi)生球孢白僵菌的分離

每個(gè)處理組接種白僵菌14 d 后,選擇新鮮的活體健康植株。參照Soroush等方法[17],葉片經(jīng)表面消毒后,并剪裁均勻,放入PDA 培養(yǎng)基平板(直徑60 mm)上進(jìn)行檢測(cè),分離獲得內(nèi)生白僵菌。

1.3.2 內(nèi)生球孢白僵菌的分子鑒定

將回收內(nèi)生白僵菌和原始菌株接種到SDY 培養(yǎng)基里,26 ℃、180 r/min 培養(yǎng)3—4 d。收集菌絲并提取DNA,方法參照文獻(xiàn)[22]。交配型基因(MAT1-1-1/MAT1-2-1)的擴(kuò)增和分析參照李曉慧等方法進(jìn)行[21]。rDNA-ITS片段的擴(kuò)增和分析參照WHITE等的方法[23]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。所得rDNA-ITS測(cè)序結(jié)果,利用分析軟件DNAMAN將其序列與釋放原菌株的rDNA-ITS相比對(duì)。

1.3.3 內(nèi)生球孢白僵菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量測(cè)試

將回收內(nèi)生白僵菌和原始菌株分別接種到PDA培養(yǎng)基平板上,接種后放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)(26℃,RH=90%),每個(gè)菌株重復(fù)3次,待其充分產(chǎn)孢后觀察其菌落形態(tài)特征。

采用稀釋法進(jìn)行單孢分離測(cè)定。分別取各菌株的分生孢子于含有0.01%吐溫-80的無菌水中配制孢子懸浮液,孢子懸浮液含有200個(gè)孢子/5 μL左右時(shí),用無菌槍頭吸取5μL孢子懸浮液滴入到PDA培養(yǎng)基平板中。每菌株重復(fù)3次,待菌落長(zhǎng)到第10天時(shí)采用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。

待菌落長(zhǎng)到第14天時(shí),測(cè)量1 g孢子粉的產(chǎn)孢量。把0.1 g孢子粉放入100 mL 含有0.01%吐溫-80的無菌水中,在旋渦振蕩器上充分振蕩分散后,配制成孢子懸浮液。每個(gè)菌株取樣3次,滴在血球計(jì)數(shù)板上,鏡檢孢子數(shù),計(jì)算測(cè)定產(chǎn)孢量。

1 cm2菌落含孢量=(平均每小格孢子數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù))/(3.14×0.16)

1.3.4 內(nèi)生球孢白僵菌的室內(nèi)毒力測(cè)試

以3齡亞洲玉米螟幼蟲為試蟲。從不同處理組分離出來的菌株中隨機(jī)選擇3株進(jìn)行殺蟲活性測(cè)定。采用亞洲玉米螟非瓊脂半人工飼料配方進(jìn)行飼料配制[24],配制成1×108CFU/mL白僵菌孢子濃度的帶菌飼料。將帶菌飼料用滅菌藥匙分裝置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(約1 g/孔)備用。將3齡幼蟲單頭接入帶菌飼料的孔板中,每個(gè)處理組24頭,6次重復(fù)。對(duì)照處理為吐溫-80的無菌蒸餾水配制的無菌飼料飼喂。將接入幼蟲的培養(yǎng)板置于26℃、相對(duì)濕度60%—80%、L∶D=14 h∶10 h 恒溫培養(yǎng)箱。接種的第2天起連續(xù)調(diào)查10 d。觀察記錄幼蟲生長(zhǎng)狀態(tài)和每個(gè)處理組幼蟲死亡數(shù)量。

1.4 不同交配型球孢白僵菌-玉米共生體對(duì)玉米生長(zhǎng)影響

試驗(yàn)設(shè)接種B5、接種B2、接種B5+B2等量混合3個(gè)處理組,以澆灌無菌水為對(duì)照組CK,每個(gè)處理重復(fù)40盆,置于溫室(白天溫度(26±2)℃,夜間溫度(20±2)℃,相對(duì)濕度50%,光照12 h/d),每周澆1次營(yíng)養(yǎng)液。

植物生長(zhǎng)和生物量的測(cè)定：在玉米植株生長(zhǎng)35 d、63 d和91 d時(shí),每組選定40株,測(cè)定植株株高；100 d時(shí),測(cè)定植株干生物量(65℃,36 h)等指標(biāo)。

1.5 不同交配型球孢白僵菌-玉米共生體對(duì)亞洲玉米螟產(chǎn)卵偏好和生長(zhǎng)發(fā)育的影響1.5.1 共生體對(duì)亞洲玉米螟成蟲產(chǎn)卵影響的調(diào)查

本試驗(yàn)采用罩籠接成蟲的方法,調(diào)查不同玉米-球孢白僵菌共生體對(duì)亞洲玉米螟成蟲產(chǎn)卵的偏好性影響。在玉米植株3葉期扣罩籠,罩籠采用帶有尼龍紗網(wǎng)的網(wǎng)籠(80 cm×70 cm×80 cm)罩住供試盆栽的玉米植株上,底部墊以木板,每個(gè)罩籠含B5、B2或B5 + B2處理組的盆栽玉米植株各1盆,沒有侵染球孢白僵菌菌株的對(duì)照組1盆,每個(gè)罩籠含4盆玉米植株,隨機(jī)擺放,花盆間擺放距離一致,每盆1株玉米,并保持葉面積相對(duì)一致, 5次重復(fù)。在玉米植株7葉時(shí)期,每個(gè)罩籠內(nèi)釋放亞洲玉米螟剛羽化的成蟲5對(duì),釋放后立即用圖釘將網(wǎng)籠與木板固定,以防成蟲逃逸。整個(gè)試驗(yàn)期間,不進(jìn)行任何化學(xué)防治。于釋放玉米螟成蟲一周后統(tǒng)計(jì)不同處理植株上的卵塊數(shù)。以產(chǎn)卵反應(yīng)指數(shù)(ORI)[25]來衡量測(cè)試帶有不同交配型球孢白僵菌的植株對(duì)雌蛾產(chǎn)卵選擇反應(yīng)的引誘或趨避作用,其計(jì)算公式為：

ORI=(Nt-Nc)/N

式中,Nt為處理組卵塊數(shù)；Nc為對(duì)照組卵塊數(shù)；N為總產(chǎn)卵塊量。

1.5.2 共生體對(duì)亞洲玉米螟幼蟲存活率和化蛹率的影響

本試驗(yàn)采用發(fā)育測(cè)定的方法,當(dāng)玉米植株長(zhǎng)到抽雄期,選取發(fā)育良好的無蟲供試植株,侵染球孢白僵菌的B5組、B2組、B5+B2組的盆栽玉米植株各10盆,沒有侵染球孢白僵菌菌株的對(duì)照組10盆,4次重復(fù)。每個(gè)花盆的間隔50 cm,每株玉米內(nèi)接種亞洲玉米螟3齡幼蟲3頭。每隔2—3 d,記錄幼蟲存活情況；直至成蟲羽化時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束,檢查玉米植株上的亞洲玉米螟存活量、化蛹量等情況；然后計(jì)算各處理組和對(duì)照組的平均存活率和平均化蛹率等。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 15.10數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Microsoft Excel軟件分析。地上植株高度、地上部分干重、地下部分干重、產(chǎn)孢量、菌落直徑、幼蟲平均體重、幼蟲存活率和化蛹率采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)；生測(cè)矯正死亡率,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。方差分析使用單因素實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,多重比較采用Duncan氏新復(fù)極差法。

死亡率(%)=死亡數(shù)/供試蟲數(shù)×100%

校正死亡率(%)=(處理組死亡率±對(duì)照組死亡率)/(100-對(duì)照組死亡率)×100%。

2 結(jié)果分析

2.1 不同交配型球孢白僵菌-玉米共生體的構(gòu)建及回收菌株生物學(xué)特性分析

在不同處理組玉米葉片的PDA檢測(cè)平板中,處理組玉米植株組織上,均出現(xiàn)了白色略帶灰黃色粉末狀菌落(圖1),菌落厚實(shí),菌絲生長(zhǎng)隨時(shí)間推移不斷向外擴(kuò)展蔓延。沒有接種的CK對(duì)照組未檢測(cè)到白僵菌菌落。

圖1 不同處理組玉米葉片離體檢測(cè)內(nèi)生白僵菌的菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of entophytic B. bassiana colonies from corn leaves cultured in vitro

圖2 不同處理組回收內(nèi)生定殖菌落rDNA-ITS和MAT序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of rDNA-ITS and MAT sequences from endophytic colonies of different inoculation groupA：ITS擴(kuò)增譜帶 ITS amplification products；B：MAT1-1-1擴(kuò)增譜帶 MAT1-1-1 amplification products；C：MAT1-2-1擴(kuò)增譜帶 MAT1-2-1 amplification products；M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)樣品 DNA marker；泳道1-12樣品分別為：B5、B2、EN-B5-01、EN-B5-02、EN-B5-03、EN-B2-14、EN-B2-17、EN-B2-19、EN-B5+B2-23、EN-B5+B2-25、EN-B5+B2-27、無菌水對(duì)照

分別對(duì)接種前原始菌株和不同處理組回收內(nèi)生菌株進(jìn)行了分子鑒定。不同處理組回收菌株分別隨機(jī)選取3株。內(nèi)生真菌分別標(biāo)記為EN-B5-01、EN-B5-02、EN-B5-03；EN-B2-14、EN-B2-17、EN-B2-19；EN-B5+B2-23、EN-B5+B2-25、EN-B5+B2-27?？侱NA經(jīng)PCR擴(kuò)增均檢測(cè)到rDNA-ITS、MAT1-1-1和MAT1-2-1基因(圖2)。其中,B5處理組回收的菌株譜帶為MAT1-1-1型,B2處理組回收的菌株譜帶為MAT1-2-1型,而B5+B2等量混合處理組回收菌株中均含有MAT1-2-1型交配型。EN-B5+B2-23和EN-B5+B2-27含有MAT1-1-1型交配型,EN-B5+B2-25僅含有MAT1-2-1交配型,這顯示MAT1-2-1交配型菌株B2定殖檢測(cè)率較高,但是從交配型基因擴(kuò)增譜帶濃度看,回收的混合型菌株中B5占一定優(yōu)勢(shì)。所得rDNA-ITS測(cè)序結(jié)果與釋放原菌株的rDNA-ITS相比對(duì)同源性為100%,這顯示回收菌株來源于釋放菌株。

經(jīng)過純化后分離的不同菌株,在PDA培養(yǎng)基上的外觀形態(tài)表現(xiàn)出一定差異。經(jīng)過內(nèi)生的白僵菌均表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛,大多數(shù)菌落純白色,菌絲生長(zhǎng)過程中常產(chǎn)生枯黃色代謝水珠。EN-B5+B2在形態(tài)上與EN-B5和EN-B2相比對(duì),其菌落較為厚實(shí)；EN-B5和EN-B2相比沒有較大的差異。11株供試菌株菌落直徑、產(chǎn)孢量存在著明顯差異(表1)：菌株B5、EN-B5+B2-23、EN-B5+B2-25菌落直徑≥40.5 cm,表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)特性；菌株EN-B5-3、EN-B2-19、EN-B5+B2-23產(chǎn)孢量均在8.68×108孢子/mL以上?？傮w上看,釋放原B5菌株比釋放原B2菌株菌落生長(zhǎng)速度要優(yōu)；EN-B5類菌株產(chǎn)孢量為最優(yōu)。

以3齡亞洲玉米螟幼蟲為試蟲,測(cè)定12株球孢白僵菌(組合)的殺蟲活性。結(jié)果顯示(表1),未經(jīng)過內(nèi)生階段的原始菌株的致病性強(qiáng)于內(nèi)生真菌處理組。B5+B2菌株組合對(duì)亞洲玉米螟有較強(qiáng)致病性的為,處理5 d校正死亡率達(dá)(71.52±0.59)%,10d校正死亡率達(dá)(83.98±0.78)%,縮短了殺蟲周期且具有顯著的協(xié)同增效作用。

表1 球孢白僵菌原始菌株和回收定殖菌株的生物學(xué)特性及對(duì)亞洲玉米螟毒力測(cè)試校正死亡率

表格中菌落直徑和產(chǎn)孢量為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

2.2 不同交配型球孢白僵菌對(duì)玉米生物量的影響

圖3、圖4顯示了不同處理組玉米植株的高度和生物量。結(jié)果表明,在植株地上平均高度方面,3個(gè)生長(zhǎng)階段統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表現(xiàn)出相同趨勢(shì)差異,處理組B5、B2、B5+B2植株的63 d和91 d的平均高度均顯著高于對(duì)照組(F=3.034,P=0.0304)。在植株地上平均干重方面, 100 d植株平均干重,B5組和B2組與對(duì)照組沒有顯著差異,但是B5 + B2組與對(duì)照組有顯著性差異(F=3.295,P=0.0217)。同樣,處理組B5組和B2組與對(duì)照組沒有顯著差異,但B5+B2與對(duì)照組有顯著性差異(F=18.573,P<0.001)。綜合分析,接種過球孢白僵菌的玉米植株的地上部生長(zhǎng)高度、生物量和根重均優(yōu)于對(duì)照組。

圖3 不同處理組不同生長(zhǎng)時(shí)期玉米植株的地上平均高度Fig.3 Average height of corn among different groups during different growth stages標(biāo)注相同字母的不同處理間在0.05水平上差異不顯著；誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)差

圖4 不同處理組玉米植株的平均干重Fig.4 Average dry weight of corn among different groups標(biāo)注相同字母的不同處理間在0.05水平上差異不顯著；誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)差

2.3 不同交配型球孢白僵菌-玉米共生體對(duì)亞洲玉米螟成蟲產(chǎn)卵的趨避影響

表2顯示了不同處理組雌蛾產(chǎn)卵的狀況。結(jié)果表明,亞洲玉米螟雌蛾在處理組玉米植株上所產(chǎn)的卵量顯著少于對(duì)照,其中B2處理組的卵量最少,且顯著少于B5組處理,但與B5+B2混合處理組中的卵量差異不顯著。測(cè)試雌蛾群體對(duì)處理組玉米植株的平均產(chǎn)卵反應(yīng)指數(shù)ORI值均顯著的小于0(表2)。這一結(jié)果說明玉米-內(nèi)生球孢白僵菌共生體對(duì)亞洲玉米螟雌蛾產(chǎn)卵具有顯著的趨避作用,各組的趨避程度大小依次為B2>B5+B2>B5。

表2 不同處理組對(duì)亞洲玉米螟成蟲產(chǎn)卵的影響

* 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤； ORI： Overposition response index

2.4 不同交配型球孢白僵菌-玉米共生體對(duì)亞洲玉米螟幼蟲體重、存活率和化蛹率的影響

表3結(jié)果表明,對(duì)照組幼蟲較處理組幼蟲體重?zé)o顯著差異；3個(gè)處理組中B5組的亞洲玉米螟幼蟲存活率顯著低于對(duì)照組(F=0.425,P<0.001),而B2組和B5+B2組與對(duì)照沒有差異(F=0.0.025,P=0.260)；不同處理間僅B5組的化蛹率顯著低于B2組。綜合幼蟲存活率和化蛹率的數(shù)據(jù)來看,在接種過球孢白僵菌的玉米植株能顯著的抑制亞洲玉米螟幼蟲的存活和化蛹,各組的抑制程度大小依次為B5>B5+B2>B2。

表3 不同處理組的存活率和化蛹率

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 存活率=存活幼蟲數(shù)量/接蟲數(shù)量; 化蛹率=化蛹數(shù)量/存活幼蟲數(shù)量

3 結(jié)論與討論

球孢白僵菌是重要的蟲生真菌,是應(yīng)用最為廣泛的生物防治殺蟲真菌之一,在我國(guó)已經(jīng)成功應(yīng)用于亞洲玉米螟和馬尾松毛蟲DendrolimuspunctatusWalker的防治。近10年來,吉林省在應(yīng)用白僵菌防治亞洲玉米螟的面積逐年增加,現(xiàn)年防治面積穩(wěn)定在33萬hm2左右,累計(jì)防治面積超過200萬hm2,防治工作的實(shí)施為減少玉米產(chǎn)量損失、提高玉米品質(zhì)和促進(jìn)農(nóng)民增收起到了至關(guān)重要的作用,并大量降低了化學(xué)農(nóng)藥的投入,保護(hù)了環(huán)境和天敵,產(chǎn)生了顯著的生態(tài)效益。但是,隨著氣候變化、秸稈還田面積逐年上升、種植結(jié)構(gòu)調(diào)整等因素的影響,東北地區(qū)亞洲玉米螟的發(fā)生規(guī)律逐年變化,對(duì)利用白僵菌進(jìn)行生物防治工作提出了新的要求。

本研究首次采用不同交配型基因(MAT1-1-1,MAT1-2-1)標(biāo)記不同株系的球孢白僵菌,接種玉米構(gòu)建白僵菌-玉米共生體來研究其對(duì)亞洲玉米螟的生態(tài)控制作用。MAT1-1-1(I型)和MAT1-2-1(II型)兩種交配型是球孢白僵菌產(chǎn)生有性世代的必要條件之一[26-27]。采用交配型基因和rDNA-ITS基因?qū)Σ煌赀M(jìn)行遺傳標(biāo)記來研究?jī)?nèi)生真菌與寄主植物形成的共生體,為共生體的建立和回收的內(nèi)生白僵菌菌株的鑒定提供了快捷準(zhǔn)確途徑,是研究球孢白僵菌內(nèi)生定殖及互作機(jī)理的前提。本研究通過體外組織分離培養(yǎng)和基因擴(kuò)增證實(shí)成功構(gòu)建了球孢白僵菌-玉米內(nèi)共生體,并證明回收的內(nèi)生白僵菌來源于接種菌株,由于兩個(gè)菌株混合等量接種后分離到了混合交配型菌株,其交配型基因擴(kuò)增顯示MAT1-2-1型菌株 B2定殖檢出率高,但MAT1-1-1型菌株B5在混合型菌株中有優(yōu)勢(shì),其是否與自然界中不同交配型菌株比例不平衡或生態(tài)適應(yīng)性能力有相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究來證明。進(jìn)一步的生物學(xué)特性數(shù)據(jù)顯示球孢白僵菌回收菌株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)較原始菌株旺盛,菌落直徑大小和致病力有所下降但無顯著性差異,但是其產(chǎn)孢量普遍顯著提高,說明球孢白僵菌在玉米植株內(nèi)生定殖過程中確實(shí)發(fā)生了表型可塑性的改變。

內(nèi)生真菌定殖的發(fā)生能夠促進(jìn)植物、牧草生長(zhǎng)或影響生物群落的生物多樣性[28-29],具有不同基因型的植物內(nèi)生真菌與寄主植物形成共生關(guān)系后,對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生物量的影響不同[30]。本研究發(fā)現(xiàn)不同交配型內(nèi)生-球孢白僵菌對(duì)宿主植物生物量影響顯著,處理與對(duì)照相比較,其植株地上高度和地上地下生物量均有明顯提高,不同交配型球孢白僵菌內(nèi)共生對(duì)寄主植物的促生作用強(qiáng)度不一樣,交配型MAT1-1-1型B5菌株對(duì)地上植株高度增強(qiáng)作用明顯,交配型MAT1-2-1型菌株B2對(duì)地上地下生物量的提高作用明顯,而B5+B2混合處理組的地下根干重又顯著高于B5組和B2組,這不僅說明內(nèi)生菌的促生作用與交配型有關(guān),而且也與不同交配型菌株之間的相互作用有關(guān),不同交配型菌株之間的配合使用具有協(xié)同增效作用；同時(shí),由于處理組的地下根系干重顯著高于對(duì)照組,我們推測(cè)共生體的形成對(duì)地下根系的影響大于對(duì)地上部分的影響,進(jìn)一步對(duì)植株地上植株與地下部分生物量的總體分配產(chǎn)生了較大的影響,其中B5+B2組尤為明顯。

球孢白僵菌可以與寄主植物形成共生體,且具有控制害蟲種群作用,主要通過孢子感染引起植食昆蟲的僵化死亡[31-33]、產(chǎn)生毒性物質(zhì)影響發(fā)育或產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)等實(shí)現(xiàn)[34]。還有研究進(jìn)展顯示,內(nèi)生真菌作為異養(yǎng)生物,與植株所形成的共生體對(duì)植食性昆蟲的作用效果,與內(nèi)生真菌的種類和基因型是有關(guān)的[35-36]。本研究結(jié)果顯示在亞洲玉米螟雌蛾產(chǎn)卵時(shí),它會(huì)更多的主動(dòng)選擇在沒有接種球孢白僵菌或球孢白僵菌定殖率低的玉米植株上產(chǎn)卵,并且能有效地避開球孢白僵菌感染較多的B2組植株。這一現(xiàn)象在多食性昆蟲棉鈴蟲Helicoverpaarmigera對(duì)接種內(nèi)生真菌直立頂孢霉Acremoniumstrictum番茄葉片的產(chǎn)卵趨避作用也可觀測(cè)到[37]。進(jìn)一步的幼蟲接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)亞洲玉米螟取食不同交配型球孢白僵菌接種的玉米植株時(shí),雖然處理組存活幼蟲的重量與對(duì)照組的幼蟲沒有顯著差異,但與對(duì)照組相比,其處理組幼蟲存活率會(huì)降低。同時(shí),通過兩種不同交配型菌株構(gòu)建的共生體處理間的化蛹率存在顯著差異,其中,經(jīng)MAT1-1-1型菌株B5單一接種的玉米植株的抗蟲性,無論是存活率還是化蛹率都顯著低于單一接種MAT1-2-1型菌株B2,這進(jìn)一步說明兩個(gè)不同交配型菌株在與玉米形成共生體后,通過共生體控制亞洲玉米螟的潛力存在差異。

綜合以上結(jié)論,不同交配型球孢白僵菌在經(jīng)過內(nèi)生定殖后,玉米能夠利用球孢白僵菌與其形成的共生體來促進(jìn)自身生長(zhǎng)和提高玉米在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的適應(yīng)性。這種互惠關(guān)系的建成進(jìn)一步通過趨避亞洲玉米螟產(chǎn)卵和抑制其幼蟲發(fā)育、化蛹等實(shí)現(xiàn)對(duì)亞洲玉米螟的可持續(xù)生態(tài)防治。在這個(gè)過程中,不同交配型菌株對(duì)玉米的促生作用和其對(duì)亞洲玉米螟的生態(tài)控制潛力均得到了實(shí)現(xiàn),還在一定程度上實(shí)現(xiàn)了物種間的協(xié)同進(jìn)化,這為今后白僵菌施用方式提供了新思路。

[1] 王學(xué)霞, 楊民和, 王國(guó)紅. 植物-內(nèi)生真菌共生體對(duì)昆蟲種群的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2009, 29(10): 5618-5626.

[2] 荊元芳, 吳連杰, 馬傳洋, 任安芝, 高玉葆. 不同濃度和形態(tài)磷處理下內(nèi)生真菌感染對(duì)高羊茅的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 34(13): 3576-3583.

[3] 王欣禹, 周勇, 任安芝, 高玉葆. 內(nèi)生真菌感染對(duì)宿主羊草抗病性的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 34(23): 6789-6796.

[4] Arnold A E, Lewis L C. Ecology and evolution of fungal endophytes and their roles against insects//Vega F E, Blackwell M, eds. Insect-Fungal Assciations: Ecological and Evolution. Oxford: Oxford University Press, 2005: 74-96.

[5] Quesada-Moraga E, López-Díaz C, Landa B B. The hidden habit of the entomopathogenic fungusBeauveriabassiana: first demonstration of vertical plant transmission. PLoS One, 2014, 9(2): e89278.

[6] Cory J S, Hoover K. Plant-mediated effects in insect-pathogen interactions. Trends in Ecology & Evolution, 2006, 21(5): 278-286.

[7] Bing L A, Lewis L C. Suppression ofOstrinianubilalis(Hübner) (Lepidoptera: Pyralidae) by endophyticBeauveriabassiana(Balsamo) vuillemin. Environmental Entomology, 1991, 20(4): 1207-1211.

[8] Gurulingappa P, Sword G A, Murdoch G, McGee P A. Colonization of crop plants by fungal entomopathogens and their effects on two insect pests wheninplanta. Biological Control, 2010, 55(1): 34-41.

[9] Akello J, Dubois T, Coyne D, Kyamanywa S. Effect of endophyticBeauveriabassianaon populations of the banana weevil,Cosmopolitessordidus, and their damage in tissue-cultured banana plants. Entomologia Experimentalis et Applicata, 2008, 129(2): 157-165.

[10] Ownley B H, Griffin M R, Klingeman W E, Gwinn K D, Moulton K J, Pereira R M.Beauveriabassiana: endophytic colonization and plant disease control. Journal of Invertebrate Pathology, 2008, 98(3): 267-270.

[11] Tefera T, Vidal S. Effect of inoculation method and plant growth medium on endophytic colonization of sorghum by the entomopathogenic fungusBeauveriabassiana. BioControl, 2009, 54(5): 663-669.

[12] Posada F, Vega F E. Inoculation and colonization of coffee seedlings (CoffeaarabicaL.) with the fungal entomopathogenBeauveriabassiana(Ascomycota: Hypocreales). Mycoscience, 2006, 47(5): 284-289.

[13] Akello J, Dubois T, Coyne D, Kyamanywa S. The effects ofBeauveriabassianadose and exposure duration on colonization and growth of tissue cultured banana (Musasp.) plants. Biological Control, 2009, 49(1): 6-10.

[14] Brownbridge M, Reay S D, Nelson T L, Glare T R. Persistence ofBeauveriabassiana(Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte following inoculation of radiata pine seed and seedlings. Biological Control, 2012, 61(3): 194-200.

[15] Vega F E, Posada F, Aime M C, Pava-Ripoll M, Infante F, Rehner S A. Entomopathogenic fungal endophytes. Biological Control, 2008, 46(1): 72-82.

[16] Bitsadze N, Jaronski S, Khasdan V, Abashidze E, Abashidze M, Latchininsky A, Samadashvili D, Sokhadze I, Rippa M, Ishaaya I, Horowitz A R. Joint action ofBeauveriabassianaand the insect growth regulators diflubenzuron and novaluron, on the migratory locust,Locustamigratoria. Journal of Pest Science, 2012, 86(2), 293-300.

[17] Parsa S, Ortiz V, Vega F E. Establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control. Journal of Visualized Experiments, 2013, (74): e50360.

[18] Bing L A, Lewis L C. Endophyticbeauveriabassiana(balsamo) vuillemin in corn: the influence of the plant growth stage andostrinianubilalis(hübner). Biocontrol Science and Technology, 1992, 2(1): 39-47.

[19] Bing L A, Lewis L C. Temporal relationships betweenZeamays,ostrinianubilalis(Lep.:Pyralidae) and endophyticBeauveriabassiana. Entomophaga, 1992, 37(4): 525-536.

[20] 張軍, 趙強(qiáng), 汪洋洲, 張正坤, 李啟云. 球孢白僵菌交配型分子鑒定//中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì)成立50周年慶祝大會(huì)暨2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 北京: 中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì), 2012.

[21] 李曉慧, 汪洋洲, 張軍, 徐文靜, 張正坤, 劉艷微, 孟鑫睿, 馮樹丹, 李啟云. 不同交配型球孢白僵菌在玉米植株中的定殖及其交配型基因變異比較研究. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 743-749.

[22] 朱衡, 瞿峰, 朱立煌. 利用氯化芐提取適于分子生物學(xué)分析的真菌DNA. 真菌學(xué)報(bào), 1994, 13(1): 34-40.

[23] White T J, Bruns T, Lee S, Taylor J. 38-Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics//Innis M A, Gelfand D H, John J. Sninsky J J, White T J, eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press, 1990: 315-322.

[24] 宋彥英, 周大榮, 何康來. 亞洲玉米螟無瓊脂半人工飼料的研究與應(yīng)用. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 1999, 26(4): 324-328.

[25] 何康來, 文麗萍, 王振營(yíng), 周大榮, 叢斌. 幾種玉米氣味化合物對(duì)亞洲玉米螟產(chǎn)卵選擇的影響. 昆蟲學(xué)報(bào), 2000, 43(S1): 195-200.

[26] Yokoyama E, Yamagishi K, Hara A. Structures of the mating-type loci ofCordycepstakaomontana. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 5019-5022.

[27] Faeth S H, Hayes C J, Gardner D R. Asexual endophytes in a native grass: tradeoffs in mortality, growth, reproduction, and alkaloid production. Microbial Ecology, 2010, 60(3): 496-504.

[28] de Battista J P, Bacon C W, Severson R, Plattner R D, Bouton J H. Indole acetic acid production by the fungal endophyte of tall fescue. Agronomy Journal, 1990, 82(5): 878-880.

[29] Clay K, Holah J. Fungal endophyte symbiosis and plant diversity in successional fields. Science, 1999, 285(5434): 1742-1744.

[30] Morse L J, Faeth S H, Day T A.Neotyphodiuminteractions with a wild grass are driven mainly by endophyte haplotype. Functional Ecology, 2007, 21(4): 813-822.

[31] Wagner B L, Lewis L C. Colonization of corn,Zeamays, by the entomopathogenic fungusBeauveriabassiana. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(8): 3648-3473.

[32] Gurulingappa P, Sword G A, Murdoch G, McGee P A. Colonization of crop plants by fungal entomopathogens and their effects on two insect pests wheninplanta. Biological Control, 2010, 55(1): 34-41. (本條文獻(xiàn)與第8條文獻(xiàn)重復(fù), 請(qǐng)核對(duì))

[33] Bing L A, Lewis L C. Occurrence of the entomopathogenBeauveriabassiana(Balsamo) vuillemin in different tillage regimes and inZeamaysL. and virulence towardsOstrinianubilalis(Hübner). Agriculture, Ecosystems & Environment, 1993, 45(1/2): 147-156.

[34] Campos R A, Boldo J T, Pimentel I C, Dalfovo V, Araújo W L, Azevedo J L, Vainstein M H, Barros N M. Endophytic and entomopathogenic strains ofBeauveriasp to control the bovine tickRhipicephalus(Boophilus)microplus. Genetics & Molecular Research, 2010, 9(3): 1421-1430.

[35] Sullivan T J, Faeth S H. Gene flow in the endophyteNeotyphodiumand implications for coevolution withFestucaarizonica. Molecular Ecology, 2004, 13(3): 649-656.

[36] Clay K. Interactions among fungal endophytes, grasses and herbivores. Researches on Population Ecology, 1996, 38(2): 191-201.

[37] Jallow M F A, Dugassa-Gobena D, Vidal S. Influence of an endophytic fungus on host plant selection by a polyphagous moth via volatile spectrum changes. Arthropod-Plant Interactions, 2008, 2(1): 53-62.

Ecological control of the Asian corn borer,Ostriniafurnacalis(Guenée) by two clonedBeauveriabassianastrains

FENG Shudan1, LI Xiaohui1,2, WANG Yangzhou2, ZHANG Jun2, XU Wenjing2, ZHANG Zhengkun2, WANG Deli3, LI Qiyun2,*

1HarbinNormalUniversity,Harbin150025,China2InstituteofPlantProtection,JilinAcademyofAgriculturalSciences,Gongzhuling136100,China3NortheastNormalUniversity,Changchun130024,China

Ecological control methods are important for controlling agricultural pests. The Asian corn borer (ACB),Ostriniafurnacalis(Guenée), has been an extremely serious pest, that cause severe reduction in corn yields. The ubiquitous entomopathogenic fungusBeauveriabassianahas been used to suppress populations of the European corn borer (ECB),O.nubilalis, and ACB globally. Most studies have focused on the application ofB.bassiana, with limited studies on the relationship between the fungus, corn, and insects. Our previous research indicated thatB.bassianawith two mating-gene types, MAT1-1-1 and MAT1-2-1, could colonize corn. These mating-type genes had mutation sites cloned from endophytic fungal strains, which revealed corn plants and insects could impact fungal evolution. The purpose of the present study was to create endophytic symbiosis and determine the interaction amongB.bassiana(entophytic fungus), corn plants, and ACB. We created aB.bassiana-corn endophytic symbiosis by inoculating two mating-gene typeB.bassianastrains (MAT1-1-1 type B5 and MAT1-2-1 type B2) into corn plants in a suspension with a concentration of 1 × 107spores/mL. The effect of endophytic symbiosis on the growth of corn plants, oviposition preference of ACB adults, development of ACB larvae, and biological variation ofB.bassianawere evaluated in the greenhouse. The results showed that endophyticB.bassianacould be detected from corn leaves in vitro by culture. ITS and mating-type gene amplification and sequencing confirmed the successful creation of endophytic symbiosis. The MAT1-2-1 type B2 treatment group showed a higher endophytic detection rate than MAT1-1-1 type B5, whereas MAT1-1-1 type B5 was more successful during co-inoculation than MAT1-2-1 type B2. The variation of the colony diameter and virulence of the recoveredB.bassianawere not significant, but the sporulation quantity improved significantly, and the EN-B5 strain (recovered from the B5 treatment) changed the most obviously. The height of corn plants and dried biomass of treatment groups were higher than the CK group, while the underground root biomass significantly improved. The B5 strain contributed more to above-ground plant height and the B2 strain contributed more to underground root biomass. ACB moths were released into nylon-meshed cages. Egg quantity showed a significant difference in all treatment groups, which was lower than that in the CK group. Egg fecundity rate in the B2 group was 3.33%, but 53.33% in the CK group; therefore, the B2-corn endophytic symbiosis group was not the preferred host for ACB egg laying. The ACB larval survival rate and weight in treatment groups were significantly lower than those in the CK group. The ACB pupation rate of treatment groups was not significantly lower than that of the CK group, but there was a significant difference between B5 and B2 groups; the B5 group had the lowest survival (38.33%) and pupation rates (34.77%). These results demonstrated that the sporulation quantity of the recoveredB.bassianastrains significantly improved, and the synergism of the two strains with different mating-type genes was shown. The twoB.bassianamating-types could colonize in corn plants and mutualistic endophytic symbiosis was formed, which reinforced corn growth and improved the resistance against pests.B.bassiana-corn endophytic symbiosis is important for the sustainable management of pests by inhibiting oviposition and suppressing larval and pupal development. The results also proved that mutualistic symbiosis could improve the ecological adaptability ofB.bassianaand corn, which offered a new strategy for ACB control using endophytic symbiosis through the application ofB.bassiana.

Beauveriabassiana; mating types;Ostriniafurnacalis; ecological control

黑龍江自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201307)；吉林省科技廳重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140203006NY)

2015-08-08;

日期:2016-06-13

10.5846/stxb201508081673

* 通訊作者Corresponding author.E-mail: qyli1225@126.com

馮樹丹, 李曉慧, 汪洋洲, 張軍, 徐文靜, 張正坤, 王德利, 李啟云.二種交配型球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟的生態(tài)控制作用.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(2):650-658.

Feng S D, Li X H, Wang Y Z, Zhang J, Xu W J, Zhang Z K, Wang D L, Li Q Y.Ecological control of the Asian corn borer,Ostriniafurnacalis(Guenée) by two clonedBeauveriabassianastrains.Acta Ecologica Sinica,2017,37(2):650-658.