袁 磊，張國(guó)華，F(xiàn)aizan Ahmed SADIQ，何國(guó)慶*

發(fā)酵條件對(duì)紅茶菌發(fā)酵品質(zhì)及風(fēng)味的影響

袁 磊，張國(guó)華，F(xiàn)aizan Ahmed SADIQ，何國(guó)慶*

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

探究發(fā)酵條件對(duì)紅茶菌發(fā)酵品質(zhì)及發(fā)酵液風(fēng)味的影響。以發(fā)酵產(chǎn)酸率、感官評(píng)分為指標(biāo)，考察紅茶品種、茶葉浸提方式、糖添加量、茶葉添加量及紅茶菌膜接種量的影響；同時(shí)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明：將水煮沸后，加0.5%醇香紅茶浸提15 min，加入7%糖，冷卻后加8%紅茶菌膜于30 ℃條件下發(fā)酵10 d，得到的產(chǎn)品感官品質(zhì)好，發(fā)酵液呈清澈淡黃色，酸甜適中，微酸，口味純；茶湯經(jīng)發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)顯著改變，共檢測(cè)到19 種風(fēng)味成分，其中醇類(lèi)7 種、酯類(lèi)6 種、酸類(lèi)4 種、酚類(lèi)1 種、烷烴類(lèi)1 種，即風(fēng)味物質(zhì)多為醇類(lèi)、酯類(lèi)和酸類(lèi)。醇類(lèi)的含量為25.09%，其中乙醇含量為21.51%；酸類(lèi)的含量為46.40%，其中正辛酸含量為19.41%；酯類(lèi)的含量為15.91%，其中乙酸乙酯含量為9.47%。

紅茶菌；紅茶；發(fā)酵；風(fēng)味

紅茶菌起源于我國(guó)渤海一帶，約在150年前陸續(xù)傳至蘇聯(lián)的西伯利亞、高加索、貝加爾湖一帶。到20世紀(jì)70年代，紅茶菌湯風(fēng)靡日本，后又流傳到新加坡、馬來(lái)西亞、中國(guó)香港、美國(guó)、加拿大和俄羅斯等國(guó)家和地區(qū)[1]。紅茶菌是以糖茶水為發(fā)酵基質(zhì)，經(jīng)醋酸菌、酵母菌及乳酸菌等微生物共同發(fā)酵而形成，具有微甜、微酸、爽口的民間傳統(tǒng)酸性飲料[2]。紅茶菌發(fā)酵菌液中富含葡萄糖酸、醋酸、D-葡萄糖二酸-1,4-內(nèi)酯、乳酸、氨基酸、維生素和茶多酚等有益成分[3-6]，且具有抑菌[7]、抗癌[8]、提高機(jī)體免疫[9]、預(yù)防和治療高血壓[10]、高血脂[11]、動(dòng)脈硬化[12]等心血管疾病的保健功效。發(fā)酵后產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、醇和酯類(lèi)物質(zhì)，對(duì)風(fēng)味及感官品質(zhì)也有很大改善[13]。

紅茶菌一直是家庭自制自飲。由于菌種生長(zhǎng)、組成、保存的特殊性以及發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜性，而未能工業(yè)化生產(chǎn)。不同的發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵液品質(zhì)有顯著影響[14-17]。此外，微生物在發(fā)酵代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酸類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)等小分子物質(zhì)顯著改變茶水原有的風(fēng)味，進(jìn)而影響產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，開(kāi)展紅茶菌發(fā)酵的研究對(duì)推動(dòng)食品飲料工業(yè)的發(fā)展有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以4 種不同品種的紅茶為原料，研究不同茶浸提方式、茶葉添加量、糖添加量及紅茶菌膜接種量對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響，并對(duì)發(fā)酵液的風(fēng)味進(jìn)行解析，為紅茶菌功能性飲料的研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：紅茶菌菌種，本實(shí)驗(yàn)室保存。紅茶：醇香紅茶、大吉嶺紅茶、武夷巖茶和源山野紅茶，由上海融揚(yáng)生物技術(shù)有限公司提供，分別記為A、B、C、D。

硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、鹽酸、葡萄糖、硫酸亞鐵均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2 儀器與設(shè)備

6890N-5973I氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司；固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）裝置的手柄、固定搭載裝置、65 μm PDMS/DVB萃取頭 美國(guó)Supelco公司；SP-756PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；PB-10 pH計(jì) 賽多利斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶發(fā)酵流程

紅茶經(jīng)熱水浸提后濾出茶葉渣、添加白砂糖得到茶湯。茶湯冷卻至室溫后接入菌膜，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵10 d[18]。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 紅茶菌產(chǎn)品感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table1 Criteria for sensory evaluation of fermented black tea

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

pH值：pH計(jì)直接測(cè)量；總酸含量：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》；還原糖、總糖含量：參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》；茶多酚含量：參考GB/T 21733—2008《茶飲料》。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以產(chǎn)酸率和感官評(píng)分為指標(biāo)，選取不同紅茶品種、紅茶浸提方式、糖添加量、茶葉添加量和紅茶菌膜接種量5 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中分別選擇如下3 種浸提方式：E：將水煮沸，放入茶葉浸提15 min后，加入糖；F：將水煮沸后冷卻至80 ℃，放入茶葉浸提15 min后，加入糖；G：將茶葉、糖放入水中直接煮沸。以產(chǎn)酸率和感官評(píng)分為指標(biāo)。產(chǎn)酸率的計(jì)算如式（1）所示：

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇糖添加量、茶葉添加量及紅茶菌膜接種量作考察因素，以產(chǎn)酸率和感官評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（33）的正交試驗(yàn)，因素和水平如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平Table2 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.6 SPME-GC-MS的風(fēng)味測(cè)定

將2.0 mL分析樣品裝入15 mL萃取瓶中，放置于一定溫度水浴中并保持30 min，然后將已老化好的萃取頭（65 μm PDMS/DVB）插入到萃取瓶中進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，取出纖維頭并插入到氣相色譜汽化室中進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：采用DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.2 5 μ m），載氣為H e，流速為1 m L/m i n。色譜柱升溫程序?yàn)椋浩鹗贾鶞?5 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升到150 ℃，最后以10 ℃/min升到230 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，無(wú)分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃，掃描模式為全掃描，質(zhì)量范圍20～350 u。

化合物的鑒定通過(guò)NIST08譜庫(kù)對(duì)比和計(jì)算待測(cè)物的保留指數(shù)確定，同時(shí)采用面積歸一法計(jì)算各揮發(fā)性組分的相對(duì)含量。保留指數(shù)（retention index，RI）計(jì)算如式（2）所示：

式中：n為碳原子數(shù)；tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；tn＋1為碳原子數(shù)為n＋1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；ti為為樣品i的保留時(shí)間/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅茶原料與發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酸與品質(zhì)的影響

2.1.1 紅茶原料種類(lèi)對(duì)產(chǎn)酸與品質(zhì)的影響

圖1 茶種類(lèi)對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig. 1 Effects of different types of black tea on fermentation

不同紅茶品種中碳源、氮源等微生物營(yíng)養(yǎng)素存在差異，對(duì)發(fā)酵結(jié)果有影響[19]。如圖1所示，茶A的產(chǎn)酸率最高，達(dá)61%，茶B的產(chǎn)酸率最低，僅為44.8%。此外，茶A的感官評(píng)分最高，為88.40，茶香濃郁，口感滋潤(rùn)，而茶C的紅茶味較淡，入口澀嘴，感官評(píng)分僅為72.95。故選紅茶A為后續(xù)研究的紅茶品種。

2.1.2 紅茶浸提條件對(duì)產(chǎn)酸與品質(zhì)的影響

圖2 茶浸提方式對(duì)發(fā)酵的影響Fig. 2 Effects of tea brewing methods on fermentation

不同的浸提條件，如浸提溫度、浸提時(shí)間等，影響茶葉中溶出物的含量，進(jìn)而對(duì)發(fā)酵結(jié)果有影響[20]。如圖2所示，經(jīng)條件E浸提后發(fā)酵的產(chǎn)酸率最高，為59.7%，而經(jīng)條件G浸提后發(fā)酵的產(chǎn)酸率最低，僅為43.9%。較高的浸提溫度有利于茶葉中的碳源氮源、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)的溶出；方法G中直接將糖與茶葉一起煮沸浸提，可能導(dǎo)致在過(guò)濾茶葉時(shí)應(yīng)部分糖黏附在茶葉上，導(dǎo)致茶水中的糖含量降低，從而降低發(fā)酵產(chǎn)酸率。3種不同茶葉浸提方式得到產(chǎn)品的感官評(píng)分則無(wú)顯著性差異，分別為85.59、82.19和81.36。故選擇條件E作為茶葉浸提工藝。

圖3 糖添加量對(duì)發(fā)酵的影響Fig. 3 Effects of sugar concentration on fermentation

2.1.3 糖添加量對(duì)產(chǎn)酸與品質(zhì)的影響糖是微生物生長(zhǎng)的重要能源，適當(dāng)?shù)奶翘砑恿坷诩t茶菌中酵母、醋酸菌和乳酸菌的生長(zhǎng)[21]。如圖3所示，糖添加量為3%時(shí)產(chǎn)酸率最低，隨著糖添加量的升高，產(chǎn)酸率不斷上升，糖添加量為7%時(shí)產(chǎn)酸率為60.6%，糖添加量為10%時(shí)產(chǎn)酸率為60.9%。此外，有報(bào)道稱(chēng)，較大的糖添加量形成的高滲透壓會(huì)對(duì)微生物有抑制作用[22]。糖添加量對(duì)產(chǎn)品感官的影響顯著。當(dāng)糖添加量較低時(shí)，口味較淡，色澤淺，而當(dāng)糖添加量達(dá)10%時(shí)，產(chǎn)品過(guò)甜，且色澤太深。Goh等[17]也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糖質(zhì)量濃度高于110 g/L時(shí)，微生物的生長(zhǎng)受到抑制，故不宜添加高濃度的糖。

2.1.4 茶葉添加量對(duì)產(chǎn)酸與品質(zhì)的影響

圖4 茶葉添加量對(duì)發(fā)酵的影響Fig. 4 Effects of tea concentration on fermentation

茶葉含有糖類(lèi)、氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等豐富的營(yíng)養(yǎng)物，對(duì)紅茶菌的生長(zhǎng)繁殖有顯著影響。如圖4所示，茶葉添加量越大，茶水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更加豐富，微生物生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)酸率也越高：當(dāng)茶葉添加量為0.5%時(shí)，產(chǎn)酸率為60.6%，當(dāng)茶葉添加量為0.8%時(shí)產(chǎn)酸率高達(dá)61.4%。但高含量的茶導(dǎo)致發(fā)酵液的澀味、酸味較重，顏色較深，感官不佳。故綜合考慮茶葉添加量為0.5%。但當(dāng)茶葉添加量較低時(shí)，得到的紅茶菌飲料茶香味不足；隨著茶葉添加量的增加，紅茶菌發(fā)酵液的澀味增加。茶多酚物質(zhì)含量的增加在一定程度上增強(qiáng)對(duì)紅茶菌中微生物的生長(zhǎng)抑制作用，導(dǎo)致菌膜生成量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[23]。

2.1.5 紅茶菌膜接種量對(duì)產(chǎn)酸與品質(zhì)的影響

如圖5所示，隨著接種量的增加，發(fā)酵速度和產(chǎn)酸率提高。接種量為4%的產(chǎn)酸率為56.6%，接種量為6%時(shí)的產(chǎn)酸率為60.2%，接種量為8%的產(chǎn)酸率為62%，接種量為10%的產(chǎn)酸率為61.8%。但是，較高的菌種添加量導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)度，接種量為10%的感官評(píng)分僅為72.05，菌液的酸度高，酸味刺鼻，菌膜生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。任二芳等[24]則認(rèn)為，當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，菌膜中微生物會(huì)大量消耗發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于它們自身的繁殖，同時(shí)伴隨著大量代謝廢物的產(chǎn)生，從而不利于獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)物，且發(fā)酵液中總酸含量過(guò)大，影響發(fā)酵液品質(zhì)。

圖5 紅茶菌膜接種量對(duì)發(fā)酵的影響Fig. 5 Effects of inoculum size on fermentation

2.2 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究影響紅茶菌發(fā)酵的3 個(gè)因素：糖添加量（A）、茶葉添加量（B）和接種量（C），每個(gè)因素選取3 個(gè)水平，結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件Table3 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of fermentation conditions

由表3可知，選擇的3 個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酸率的影響程度由大到小依次為C＞A＞B，即接種量＞糖添加量＞茶葉添加量，最優(yōu)水平為A2B2C3，即糖添加量7%、茶葉添加量0.5%、接種量8%。此時(shí)的感官評(píng)分91.36。發(fā)酵液呈清澈淡黃色，酸甜適中，有甜香味，微酸，口味純，口感細(xì)膩潤(rùn)滑，氣味協(xié)調(diào)柔和。在此最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)酸率為60.9%，感官評(píng)分為92.31，說(shuō)明優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性較高。

2.3 紅茶發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)的變化

采用SPME-GC-MS對(duì)紅茶湯及發(fā)酵后發(fā)酵液的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，并根據(jù)它們的變化規(guī)律做分類(lèi)。如圖6和表4所示，紅茶湯中共14 種風(fēng)味成分，其中醛類(lèi)3 種、醇類(lèi)3 種、酯類(lèi)2 種、酸類(lèi)3 種、酮類(lèi)1 種、酚類(lèi)1 種、烷烴類(lèi)1 種。發(fā)酵后的茶水共19 種風(fēng)味成分，其中醇類(lèi)7 種、酯類(lèi)6 種、酸類(lèi)4 種、酚類(lèi)1 種、烷烴類(lèi)1 種。這說(shuō)明發(fā)酵后的茶水風(fēng)味物質(zhì)增加，且風(fēng)味物質(zhì)多為醇類(lèi)、酯類(lèi)和酸類(lèi)。醇類(lèi)的含量為25.09%，其中乙醇含量為21.51%；酸類(lèi)的含量為46.40%，與紅茶湯的5.59%相比明顯提高，這也與發(fā)酵過(guò)程中總酸和pH值的變化一致。此外，酯類(lèi)的含量為15.91%，這是由于酸類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)的增加且發(fā)生酯化反應(yīng)。風(fēng)味的差異來(lái)源于紅茶菌中微生物的代謝，即在發(fā)酵初期蔗糖先被酵母菌分解成葡萄糖和果糖，并進(jìn)一步發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，醋酸菌則在培養(yǎng)液中有葡萄糖、果糖和乙醇后開(kāi)始大量繁殖，并將葡萄糖和果糖氧化成葡萄糖酸、乙酸等代謝產(chǎn)物。酵母菌產(chǎn)生的乙醇能刺激醋酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生更多乙酸，而醋酸菌產(chǎn)生的乙酸又會(huì)刺激酵母菌產(chǎn)生乙醇[25]。

圖6 紅茶發(fā)酵前（A）、后（B）風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)GC-MS圖譜Fig. 6 GC-MS profiles of volatile compounds in black tea and fermented black tea

表4 紅茶發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)的變化Table4 Changes in flavor compounds between black tea and fermented black tea

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵工藝對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)有影響：以醇香紅茶為原料，將水煮沸后放入0.5%茶葉浸提15 min后，加入7%蔗糖，冷卻至室溫后接入8%紅茶菌膜于30 ℃條件下發(fā)酵10 d，此時(shí)產(chǎn)品感官品質(zhì)好，發(fā)酵液呈清澈淡黃色，酸甜適中，微酸，口味純，氣味協(xié)調(diào)柔和。

紅茶湯經(jīng)發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)顯著改變，共有19 種風(fēng)味成分，其中醇類(lèi)7 種、酯類(lèi)6 種、酸類(lèi)4 種、酚類(lèi)1 種、烷烴類(lèi)1 種，即風(fēng)味物質(zhì)多為醇類(lèi)、酯類(lèi)和酸類(lèi)。醇類(lèi)的含量為25.09%，其中乙醇含量為21.51%；酸類(lèi)的含量為46.40%，其中正辛酸含量為19.41%；酯類(lèi)含量為15.91%，其中乙酸乙酯含量為9.47%。

鑒于人們對(duì)保健養(yǎng)生的不斷重視及紅茶菌的多重保健功效，目前除紅茶菌飲料外，已開(kāi)發(fā)出紅茶菌面包、紅茶菌酸奶、紅茶菌芝麻酥等各種產(chǎn)品，這必將對(duì)推動(dòng)紅茶菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展、豐富人們飲食文化有重要意義。

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Effects of Fermentation Conditions on Quality and Flavor of Kombucha

YUAN Lei, ZHANG Guohua, Faizan Ahmed SADIQ, HE Guoqing*
(College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

The objective of this study was to analyze how different fermentation methods can affect the fermentation prof le of kombucha in terms of its f avor, fermentation yield (total acid/sugar consumption) and sensory evaluation. The variable factors considered included black tea type, tea extraction modes, concentrations of sugar and tea and inoculum size of starter culture. The optimized conditions for the best quality of kombucha were obtained after adding 0.5% mellow black tea to boiling water and keeping it at room temperature for 15 min, followed by the addition of 7% sugar and 8% komucha starter culture. Finally, the fermentation process was carried out at 30 ℃ for 10 days. After fermentation the broth was clear with pale yellow color, and sweet and moderately sour taste. A considerable change in f avor prof le was observed before and after the fermentation under the optimized conditions. A total of 19 volatile aroma compounds were identif ed including 7 alcohols, 6 esters, 4 acids, 1 phenol and 1 hydrocarbon. The contents of alcohols, acids and esters were 25.09%, 46.40% and 15.91%, respectively.

kombucha; black tea; fermentation; flavor

10.7506/spkx1002-6630-201702015

TS201.3

A

1002-6630（2017）02-0092-06

袁磊, 張國(guó)華, SADIQ F A, 等. 發(fā)酵條件對(duì)紅茶菌發(fā)酵品質(zhì)及風(fēng)味的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 92-97.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702015. http://www.spkx.net.cn

YUAN Lei, ZHANG Guohua, SADIQ F A, et al. Effects of fermentation conditions on quality and flavor of kombuchaz[J]. Food Science, 2017, 38(2): 92-97. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702015.

http://www.spkx.net.cn

2016-03-29

中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2016M592002）

袁磊（1989—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：leiyuan@zju.edu.cn

*通信作者：何國(guó)慶（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：gqhe@zju.edu.cn