殷海松，張仁寬，常燕鋼，鄭 宇，王 敏,*

巴氏醋桿菌TCA循環(huán)代謝對醋酸發(fā)酵的影響

殷海松1,2，張仁寬1，常燕鋼1，鄭 宇1，王 敏1,*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300350）

巴氏醋桿菌是醋酸發(fā)酵常用微生物，通過添加醋酸、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)抑制劑和中間產(chǎn)物干擾TCA循環(huán)能量代謝，研究其對菌體生長和醋酸發(fā)酵的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的醋酸，胞內(nèi)TCA代謝關(guān)鍵酶的表達量出現(xiàn)上調(diào)，胞內(nèi)ATP含量增加了125%，表明能夠強化TCA循環(huán)能量代謝，促進菌體生長。添加TCA循環(huán)抑制劑抑制TCA循環(huán)能量代謝，巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸受到顯著抑制，菌體生物量分別降低了90%和87%，產(chǎn)酸量分別降低了90%和94%。添加0.05%草酰乙酸、琥珀酸、蘋果酸等TCA中間產(chǎn)物，巴氏醋桿菌胞內(nèi)ATP含量分別提高了202%、185%和165%，表明添加草酰乙酸等中間物質(zhì)能夠顯著提高TCA循環(huán)偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能，發(fā)酵72 h時，菌體生物量分別提高了92%、106%和104%，菌體產(chǎn)酸量分別提高了30%、33%和31%。實驗結(jié)果表明，TCA循環(huán)能量代謝對巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸產(chǎn)生顯著影響，TCA能量代謝的強化對醋酸發(fā)酵產(chǎn)生正向作用。

巴氏醋酸桿菌；TCA循環(huán)；能量代謝；醋酸；ATP含量

醋酸是一種常見的有機酸，在食品、生物和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。醋酸菌是指能將乙醇氧化成醋酸的一類細菌的總稱[1-2]，基于16S rRNA基因序列同源性分析，將醋酸菌分為10 個屬[3-6]，其中醋酸桿菌（Acetobacter）屬的一些細菌由于具有很強的乙醇氧化能力并且能在發(fā)酵過程中積累大量乙酸，被廣泛應(yīng)用于醋酸發(fā)酵[7-10]。

在醋酸發(fā)酵過程中，胞內(nèi)能量對于菌體醋酸耐受性有重要影響，其中，醋酸分子的泵出機制以及ATP依賴型的轉(zhuǎn)運蛋白，如AatA和ClpB均與菌體的能量代謝直接相關(guān)[11-14]，因此能量供應(yīng)對于保障巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）在高酸環(huán)境下的正常代謝非常重要[15]。巴氏醋酸桿菌能量代謝途徑主要有乙醇呼吸鏈產(chǎn)能途徑、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)偶聯(lián)有氧呼吸產(chǎn)能途徑等[15]。其中，TCA循環(huán)作為細菌重要的代謝途徑，不僅產(chǎn)生許多重要物質(zhì)生物合成的前體，并且是菌體獲得能量的最有效方式[16-17]。前期研究發(fā)現(xiàn)，醋酸菌在以乙醇為底物發(fā)酵生產(chǎn)醋酸的過程中可以促進TCA循環(huán)代謝，從而提高發(fā)酵效率[18]。

本實驗通過添加TCA循環(huán)抑制劑和草酰乙酸、蘋果酸、琥珀酸等TCA循環(huán)中間產(chǎn)物，研究巴氏醋酸桿菌TCA循環(huán)對菌體生長和醋酸發(fā)酵的影響，研究成果將有利于指導(dǎo)醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化與調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌AC2005由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏（保藏編號：CGMCC3089）。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母膏15 g/L、碳酸鈣20 g/L、瓊脂17 g/L，pH值自然；生長培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨10 g/L，pH值自然。接種前添加醋酸至所需要的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母膏15 g/L，pH值自然，接種前加入無水乙醇至28 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L，pH值自然，接種前加入無水乙醇至56 g/L。

1.1.3 試劑

無水葡萄糖（分析純） 天津福晨化學(xué)試劑廠；蛋白胨 英國Oxiod公司；酵母膏 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；丙二酸、三氟乙酸（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；醋酸（分析純） 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；檸檬酸、草酰乙酸、琥珀酸、蘋果酸 美國Amresco公司；α-酮戊二酸 美國Biotopped公司；微生物細胞活性檢測試劑盒 美國Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1250紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HYG-W1搖床 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；YJ-875S醫(yī)用超凈臺 蘇州凈化設(shè)備廠；Multiskan Ascet酶標(biāo)儀、Dionex Ultimate 3000液相色譜-LTQ Orbitrap Velos Pro質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo公司；TGL-16B高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

1.3.1.1 種子培養(yǎng)

在種子培養(yǎng)基（40 mL培養(yǎng)基/250 mL搖瓶）中接入斜面菌種1 環(huán)，在30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)27 h，至OD610nm為1.38±0.12。

1.3.1.2 搖瓶醋酸發(fā)酵

在發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL培養(yǎng)基/500 mL搖瓶）中，按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接入種子液，在發(fā)酵溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下進行醋酸發(fā)酵。

1.3.2 醋酸對巴氏醋桿菌菌體生長及胞內(nèi)ATP含量的影響

按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%和1.0%醋酸的生長培養(yǎng)基中，研究醋酸對菌體生長及胞內(nèi)ATP含量的影響。

1.3.3 醋酸對巴氏醋桿菌TCA循環(huán)代謝的影響

以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%和1%醋酸的生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期中期，收集菌體，利用蛋白質(zhì)譜的方法分析菌體蛋白表達差異，重點分析其中TCA循環(huán)相關(guān)蛋白質(zhì)表達差異。

1.3.4 TCA循環(huán)抑制劑對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加50 mmol/L丙二酸和三氟乙酸，進行醋酸發(fā)酵，檢測發(fā)酵過程菌體和醋酸含量。

1.3.5 能量代謝中間產(chǎn)物對巴氏醋桿菌TCA循環(huán)能量代謝的強化及醋酸發(fā)酵的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.05%檸檬酸、α-酮戊二酸、蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸，進行醋酸發(fā)酵，檢測發(fā)酵過程菌體和醋酸含量。收集菌體，分析其胞內(nèi)ATP含量。

1.3.6 分析檢測方法

1.3.6.1 菌體生物量

將發(fā)酵液于6 000 r/min離心10 min，除去上清液，將菌體細胞置于干燥箱中，37 ℃條件下恒溫烘干至恒質(zhì)量，稱量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌體生物量。

1.3.6.2 醋酸含量

采用酸堿滴定法，取1 mL發(fā)酵液于250 mL三角瓶中，加入蒸餾水15 mL，以酚酞作指示劑，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液將發(fā)酵液滴定至粉紅色，測得醋酸含量。

1.3.6.3 菌體胞內(nèi)ATP含量的測定

收集菌體，利用微生物細胞活性檢測試劑盒測定菌體胞內(nèi)ATP含量，結(jié)果以ng/g（以細胞干質(zhì)量計）表示。

1.3.6.4 蛋白質(zhì)譜分析

收集對數(shù)中后期菌體，PBS洗滌后超聲破碎，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入4 倍體積預(yù)冷的丙酮，－20 ℃條件下過夜沉淀；4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，得到胞內(nèi)總蛋白[13]。蛋白樣品委托瀚盟生物技術(shù)（天津）有限公司進行蛋白質(zhì)譜分析。

檢測軟件：Proteomics Discovery 1.2；檢索算法：Sequest算法；比對數(shù)據(jù)庫：Acetobacter pasteurianus IFO 32831-01蛋白質(zhì)組（NCBI登錄號：PRJNA59279）[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗共設(shè)3 個平行，圖表生成采用Origin 7.5軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸對巴氏醋桿菌菌體生長及TCA循環(huán)代謝的影響

圖1 醋酸對巴氏醋桿菌菌體生長的影響Fig. 1 Effect of acetic acid on the growth of Acetobacter pasteurianus

由圖1可知，添加1%的醋酸能顯著促進菌體生長，培養(yǎng)72 h時，生物量與不添加醋酸相比增加了120%。

圖2 醋酸對巴氏醋桿菌胞內(nèi)ATP含量的影響Fig. 2 Effect of acetic acid concentrations on the intracellular ATP concentration of Acetobacter pasteurianus

分析胞內(nèi)ATP含量發(fā)現(xiàn)（圖2），與對照相比，初始培養(yǎng)基中添加1.0%醋酸，胞內(nèi)ATP含量增加了125%。

表1 醋酸對巴氏醋酸桿菌TCA循環(huán)代謝途徑關(guān)鍵酶表達量的影響Table1 Effect of acetic acid on the expression levels of the key enzymes related to TCA cycle energy metabolism ofAcetobacter pasteurianus

進一步利用蛋白質(zhì)譜的方法分析了醋酸對菌體TCA循環(huán)代謝途徑關(guān)鍵酶表達量的影響，從表1可知，當(dāng)添加1%醋酸時，胞內(nèi)TCA循環(huán)代謝關(guān)鍵酶的表達量出現(xiàn)上調(diào)，尤其是順烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、延胡索酸合成酶、蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和蘋果酸醌氧化還原酶表達量分別上調(diào)至不添加醋酸表達量的1.80、1.90、2.14、2.00、2.69 倍和1.63 倍。

該研究結(jié)果與本課題組前期利用生長培養(yǎng)基研究醋酸對菌體生長和代謝的影響結(jié)果一致[12]。醋酸可能通過琥珀酸輔酶A途徑[12,20-21]，利用琥珀酸輔酶A將胞內(nèi)的醋酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進一步進入TCA循環(huán)，強化胞內(nèi)TCA循環(huán)能量代謝，使巴氏醋酸桿菌產(chǎn)生更多的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）和ATP，滿足菌體生長過程中對能量的需求。

2.2 TCA循環(huán)抑制劑對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵的影響

圖3 TCA循環(huán)抑制劑對巴氏醋酸桿菌醋酸發(fā)酵菌體生物量（a）和醋酸含量（b）的影響Fig. 3 Effect of TCA cycle inhibitors on acetic acid fermentation of Acetobacter pasteurianus

三氟乙酸可以使檸檬酸合成酶失活，它是TCA循環(huán)的強抑制劑[22]。丙二酸作為琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑抑制TCA循環(huán)過程[23-24]。丙二酸和三氟乙酸對巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵的影響如圖3所示，巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸受到顯著抑制，菌體生物量分別降低了90%和87%，產(chǎn)酸量分別降低了90%和94%。這是由于丙二酸抑制TCA循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的活性，阻斷延胡索酸和蘋果酸的合成；三氟乙酸抑制TCA循環(huán)中檸檬酸合成酶的活性，阻斷檸檬酸的合成，使TCA循環(huán)代謝提供的能量減少，從而使菌體生長和產(chǎn)酸受到抑制。

2.3 能量代謝中間產(chǎn)物對巴氏醋桿菌TCA循環(huán)能量代謝的強化及醋酸發(fā)酵的影響

由圖4可知，添加草酰乙酸、琥珀酸、蘋果酸能顯著促進菌體生長和產(chǎn)酸，發(fā)酵72 h時，菌體生物量分別比空白提高了92%、106%和104%，菌體產(chǎn)酸分別比空白組提高了30%、33%和31%；添加α-酮戊二酸后菌體生物量比空白組提高了51%；添加檸檬酸對菌體生長和產(chǎn)酸均沒有影響。

圖4 添加能量代謝中間產(chǎn)物對巴氏醋桿菌菌體生長（a）、產(chǎn)酸（b）和胞內(nèi)ATP含量（c）的影響Fig. 4 Effect of intermediate metabolites on the cell growth (a), acetic acid accumulation (b) and intracellular ATP concentration (c) of Acetobacter pasteurianus

進一步分析胞內(nèi)ATP含量發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵24 h時，添加草酰乙酸、琥珀酸、蘋果酸后，胞內(nèi)ATP含量分別比空白組提高了202%、185%和165%；添加α-酮戊二酸后，胞內(nèi)ATP含量比空白提高了20%；添加檸檬酸對胞內(nèi)ATP含量沒有影響。結(jié)果表明添加草酰乙酸、琥珀酸、蘋果酸等TCA循環(huán)代謝中間產(chǎn)物能夠顯著提高TCA循環(huán)偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能。添加草酰乙酸可能強化草酰乙酸與乙酰輔酶A在檸檬酸合成酶催化下縮合為檸檬酸的反應(yīng)，并釋放更多輔酶A；添加琥珀酸可能強化了琥珀酸氧化脫氫生成延胡索酸的反應(yīng)，并釋放更多的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH），經(jīng)過呼吸鏈傳遞最終生成更多的ATP；添加蘋果酸可能強化了蘋果酸脫氫生成草酰乙酸的反應(yīng)，并釋放更多的NADH，經(jīng)過呼吸鏈傳遞最終生成更多的ATP；添加α-酮戊二酸可能強化了α-酮戊二酸脫羧生成琥珀酰輔酶A，并釋放少量的NADH；添加檸檬酸未能提高TCA循環(huán)產(chǎn)能，推測原因是TCA循環(huán)對檸檬酸的需求量比較少，并且檸檬酸生成順烏頭酸反應(yīng)未產(chǎn)生NADH[16]。通過TCA循環(huán)偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能的強化，為巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸提供更多的能量[15]，滿足菌體快速生長和適應(yīng)高酸生存環(huán)境對能量的需求，提高菌體對醋酸耐受性[25]，從而提高菌體生物量，進一步提高醋酸發(fā)酵效率。

3 結(jié) 論

通過添加醋酸、TCA循環(huán)抑制劑和中間產(chǎn)物，干擾醋酸菌TCA循環(huán)能量代謝，研究巴氏醋桿菌能量代謝對醋酸發(fā)酵的影響。添加1%醋酸，巴氏醋桿菌胞內(nèi)TCA循環(huán)代謝關(guān)鍵酶的表達量出現(xiàn)上調(diào)，胞內(nèi)ATP含量增加了125%，表明添加1%醋酸能夠強化胞內(nèi)TCA能量代謝，促進菌體生長。添加丙二酸和三氟乙酸抑制TCA循環(huán)能量代謝，減少TCA循環(huán)代謝能量供給，巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸受到顯著抑制，菌體生物量分別降低了90%和87%，產(chǎn)酸分別降低了90%和94%。添加0.05%草酰乙酸、琥珀酸、蘋果酸，巴氏醋桿菌胞內(nèi)ATP含量分別提高了202%、185%和165%，表明添加草酰乙酸等中間物質(zhì)能夠顯著提高TCA循環(huán)偶聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)能，發(fā)酵72 h時，菌體生物量分別提高了92%、106%和104%，菌體產(chǎn)酸分別提高了30%、33%和31%，表明TCA循環(huán)能量代謝對巴氏醋桿菌菌體生長和產(chǎn)酸具有顯著影響，TCA循環(huán)能量代謝的強化對醋酸發(fā)酵產(chǎn)生正向作用。

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Effects of TCA Cycle Metabolism on the Acetic Acid Fermentation of Acetobacter pasteurianus

YIN Haisong1,2, ZHANG Renkuan1, CHANG Yangang1, ZHENG Yu1, WANG Min1,*
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. School of Bioengineering, Tianjin Modern Vocational Technology College, Tianjin 300350, China)

The most commonly used microorganism for acetic acid fermentation is Acetobacter pasteurianus. In this investigaton, tricarboxylic acid cycle (TCA cycle) energy metabolism in Acetobacter pasteurianus was interfered by adding acetic acid, TCA cycle inhibitors, and intermediate metabolites. The effects of energy metabolism on the cell growth and acetic acid fermentation of Acetobacter pasteurianus were studied. Results showed that addition of 1% acetic acid obviously strengthened intracellular TCA cycle energy metabolism. The expression levels of the key enzymes involved in the intracellular TCA cycle were significantly up-regulated, and intracellular ATP concentration was increased by 125% compared with that without adding acetic acid. TCA cycle energy metabolism was inhibited by adding TCA cycle inhibitors, the cell growth and acetic acid concentration were signif cantly inhibited and bacterial biomass was reduced by 90% and 87%, respectively. Acetic acid concentration was reduced by 90% and 94%, respectively. Addition of 0.05% intermediates metabolites (oxaloacetic acid, malic acid, and succinic acid) increased intracellular ATP concentration by 202%, 185% and 165%, respectively, suggesting signif cantly enhanced TCA cycle-coupled respiratory chain energy metabolism. Bacterial biomass was increased by 92%, 106% and 104% respectively, and acetic acid concentration was increased by 30%, 33% and 31%, respectively, after fermentation for 72 h. Our f ndings show that TCA cycle energy metabolism has a signif cant impact on the bacterial growth and acetic acid production of Acetobacter pasteurianus and that strengthening TCA energy metabolism has a positive effect on acetic acid fermentation.

Acetobacter pasteurianus; tricarboxylic acid cycle; energy metabolism; acetic acid; ATP concentration

10.7506/spkx1002-6630-201702013

Q815

A

1002-6630（2017）02-0082-05

2016-04-01

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102106）；“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2016YFD0400505）；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目（RT15R49）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31671851；31471722）；天津市科技支撐計劃項目（16YFZCNC00650）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃項目（13JCQNJC10000）

殷海松（1980—），男，副教授，博士，研究方向為食品發(fā)酵技術(shù)。E-mail：yinhaisong1980@163.com

*通信作者：王敏（1971—），女，教授，博士，研究方向為食品發(fā)酵微生物功能分析與發(fā)酵技術(shù)。E-mail：minw@tust.edu.cn

殷海松, 張仁寬, 常燕鋼, 等. 巴氏醋桿菌TCA循環(huán)代謝對醋酸發(fā)酵的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 82-86.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702013. http://www.spkx.net.cn

YIN Haisong, ZHANG Renkuan, CHANG Yangang, et al. Effects of TCA cycle metabolism on the acetic acid fermentation of Acetobacter pasteurianus[J]. Food Science, 2017, 38(2): 82-86. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702013. http://www.spkx.net.cn