朱益波，魯如彬，程 俊，王 穎,2，齊 斌，王立梅,*

重組大腸桿菌合成光學(xué)純L-苯基乳酸

朱益波1，魯如彬1，程 俊1，王 穎1,2，齊 斌1，王立梅1,*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215500；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

以巨大芽孢桿菌Z2013513基因組DNA為模板，分別PCR擴(kuò)增得到L-乳酸脫氫酶基因（ldhL）和葡萄糖脫氫酶基因（gdh），將gdh與ldhL分別連接至表達(dá)載體pETDuet，獲得共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-ldhL-gdh。經(jīng)轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證獲得重組菌大腸桿菌BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和比酶活力分析表明重組蛋白L-乳酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶均成功表達(dá)且具有酶活力。在37 ℃、200 r/min條件下，經(jīng)60 min反應(yīng)，催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/L L-苯基乳酸。產(chǎn)物L(fēng)-苯基乳酸光學(xué)純度（＞99%），底物摩爾轉(zhuǎn)化率（59.55%），結(jié)果表明此重組體系可用于高效合成高光學(xué)純L-苯基乳酸。

L-2-羥基-3-苯基丙酸；巨大芽孢桿菌Z2013513；L-乳酸脫氫酶；葡萄糖脫氫酶；NADH再生；全細(xì)胞催化

L-苯基乳酸（L-phenyllactic acid，L-PLA），即L-2-羥基-3-苯基丙酸[1]，是PLA的一種手性異構(gòu)體，與手性對映異構(gòu)體D-PLA天然共存于蜂蜜和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物[2]中。L-PLA因其多種特殊生物活性，在醫(yī)藥、精細(xì)化工和生物合成等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，特別是作為一些抗高血壓、抗艾滋病病毒等重要合成藥物的手性中間體[3-4]。PLA用作動(dòng)物飼料添加劑能提高動(dòng)物免疫能力，是抗生素的有效替代物[5]。新型功能聚合物材料聚L-PLA[6]是非常具有應(yīng)用潛力的可生物降解材料[7]，有助于減少不可再生能源消耗和溫室氣體排放。近二十年來，國內(nèi)外研究表明，L-PLA對多種食源性致病菌具有抑制作用[1,8-9]，其穩(wěn)定性高，同時(shí)是苯丙氨酸代謝產(chǎn)物[10]，對人和動(dòng)物細(xì)胞無毒害作用[11]，在食品防腐方面也具有很大發(fā)展?jié)摿12-13]。而高光學(xué)純度的L-PLA的生產(chǎn)成本較高、產(chǎn)量較低[14]，是其廣泛應(yīng)用的限制因素。

圖1 輔因子再生偶聯(lián)體系催化PPAA合成L-PLLAA示意圖Fig. 1 Schematic illustration of L-PLA production from PPA with NADH regeneration system

L-乳酸脫氫酶（L-lactate dehydrogenase，L-LDH）是微生物立體特異性催化合成L-PLA的關(guān)鍵酶[15-16]，此反應(yīng)需要輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）[17]。由于微生物細(xì)胞內(nèi)自身L-LDH的表達(dá)受到嚴(yán)格代謝調(diào)控[18]，并且輔因子NADH不足也是L-PLA合成的關(guān)鍵限制因素（圖1）。葡萄糖/葡萄糖脫氫酶（g l u c o s e dehydrogenase，GDH）系統(tǒng)[19]因催化效率高、反應(yīng)不可逆、底物葡萄糖價(jià)格低廉而適用于微生物體內(nèi)NADH再生而應(yīng)用廣泛。光學(xué)純化合物制備方法主要有化學(xué)合成法、微生物合成法[20-21]和酶催化法[22-23]。其中微生物全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法[24]因其反應(yīng)條件溫和、操作安全、能耗低、底物轉(zhuǎn)化率高和光學(xué)特異性選擇性高等特點(diǎn)[25-26]而受到廣泛關(guān)注。因此，利用基因工程手段高效共表達(dá)L-LDH和GDH是促進(jìn)L-PLA持續(xù)合成的有效途徑。

本研究構(gòu)建一株共表達(dá)L-LDH和GDH的基因工程菌大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）/pETDuetldhL-gdh，此輔因子再生偶聯(lián)體系[27]具有全細(xì)胞轉(zhuǎn)化還原苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA）生產(chǎn)高光學(xué)純度L-PLA的能力，為進(jìn)一步提高微生物合成L-PLA的生產(chǎn)強(qiáng)度、光學(xué)純度和底物轉(zhuǎn)化率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

pMD19-T簡易載體購自寶生物工程（大連）有限公司；E. coli JM109、E. coli BL21（DE3）、pETDuet-1均為蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中添加100 μg/mL氨芐青霉素。

1.1.3 試劑

L-PLA、D-PLA、PPA 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（i s o p r o p y l-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、DNA聚合酶、DNA Marker、NADH、氨芐青霉素、質(zhì)粒小量提取及DNA片段膠純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 寶生物工程（大連）有限公司；B-PER細(xì)菌總蛋白提取試劑 美國Thermo公司；所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無特殊說明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000 Touch基因擴(kuò)增儀、DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳系統(tǒng)、Protein Ⅱ垂直電泳系統(tǒng)、Geltol EZ凝膠成像系統(tǒng)、X-Mark微孔板分光光度計(jì) 美國Bio-Rad公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；SC100水浴控制器 美國Thermo公司；CTO-20AC高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀日本島津公司；HZQ-F280恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分子克隆

表1 ldhL和gdh基因引物Table1 PCR primers for llddhhLL aanndd ggddhh geenneess

基因組DNA和質(zhì)粒DNA提取純化、DNA酶切、連接和轉(zhuǎn)化、感受態(tài)細(xì)胞制備均參照產(chǎn)品說明書。根據(jù)NCBI中已知的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）WSH-002 ldhL（NCBI參考序列：NC_017138.1）和gdh（GenBank：CP003017.1）基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

以B. megaterium Z2013513（CCTCC：M2013244）基因組DNA為模板，對ldhL和gdh基因分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR Buffer （含Mg2+） 5 μL、dNTP（10 mmol/L） 1 μL、Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL） 1 μL、基因組DNA模板2 μL、上下游引物（10 pmol）各2 μL、滅菌超純水37 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃ （ldhL）或58 ℃ （gdh）退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環(huán)25 次，最后72 ℃終延伸10 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小是否正確，進(jìn)行膠回收。目的基因片段與pMD19-T簡易載體用T4 DNA連接酶16 ℃條件下連接過夜，熱擊轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coli JM109中，復(fù)蘇1 h后涂平板，根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽性克隆。通過雙酶切鑒定后，獲得陽性克隆子E. coli JM109/pMD19-T-ldhL和E. coli JM109/pMD19-T-gdh，DNA測序驗(yàn)證。引物合成和DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-ldhL-gdh的構(gòu)建

將克隆載體pMD19-T-gdh經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖核酸電泳，膠回收獲得目的基因gdh，連接至經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-1雙克隆位點(diǎn)MCS2中，轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落PCR驗(yàn)證，獲得重組大腸桿菌BL21（DE3）/pETDuet-gdh。然后將克隆載體pMD19-T-ldhL經(jīng)BamHⅠ和PstⅠ雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳膠回收，獲得目的基因ldhL，連接至經(jīng)BamHⅠ和PstⅠ雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-1和pETDuet-gdh雙克隆位點(diǎn)MCS1中，轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落PCR驗(yàn)證，獲得E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh。

1.3.3 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL單菌落分別接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素），37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過夜。按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接入100 mL LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素）中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm為0.4～1.0，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，25 ℃條件下低溫誘導(dǎo)表達(dá)6 h。原始菌E. coli BL21（DE3）經(jīng)無抗生素培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后同樣進(jìn)行低溫誘導(dǎo)處理。以上3 種誘導(dǎo)后菌液離心、洗滌、稀釋處理參照文獻(xiàn)[28]，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析重組蛋白共表達(dá)情況[28]。

1.3.4 L-LDH和GDH比酶活力測定

取誘導(dǎo)后的菌液E. coli BL21（DE3）、E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuetldhL-gdh進(jìn)行離心洗滌后稀釋至OD600nm為1，取1 mL稀釋液離心收集菌體，加入500 μL B-PER裂解液，充分混勻后30 ℃振蕩10 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，取適量上清液進(jìn)行L-LDH和GDH比活力測定[29]。

由于NADH在340 nm波長處有最大吸收峰，通過反應(yīng)中光吸收峰值的改變定量測定酶活力。L-LDH酶活力測定參照文獻(xiàn)[28]。GDH酶活力測定體系（3 mL）：適量粗酶液5～30 μL，100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 8.0），2 mmol/L NAD＋和100 mmol/L葡萄糖。在30 ℃、pH 7.0條件下，每分鐘消耗或生成1 μmol/L NADH所需的酶量為1 個(gè)比酶活力單位（U/mL）。蛋白質(zhì)濃度測定采用Bradford法。比酶活力定義為：每毫克酶蛋白所含的酶活力單位（U/mg）。

1.3.5 重組E. coli全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA合成L-PLA

E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL經(jīng)菌體活化和誘導(dǎo)表達(dá)后，分別離心收集菌體并用磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，重懸于10 mL磷酸鈉緩沖液中，添加0.3 g/L葡萄糖和40 mmol/L PPA，于37℃、200 r/min條件下反應(yīng)，每20 min取500 μL轉(zhuǎn)化液于4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min，上清液進(jìn)行HPLC檢測產(chǎn)物L(fēng)-PLA和底物PPA濃度[30-31]。

1.3.6 HPLC分析方法

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液經(jīng)10 000 r/min離心5 min后，上清液與脫氣流動(dòng)相混合均勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測L-PLA物質(zhì)的量和光學(xué)純度。PPA和L-PLA定量檢測和手性分析條件參考文獻(xiàn)[28]。L-PLA光學(xué)純度檢測條件為：手性柱OJ-RH、流動(dòng)相乙腈-甲醇-三氟乙酸-去離子水（50∶50∶1.5∶900，V/V）、流速0.3 mL/min、柱溫30 ℃、檢測波長210 nm、進(jìn)樣量5 μL[32]。光學(xué)純度用對映體過量（enantionmeric excesses，ee）值表示，按公式（1）計(jì)算。

式中：nL-PLA、nD-PLA分別為L-PLA、D-PLA的物質(zhì)的量/mol。

1.3.7 PPA摩爾轉(zhuǎn)化率計(jì)算

PPA摩爾轉(zhuǎn)化率按公式（2）計(jì)算。

式中：nL-PLA、nPPA分別為L-PLA、PPA的物質(zhì)的量/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 ldhL和gdh基因克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2 2 ldhLldhL和gdhgdh基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖（A）和重組表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-Duet-ldhLldhL-gdhgdh雙酶切驗(yàn)證（B）BFig. 2 PCR-amplified products of ldhL and gdh (A) and double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pETDuetldhL-gdh (B)

以B. megaterium Z2013513基因組為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳和測序結(jié)果均表明，ldhL基因長度為957 bp，gdh基因長度為786 bp，與NCBI公布B. megaterium WSH-002序列大小相符，序列相似度99%（圖2A）。重組表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-ldhL-gdh經(jīng)雙酶切驗(yàn)證結(jié)果表明，gdh和ldhL均已成功連接（圖2B）。

2.2 ldhL和gdh誘導(dǎo)表達(dá)及酶活力測定

圖3 SDS-PAGE分析重組E. ccoollii L-LDH和GDH蛋白表達(dá)Fig. 3 SDS-PAGE analysis of L-LDH and GDH coexpression in recombinant E. coli

圖3 為SDS-PAGE電泳分析經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，E. coli BL21（DE3）、重組E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh中l(wèi)dhL和gdh基因的蛋白表達(dá)情況。與原始菌E. coli BL21（DE3）相比，E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh均在35～40 kD范圍內(nèi)有特異性條帶，且攜帶雙基因表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-ldhL-gdh中l(wèi)dhL的表達(dá)量明顯低于攜帶單基因表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-ldhL。E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh在25～29 kD范圍內(nèi)的特異性條帶與GDH蛋白分子質(zhì)量大小相符。SDS-PAGE結(jié)果表明E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh能成功轉(zhuǎn)錄并表達(dá)L-LDH和GDH蛋白。

表2 重組大腸桿菌中L-LDH和GDH比活力分析Table2 Specific activities off LL-LDH and GDH of recombinant strains U/mg

測定3 種菌株粗酶液中L-LDH和GDH比活力（表2），未檢測出重組菌株E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和原始菌株E. coli BL21（DE3）裂解上清液中GDH的比活力，而重組菌株E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh裂解上清液中L-LDH和GDH比活力分別為0.21 U/mg和6.53 U/mg，說明重組ldhL和gdh在大腸桿菌中成功表達(dá)且具有酶學(xué)活性。

2.3 輔因子再生偶聯(lián)體系轉(zhuǎn)化PPA合成L-PLA

圖4 E. ccoollii BL21（DDEE33）/pETDDuueett--llddhhLL-ggddhh和E. ccoollii BL21（DDEE33）/ pETDDuueett--llddhhLL轉(zhuǎn)化對比圖Fig. 4 Time course of L-PLA production by E. coli BL21(DE3)/ pETDuet-ldhL-gdh or E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明兩株重組菌E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuetldhL-gdh均能夠轉(zhuǎn)化PPA立體特異性合成L-PLA。E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL的L-LDH表達(dá)量較高，比酶活力約是E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh的L-LDH的2 倍（表2），但在轉(zhuǎn)化過程中，由于缺乏輔因子NADH，限制L-LDH的催化反應(yīng)，不利于L-PLA的合成。而E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh細(xì)胞中GDH不斷將葡萄糖催化生成葡萄糖酸，同時(shí)也伴隨著NAD＋轉(zhuǎn)化成輔酶NADH，保持菌體代謝中的輔酶平衡，才使得細(xì)胞內(nèi)足夠的輔因子促使L-LDH以較高的反應(yīng)速率催化PPA不對稱合成L-PLA。反應(yīng)40 min以后，因底物消耗殆盡而反應(yīng)速率降低。相比E. coli BL21（DE3）/pETDuetldhL，E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh轉(zhuǎn)化L-PLA為24.26 mmol/L，提高18.92%；底物PPA摩爾轉(zhuǎn)化率為59.55%，提高17.42%（圖4）。

圖5 HPLCC分析E. ccoollii BL21（DDEE33）/pETDDuueett--llddhhLL-ggddhh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)-PLA光學(xué)純度Fig. 5 HPLC analysis of L-PLA production by whole cells of E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh

由圖5可知，HPLC手性分析結(jié)果表明此輔因子再生偶聯(lián)體系不對稱還原PPA合成的L-PLA光學(xué)純度高達(dá)99%。雖然此輔因子再生體系的誘導(dǎo)表達(dá)和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件需要進(jìn)一步優(yōu)化以提高L-PLA產(chǎn)量和底物摩爾轉(zhuǎn)化率，但是其立體特異性選擇有助于合成光學(xué)純L-PLA，為其在醫(yī)學(xué)和食品行業(yè)中廣泛應(yīng)用提供參考依據(jù)。

3 結(jié) 論

輔因子再生對于生物體內(nèi)大多數(shù)氧化還原反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行具有重要的意義，既避免在反應(yīng)過程中外部添加昂貴的輔因子，又緩解細(xì)胞內(nèi)輔因子水平的限制，提高氧化還原反應(yīng)催化效率。菌株Rubrivivax benzoatilyticus JA2[14]轉(zhuǎn)化1 mmol/L苯丙氨酸合成0.92 mmol/L L-PLA。篩選自土壤的假單胞菌菌株P(guān)seudomonas sp.BC-18能將2-羥基-3-苯基丙腈轉(zhuǎn)化得光學(xué)純度為75%的L-PLA[32]。本研究設(shè)計(jì)了輔因子NADH再生途徑，通過引入gdh和ldhL，底物葡萄糖不僅為細(xì)胞提供能量，也實(shí)現(xiàn)NAD/NADH在細(xì)胞內(nèi)的平衡，促進(jìn)L-PLA的大量積累。同時(shí)，良好的光學(xué)純度是L-PLA合成重要手性藥物的前提。此微生物全細(xì)胞一步轉(zhuǎn)化法條件溫和、工藝簡單，為L-PLA工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

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Production of Optically Pure L-Phenyllactic Acid by Using Whole Cells of Recombinant Escherichia coli

ZHU Yibo1, LU Rubin1, CHENG Jun1, WANG Ying1,2, QI Bin1, WANG Limei1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Suzhou 215500, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The L-lactate dehydrogenase gene (ldhL) and glucose dehydrogenase gene (gdh) were respectively amplified from Bacillus megaterium Z2013513 by PCR and inserted into the plasmid pETDuet-1 to construct the recombinant vector pETDuet-ldhL-gdh. Then, the vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) to obtain the recombinant strain E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and enzymatic activity analysis showed that both ldhL and gdh were successfully co-expressed with biological functions in the recombinant strain. Using whole cells of recombinant E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh, 24.26 mmol/L L-phenyllactic acid was obtained from phenylpyruvic acid at 37 ℃ and 200 r/min after 60 min transformation. The product enantiomeric excess percent was over 99% with substrate molar conversion rate of 59.55%. The results showed the cofactor regeneration biotransformation system was capable of eff ciently producing optically pure L-phenyllactic acid.

L-2-hydroxyl-3-phenylpropionic acid; Bacillus megaterium Z2013513; L-lactate dehydrogenase; glucose dehydrogenase; NADH regeneration; whole-cell catalysis

10.7506/spkx1002-6630-201702010

TS201.2

A

1002-6630（2017）02-0059-06

朱益波, 魯如彬, 程俊, 等. 重組大腸桿菌合成光學(xué)純L-苯基乳酸[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 59-64. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702010. http://www.spkx.net.cn

ZHU Yibo, LU Rubin, CHENG Jun, et al. Production of optically pure L-phenyllactic acid by using whole cells of recombinant Escherichia coli[J]. Food Science, 2017, 38(2): 59-64. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702010. http://www.spkx.net.cn

2016-03-26

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31501459）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31470092）；江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)青年基金）項(xiàng)目（BK20130380）；常熟市科技計(jì)劃項(xiàng)目（CN201412）

朱益波（1980—），男，博士，研究方向?yàn)槲⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：centuryrain@126.com

*通信作者：王立梅（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wlmqb@126.com