齊斌，周丹

為了初步觀察開導加補益針刺治療對單眼形覺剝奪性弱視大鼠的治療作用，本實驗采用閃光視覺誘發(fā)電位（flash visual evoked potential,F-VEP）及尼氏染色的方法觀察了其對弱視大鼠視覺電生理及視皮層神經元形態(tài)學的影響，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)、模型建立與分組

出生14 d后的清潔級健康Wistar大鼠36只（購自吉林大學實驗動物中心，排除內外眼疾?。?，體質量28～30 g，雌雄不限，隨機進行分組，每組6只，動物房內室溫設置為：18～25℃，相對濕度為：40%～70%。12 h循環(huán)晝夜光照。出生14 d Wistar大鼠左右不限，進行隨機單眼瞼縫合手術，建立單眼形覺剝奪動物模型。大鼠眼瞼縫合7 d后進行治療針刺治療每日1次，共針刺7 d。

分組：（1）正常對照組：健康Wistar大鼠6只，自然光線環(huán)境下飼養(yǎng)，不給予任何處理。（2）陰性對照組（單眼形覺剝奪組）：在確定弱視模型建立成功后不給予任何治療。（3）陽性對照組：在大鼠眼瞼縫合7 d后灌胃給予左旋多巴（20 mg/kg）。（4）開導針刺組：于大鼠太陽穴、上星穴給予針刺治療，捻轉角度大，用力重，頻率快，5 s后隨勢將針緩緩提至皮下，靜留片刻，然后出針。（5）補益針刺組：脾俞穴、腎俞穴直刺0.6 cm，手法是捻轉角度小，用力輕，頻率慢，留置10 min起針，用棉球按壓片刻；攢竹透睛明，從攢竹穴進針后，針體向睛明方向斜刺，不捻轉不提插，靜留片刻，然后出針。（6）開導補益針刺組：開導穴太陽穴、上星穴針刺手法同開導針刺組。開導穴出針再進行補益穴針刺，選取的穴位及手法同補益針刺組。

大鼠單眼縫合及治療期間有死亡情況發(fā)生，故進行結果檢測時每組取5只進行各項指標檢查。

1.2 大鼠閃光視覺誘發(fā)電位的檢測

剪開形覺剝奪幼鼠的縫合眼，并隨即將所有大鼠放置于暗室內進行適應。應用復方托吡卡胺滴眼液（美多麗）點雙眼散大瞳孔，暗適應30 min。幼鼠稱量體質量，用4%水合氯醛按1 ml/100 g的比例腹腔注射，使大鼠全身麻醉。將幼鼠固定在實驗臺上，黑色眼罩遮擋對側眼，充分暴露檢側眼。剔除電極所置部位體表毛發(fā)。記錄電極置于幼鼠雙耳前緣連線中點，參考電極置于鼻部，接地電極位于尾部皮下，記錄電極、參考電極和接地電極都由不銹鋼針制成單眼記錄[1]。幼鼠眼睛距離閃光刺激源10 cm，共測量3次，每次間隔5 min，取測量平均值。

視覺電生理系統(tǒng)TEC-350參數(shù)設定：放大增益20K，高通濾波 0.1 Hz，低通濾波 75 Hz，刺激頻率 1 Hz，疊加次次 13次，閃光強度 3.32 nt·s，單通道檢測，全視野刺激器。

觀測指標：閃光視覺誘發(fā)電位P2波的振幅(μV)以及潛伏期(ms)。

1.3 石蠟包埋切片及組織染色

各組實驗大鼠均進行心臟灌注固定：每組5只，共30只生后28 d的實驗大鼠，用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g體質量進行麻醉，開胸，剪開右心室，用灌注頭穿刺至升主動脈內，快速灌注250 mL生理鹽水沖洗心血管系統(tǒng)，待右心耳流出清亮液體后，再快速灌注預冷的固定液 （4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液，pH 7.2～7.4）250 mL，再慢灌注，灌注完成后斷頭，開顱，迅速取出大腦，按照《大鼠腦立體定位圖譜》切取大鼠視皮層的腦組織，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定24～48 h。

將固定好的組織樣品從4℃取出，用自來水沖洗過夜，用PBS沖洗30 min，進行乙醇梯度脫水，分別用50%、70%及85%乙醇各脫水30 min，95%乙醇I（100min），95%乙醇 II（30min），100%乙醇 I（100min），100%乙醇 II（30 min）；二甲苯透明（二甲苯 I，30 min，二甲苯 II至透明），浸蠟（60 ℃烤箱，石蠟 I、II、III各60 min），OCT包埋，制成蠟塊，隨后將蠟塊切成6 μm厚，切片分別貼在常規(guī)載玻片和多聚賴氨酸處理過的載玻片上，放于烤箱上烤片12～24 h，2張進行HE染色，2張進行尼氏染色，2張免疫組化染色處理。

1.4 尼氏染色步驟

脫蠟（二甲苯I 5 min，二甲苯II 5min）；乙醇梯度脫水（100%乙醇I 10 min，100%乙醇II 8 min，95%乙醇 5 min，90%乙醇 3 min，80%乙醇 2 min）； 蒸餾水清洗三次，每次2 min；1%焦油紫溶液染色20 min，蒸餾水清洗三次，乙醇梯度脫水（75%乙醇1 min，95%乙醇5min，100%乙醇I10min，100%乙醇I10min）；二甲苯透明 （二甲苯I、II個30 min）；中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，照相，并對經過染色后的視野內的大鼠視皮質層神經元數(shù)量進行計數(shù)，取三次的平均值計算。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，計量資料以xˉ±s表示，同一指標組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用Duncan法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 各實驗組大鼠形覺剝奪眼及正常眼F-VEP檢測結果（n=5）

2 結果

2.1 閃光視覺誘發(fā)電位

陰性對照組P2波振幅較正常對照組明顯降低（P＜0.05），潛伏期較正常對照組明顯延長（P＜0.05），陽性對照組、開導針刺組、補益針刺組及開導加補益針刺組的P2波振幅、潛伏期均明顯好于陰性對照組，其中開導加補益針刺組的波形指標最好，其P2波振幅及潛伏期好于陽性對照組（P＜0.05）并與正常對照組接近（P＞0.05）（表 1）。

2.2 尼氏染色結果

尼氏染色后各組大鼠視皮質神經元呈空泡狀，尼氏小體呈現(xiàn)深藍色，細胞核呈淡藍色（圖1）。陰性對照組視皮層神經元數(shù)量較正常組明顯減少 （P＜0.05），陽性對照組視皮層神經元數(shù)量較陰性對照組明顯增加 （P＜0.05）， 與正常對照組接近 （P＞0.05）；開導針刺組和補益針刺組視皮層神經元數(shù)量較陰性對照組明顯增加（P＜0.05），但低于陽性對照組（P＜0.05）；而開導加補益針刺組視皮層神經元數(shù)量明顯多于陰性對照組（P＜0.05），與正常對照組和陽性治療組無明顯差別 （P＞0.05）（圖2）。說明開導針刺組和補益針刺組對單眼形覺剝奪弱視具有治療作用，而開導加補益針刺組的治療作用更明顯，并與陽性藥物左旋多巴效果相當。

圖2 各組大鼠視皮質層神經元數(shù)量 a∶與正常組比較，P＜0.05；b∶與陰性對照組比較，P＜0.05；c∶與陽性對照組比較， P＜0.05（n=5）

圖1 各組大鼠視皮質尼氏染色（光鏡，×200）A：正常對照組，可見視皮質神經元大小一致，有明顯的胞漿突起；B：陰性對照組，視皮質層神經元數(shù)量較正常組明顯減少；C：陽性對照組，視皮質層神經元數(shù)量較陰性對照組明顯增加；D：開導針刺組，E：補益針刺組，D及E組視皮質層神經元數(shù)量較陰性對照組明顯增加，但低于陽性對照組；F：開導加補益組神經元數(shù)量與正常對照組和陽性對照組無明顯差別

3 討論

古代中醫(yī)對弱視的論述，散見于“小兒通睛癥”“能遠怯近”“遠視”“小兒青盲”中。其中，形覺剝奪性弱視歸屬于“小兒青盲”?！夺t(yī)宗金鑒》謂“青盲，因胎受風邪，生后瞳仁端好，黑白分明，唯視物不見”?！洱埬菊摗吩弧靶呵嗝?，此眼初患之時，是腹中受驚邪之氣，今生后五、七歲以來便多患眼”。根據《醫(yī)宗金鑒》與《龍木論》所云，先天發(fā)育不良應為胎中受邪所致?？梢姡静〉牟∫虿C為：先天稟賦不足（胎中受邪的先天發(fā)育不良），元陽不足，神光發(fā)越無能或陰陽俱虛而致精血虧損，不能上榮于目。根據歷代醫(yī)家的認識，形覺剝奪性弱視病因病機有虛有郁，符合開導補益的治療原則?！伴_導之后宜補論”源于明代傅仁宇的《審視瑤函》，傅仁宇在該篇中指出：“夫目之有血，為養(yǎng)目之源，充和則有發(fā)生長養(yǎng)之功，而目不病，少有虧滯，目病生矣?！敝赋鲅獮轲B(yǎng)目之源，血虧則目失濡養(yǎng)，血瘀則目病，描述了血和眼的密切關系。本課題組在多年臨床研究的基礎上，結合兒童弱視的發(fā)病機制的特點，提出了基于“開導之后宜補論”，即采用開導補益的針刺方法治療弱視，開導加補益組針刺取穴為雙側取穴，開導穴為太陽、上星；補益穴采用肝俞、脾俞、攢竹透晴明。對照組采用補益方法即單純應用補益穴治療，記錄視力、視覺誘發(fā)電位的變化以及治療時間進行療效對比，結果顯示，以“開導之后宜補論”為理論基礎，針刺治療弱視的總有效率為100%，而補益治療組的總有效率為75%，臨床研究結果證明，采用“開導之后宜補論”針刺治療方法能夠明顯改善患者的視力、視覺誘發(fā)電位振幅和潛伏期，且治療效果優(yōu)于補益治療法[2]。

有研究表明，針刺防治弱視可能與以下幾方面相關：保護視網膜神經節(jié)細胞、糾正視網膜功能及改善視網膜的血液供應、增強視覺神經細胞生物電活動、調節(jié)視環(huán)境紊亂、改善視神經傳導、激活視覺皮質相應區(qū)域[3]、影響神經元營養(yǎng)因子及其受體的合成和分泌[4]。雖然針灸治療弱視的臨床研究資料較多，并且大多顯示了良好的治療效果，但是目前針對針灸治療弱視的作用機理還有待深入研究與探討。

本研究采用單眼形覺剝奪誘導弱視的動物模型，研究基于“開導之后宜補論”針刺療法治療弱視的作用機理，并同時比較其與左旋多巴胺、開導針刺及補益針刺治療單眼形覺剝奪弱視的效果。有研究顯示，大鼠的視覺可塑性關鍵期是從出生后14 d睜眼開始，至出生后45 d結束[5]。故本研究采用了大鼠出生14 d后進行單眼瞼縫合手術，建立了大鼠單眼形覺剝奪誘導弱視的動物模型并觀察左旋多巴胺治療弱視及開導針刺、補益針刺及開導加補益針刺治療的作用。視覺誘發(fā)電位是大腦皮質枕葉區(qū)對視刺激發(fā)生的電反應，代表視網膜接受刺激經視路傳導至枕葉皮層而引起的電位變化。本研究通過F-VEP對接受不同干預的形覺剝奪性弱視幼鼠以及正常發(fā)育幼鼠的整個視覺通路功能完整性進行了檢測。結果表明，與正常組大鼠相比，陰性對照組大鼠剝奪眼F-VEP的波幅明顯降低，潛伏期明顯延長，而正常眼未受影響。各治療組間進行比較，開導加補益針刺治療組明顯優(yōu)于左旋多巴治療組、開導治療組和補益治療組。說明開導加補益治療對單眼形覺剝奪誘導的弱視具有顯著的治療效果，可能改善了視覺通路功能的完整性。

形態(tài)學觀察是弱視研究的熱點內容，故本實驗采用尼氏染色觀察視皮層神經元形態(tài)的改變。結果提示，開導針刺組和補益針刺組對單眼形覺剝奪弱視視皮層的形態(tài)具有一定的改善作用，而開導加補益針刺組的作用優(yōu)于開導組和補益組，并與陽性藥物左旋多巴的效果相當。

綜上，開導針刺、補益針刺和開導加補益針刺治療對單眼形覺剝奪性弱視大鼠F-VEP波形及神經元損傷具有明顯的改善作用，但開導加補益針刺組的作用優(yōu)于開導組和補益組。