年齡相關(guān)性白內(nèi)障合并糖尿病晶狀體前囊膜MMP- 2、TIMP- 2、ⅣC 和LN 的表達(dá)

褚俏梅周茜曹西友李方都

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-2( MMP-2) 、基質(zhì)金屬蛋白酶-2 組織抑制因子( TIMP-2) 和Ⅳ膠原纖維( ⅣC) 、層粘蛋白( LN) 在合并糖尿病和非糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜的表達(dá)及意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)測定30 例年齡相關(guān)性白內(nèi)障合并糖尿病患者( 試驗(yàn)組) 和30 例非糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者( 對照組) 晶狀體前囊膜中MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN 的表達(dá)，并比較其差異。結(jié)果MMP-2 在試驗(yàn)組白內(nèi)障晶狀體前囊膜中多呈高表達(dá)，陽性率為90. 3%，對照組MMP-2 表達(dá)陽性率為0. 0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) ;而試驗(yàn)組和對照組晶狀體前囊膜中TIMP-2、ⅣC 和LN 均呈高表達(dá)( 陽性率分別為80. 0% 和73. 3%，96. 7% 和100. 0%，96. 7%和100. 0%) ，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>/span><0.05) 。試驗(yàn)組晶狀體前囊膜TIMP-2 與LN 的表達(dá)之間成正相關(guān)( r = 0. 371，P<0.05) 。結(jié)論合并糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜中MMP-2 與TIMP-2 表達(dá)嚴(yán)重失衡，認(rèn)為這種失衡在合并糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要的作用。

年齡相關(guān)性白內(nèi)障; 2 型糖尿病; 晶狀體前囊膜: 基質(zhì)金屬蛋白酶-2; 組織抑制因子; IV 膠原纖維:層粘蛋白

糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制是機(jī)體內(nèi)外各種因素對晶狀體長期綜合作用的結(jié)果，雖然糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制、發(fā)生過程與非糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障有所不同，但發(fā)現(xiàn)其兩者病理表現(xiàn)極為相似。年齡相關(guān)性白內(nèi)障當(dāng)長期伴有糖尿病時，發(fā)病機(jī)制可能更加復(fù)雜。晶狀體前囊膜中基質(zhì)金屬蛋白酶等成分的改變?yōu)榘變?nèi)障主要的病理異常。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測30 例年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者和30 例合并2 型糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinase2，MMP-2) 、基質(zhì)金屬蛋白酶2 組織抑制因子( tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2，TIMP-2) 和IV 膠原纖維( collageen IV，IVC) 、層粘蛋白( laminin，LN) 的表達(dá)情況，旨在探究不同基質(zhì)成分及其之間表達(dá)的的相關(guān)性以及在兩種不同白內(nèi)障中表達(dá)的臨床意義。

資料與方法

一、 對象

隨機(jī)收集我院2013年4月至2014年4月進(jìn)行手術(shù)的白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜60例(60只眼)。試驗(yàn)組為合并2型糖尿病( 病史5年以上) 的年齡相關(guān)性白內(nèi)障30例(30只眼)，其中男性7例(7只眼)，女性23例(23只眼)，年齡55～ 88歲，平均年齡72.5歲。對照組為未合并糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者30例(30只眼)，其中男性10例(10只眼)，女性20例(20只眼)，年齡50～90歲，平均年齡71.1歲。排除嚴(yán)重心腦疾病。

術(shù)前排除青光眼、視網(wǎng)膜脫離、葡萄膜炎、眼外傷及內(nèi)眼手術(shù)史。糖尿病患者術(shù)前血糖均穩(wěn)定在8. 0 mmoL /L 以下，年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者術(shù)前血糖為4.3 ～ 6.1 mmol /L，平均(5.2 ± 0.9) mmol /L。全身檢查血常規(guī)、凝血功能、肝腎功能、心電圖、胸片均無手術(shù)禁忌癥。

二、方法

本研究所有患者手術(shù)前均被告知手術(shù)風(fēng)險并簽署知情同意書，手術(shù)均由同一名醫(yī)師完成。嚴(yán)格按照內(nèi)眼手術(shù)操作標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)消毒鋪無菌巾、表面麻醉下沖洗結(jié)膜囊，予2%利多卡因及等量0.75%布比卡因混合液3～5 ml行球后、球周及結(jié)膜下注射。

1.標(biāo)本采集:60例白內(nèi)障患者均行單眼白內(nèi)障超聲乳化術(shù)。術(shù)中前房注入粘彈劑，連續(xù)環(huán)形撕囊，直徑6mm，將撕取的晶狀體前囊膜置EP小管內(nèi)，放－42℃冰箱保存待測。

2.試劑: MMP-2、TIMP-2 、ⅣC 和LN鼠抗人單克隆抗體、SP二抗試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺( DAB)顯色劑均購自Dako 生物技術(shù)( 上海) 有限公司。

3.免疫組織化學(xué)染色: 取出冷凍的前囊膜，室溫下復(fù)溫后，立即置入4%多聚甲醛液中，4℃冰箱固定12h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，貼附于經(jīng)APES浸泡并用多聚賴氨酸處理過的載玻片上，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。SP免疫組化染色方法: 將石蠟標(biāo)本制成2～3μm 的切片，切片脫蠟至水，3 % H2O2去離子水，37℃溫箱30min去除內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)，二抗同源血清封閉。一抗?jié)窈兄? ℃冰 箱過夜，二抗37 ℃溫箱30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。PBS 代替一抗為陰性對照，陽性對照切片為上海Dako生物技術(shù)( 上海) 有限公司的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。其余切片分別行MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN 染色。

4.結(jié)果判定: 晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃的染色顆粒為陽性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無棕黃色顆粒為陰性細(xì)胞。400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個視野，判讀陽性細(xì)胞的百分比，定性分析MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN 染色分布。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

計數(shù)資料用陽性例數(shù)和陽性率表達(dá)，數(shù)據(jù)組間率的比較用χ2 檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、試驗(yàn)組和對照組晶狀體前囊膜中MMP-2染色見圖1A、B; 試驗(yàn)組和對照組晶體前囊膜中TIMP-2染色見圖1C、D。

圖1

① 試驗(yàn)組晶體前囊上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，示MMP－2陽性表達(dá); ② 對照組晶體前囊上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見棕黃色顆粒，示MMP－2陰性表達(dá); ③ 試驗(yàn)組晶體前囊上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，示TIMP－2的陽性表達(dá); ④ 對照組晶體前囊上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，示TIMP－2的陽性表達(dá)。( SP × 400)

表1 兩組晶狀體前囊膜中MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN陽性表達(dá)的分布情況陽性表達(dá)率%( 陽性例數(shù)/總例數(shù))

二、表1 顯示，試驗(yàn)組患者晶狀體前囊膜中MMP-2 的陽性表達(dá)率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) ，TIMP-2 的陽性表達(dá)率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>/span><0.05) ; 試驗(yàn)組中ⅣC、LN 的陽性表達(dá)率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>/span><0.05) 。

三、表2 顯示，試驗(yàn)組晶狀體前囊膜中，MMP-2、TIMP-2、ⅣC、LN 陽性表達(dá)核性白內(nèi)障多于后囊下性; 對照組除MMP-2 全部陰性外，TIMP-2、ⅣC 和LN 陽性表達(dá)核性多于后囊下性。試驗(yàn)組晶狀體前囊膜中MMP-2 的陽性表達(dá)率高于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義( χ2 = 52. 500，P = 0.000) 。兩組間晶狀體前囊膜中TIMP-2、ⅣC、LN 的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 年齡相關(guān)性白內(nèi)障分型晶體前囊膜MMP-2、TIMP-2、ⅣC 和LN 陽性表達(dá)

四、經(jīng)Spearman 等級相關(guān)分析，晶狀體前囊膜中MMP-2、TIMP-2、ⅣC、LN 陽性表達(dá)率之間均無相關(guān)性。試驗(yàn)組中晶狀體前囊膜中TIMP-2 與LN 的表達(dá)之間成正相關(guān)( r = 0. 371，P<0.05) 。MMP-2與TIMP-2、ⅣC、LN 以及ⅣC 與LN 的表達(dá)之間相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>/span><0.05) 。

討 論

糖尿病性白內(nèi)障的誘因比較清晰，而年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全明確，多認(rèn)為與年齡老化、紫外線長期過度照射、遺傳因素、營養(yǎng)不良等有關(guān)。雖然糖尿病性和年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)表的機(jī)制有所不同，但其晶狀體上皮細(xì)胞( LEC) 的病理性改變比較相似，均被證實(shí)有基質(zhì)成分發(fā)生變化，且白內(nèi)障的發(fā)生均與晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，糖尿病性白內(nèi)障超微結(jié)構(gòu)的細(xì)胞凋亡改變更加嚴(yán)重[1]。有研究觀察發(fā)現(xiàn): 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及受體在糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)高于年齡相關(guān)性白內(nèi)障，說明糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病與其密切相關(guān)[2]。高糖對糖尿病微血管ECMs成分的影響明顯，因此年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者一旦伴有嚴(yán)重的糖尿病，在高糖的環(huán)境下，晶狀體上皮細(xì)胞的損傷機(jī)制將更加復(fù)雜。

白內(nèi)障患者晶狀體囊膜細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)以ⅣC、LN 表達(dá)為主，并在白內(nèi)障術(shù)后晶狀體上皮細(xì)胞的移行、增殖中發(fā)揮作用。更多的臨床資料顯示，ⅣC、LN 也與后發(fā)性白內(nèi)障與晶狀體上皮的移行有關(guān)，且伴有糖尿病的患者后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病率更高。故了解晶狀體上皮細(xì)胞的病理機(jī)制對指導(dǎo)治療更有其臨床意義。研究表明，后囊下性白內(nèi)障是與細(xì)胞外基質(zhì)異常有關(guān)的疾病[3]。本文研究顯示，無論是否合并糖尿病晶狀體囊膜細(xì)胞ⅣC、LN均為高表達(dá)。

MMP-2 是降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的一類重要酶類，在細(xì)胞遷移分化和組織修復(fù)重建中均發(fā)揮重要作用，TIMP-2 是MMP-2 的特異性抑制物，細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定主要依賴于MMP 與TIMP 間的動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。在體內(nèi)，MMP-2 及其TIMP-2 共同調(diào)節(jié)Ⅳ型膠原和LECs 的增殖[4]。ⅣC 和LN 分別是MMP-2 和MMP-9 的特異性底物，故研究顯示，MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1 在所有年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞均呈陽性表達(dá)，認(rèn)為這些基質(zhì)金屬蛋白酶和組織抑制劑參與了年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病[5-7]。當(dāng)TIMP-2 高表達(dá)而MMP-2 的低表達(dá)時，說明TIMP-2 通過與其羧基端結(jié)合形成高親合力的復(fù)合物來抑制MMP-2 的活性[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合并糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜細(xì)胞MMP-2 與TIMP-2 均呈高表達(dá)，且TIMP-2 與LN 表達(dá)又呈正相關(guān)，而未合并糖尿病時其MMP-2 與TIMP-2、ⅣC、LN 表達(dá)為負(fù)相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)，在60 例年齡相關(guān)性白內(nèi)障分型中，核性多于后囊下性，與國內(nèi)相關(guān)報道相符[9]。研究顯示，未合并糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜MMP-2 幾乎不表達(dá)，而無論是否合并糖尿病其晶狀體前囊膜細(xì)胞TIMP-1、ⅣC、LN 均有表達(dá)，分析認(rèn)為，MMP-2 的表達(dá)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障被明顯抑制，此與TIMP-2 功能增強(qiáng)有關(guān)。MMP-2 對細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的ⅣC、LN 的降解可能會降低，使MMP /TIMP 調(diào)節(jié)達(dá)到動態(tài)平衡。而合并糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障呈現(xiàn)MMP-2 和TIMP-2 均高表達(dá)，說明MMP /TIMP 的調(diào)節(jié)動態(tài)失衡，或許其失衡與高糖環(huán)境中的酶和蛋白的破壞有關(guān)。兩組間的差異雖然不能肯定就是合并糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病的主要機(jī)制，且MMP /TIMP 與晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體的相關(guān)性也還有待與進(jìn)一步研究，但本研究結(jié)果對揭示合并有糖尿病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障更易發(fā)生后發(fā)性白內(nèi)障的機(jī)制[9]有一定價值。

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ExpressionofMMP-2，TIMP-2，ⅣCandLNorintheanteriorcapsuleofthelensofaged-relatedcataractpatientswithdiabetes

ChuQiaomei,CaoXiyou,ZhonQian,LiFangdu.

DepartmentofOphthalmology；DepartmentofPathology；DepartmentofNuclearMedicine,ShanghaiLiqunHospital,PutuoDistrict,Shanghai200333,China

ObjectiveObjective To investigate the expression and role of matrix metalloproteinase 2 ( MMP-2) ，tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2 ( TIMP-2) and collagen IV ( ⅣC) and laminin ( LN) in lens anterior capsuleof aged － related cataract with and without type 2 diabetic．MethodsThe expressions of MMP-2，TIMP-2，ⅣC and LNwere detected by immunohistochemistry in 30 cases of aged-related cataract with diabetic ( experimental group) and 30 caseswithout diabetic ( control group) and results were compared between the two groups． Results Positive strong expressionof MMP-2 was found in lens anterior capsule of the experimental group，and rate was 90. 3%，compared to the controlgroup in which the expression of MMP-2 positive rate was 0. 0% (P<0.01) ． In experimental and control groups，expressionsof TIMP-2，IV-C and LN ( positive rate) was 80. 0% vs． 73. 3%，96. 7% vs． 100. 0%，and 96. 7% vs． 100. 0%，respectively． There was no statistically significant difference (P<0.05) ． In the experimental group，the expression ofTIMP-2 was positively correlated with the expression of LN ( r = 0. 371，P<0.05) ． Conclusions The expression ofMMP-2 and TIMP-2 in lens anterior capsule of aged － related cataract with diabetes is seriously unbalanced，which is believedto play an important role in the occurrence and development of aged-related cataract with diabetic.

Aged － related cataract; Type 2 diabetes mellitus; Anterior capsule of the lens; Matrix metalloprotein-ase 2; Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2; laminin

[JClinOphthalmol,2017,25:389]

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.05.002

200333 上海，普陀區(qū)利群醫(yī)院眼科( 褚俏梅，曹西友) ，病理科( 周茜) ，核醫(yī)學(xué)科( 李方都)

曹西友( E-mail: lfd_915@ sina.com)

[臨床眼科雜志，2017，25：389]

(收稿：2017-03-22)