謝娜

（泰安市岱岳區(qū)林業(yè)局，山東泰安271000）

除草劑生物測(cè)定方法及操作方法

謝娜

（泰安市岱岳區(qū)林業(yè)局，山東泰安271000）

本文簡(jiǎn)要介紹了除草劑生物測(cè)定方法，著重介紹組織或器官水平測(cè)定、整株水平測(cè)定、酶水平測(cè)定、細(xì)胞或細(xì)胞器水平測(cè)定4種方法，并就生物測(cè)定供試生物選擇、除草劑濃度設(shè)置和施藥方法進(jìn)行概述。

除草劑；生物測(cè)定方法；操作方法

生物測(cè)定技術(shù)是除草劑研究的一項(xiàng)基本工作，是除草劑活性測(cè)定、安全性檢測(cè)以及殘留診斷的常用方法，特別是在除草劑新品的研制開發(fā)中發(fā)揮著不可替代的作用，也是高通量篩選中必不可少的手段之一[1]。

1 除草劑生物測(cè)定方法

除草劑生物測(cè)定的主要方法有：點(diǎn)滴法、小杯法或培養(yǎng)皿法、浮萍法、玉米幼苗法、黃瓜幼苗法、燕麥幼苗法、蘿卜子葉法、番茄水培法、稗草胚軸法等[2]。除草劑具有控制生長(zhǎng)激素的分泌，干擾蛋白質(zhì)、葉綠素、脂類等的生物合成，抑制光合作用、細(xì)胞分裂、呼吸作用等多種作用方式，利用生物活體作為靶標(biāo)是生物測(cè)定中的一種常規(guī)選擇，生物測(cè)定中靶標(biāo)生物的生長(zhǎng)發(fā)育情況、生理生化指標(biāo)以及形態(tài)特征的變化可作為除草劑生物活性的判定依據(jù)。另外，在進(jìn)行除草劑生物測(cè)定時(shí)，除草劑的不同作用方式?jīng)Q定了靶標(biāo)生物和測(cè)定方法的選擇。

1.1 組織或器官水平測(cè)定

組織或器官水平測(cè)定常用的有葉片、種子、根尖等，一般在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選用種子作為生物測(cè)定的供試材料時(shí)，通常采用小杯法或培養(yǎng)皿法。培養(yǎng)皿法的培養(yǎng)介質(zhì)一般是常規(guī)自來(lái)水，在培養(yǎng)皿內(nèi)墊上兩層濾紙，把一定數(shù)量的種子均勻地鋪在濾紙上，提前把需要測(cè)定的除草劑按事先設(shè)定好的濃度梯度進(jìn)行稀釋，再用移液槍將不同濃度梯度的除草劑加入培養(yǎng)皿，放入培養(yǎng)箱，設(shè)定好適宜的溫度和濕度，進(jìn)行培養(yǎng)。小杯法可以采用滅菌、過(guò)篩的沙子，均勻地將細(xì)沙填充到小杯的固定位置，把一定數(shù)量的種子均勻鋪設(shè)到沙子上，再覆蓋上厚度基本一致的細(xì)沙?？梢杂玫厣现仓牾r重、株高或主根長(zhǎng)作為測(cè)量指標(biāo)，具體采用哪項(xiàng)指標(biāo)應(yīng)依據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定，但是選定的指標(biāo)應(yīng)具備穩(wěn)定性好、相關(guān)性好以及容易測(cè)量的特點(diǎn)。以主根長(zhǎng)生測(cè)法應(yīng)用最為廣泛。例如采用油菜或玉米主根長(zhǎng)生測(cè)法測(cè)定磺酰脲類除草劑殘留活性[3,4]。在選用種子作為生測(cè)材料時(shí),供試的種子一定是近一年或兩年的，必須進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保種子發(fā)芽率高、發(fā)芽勢(shì)穩(wěn)定，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。

1.2 整株水平測(cè)定

采用整株植物測(cè)定除草劑的活性，通常是在溫室進(jìn)行。用不同規(guī)格的花盆或培養(yǎng)皿等培養(yǎng)供試植物，然后根據(jù)試驗(yàn)預(yù)設(shè)，把供試除草劑按一定濃度梯度進(jìn)行稀釋，用噴霧法對(duì)供試植物進(jìn)行處理，根據(jù)除草劑特性，待除草劑作用癥狀明顯后分兩次進(jìn)行觀察、測(cè)量、記錄、評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)的指標(biāo)為株高、鮮重、死亡率等，還可對(duì)植物受害癥狀進(jìn)行分級(jí)，再計(jì)算綜合藥害指數(shù)[5]。根據(jù)供試植物出現(xiàn)的除草劑作用的顯著癥狀進(jìn)行等級(jí)劃分，從無(wú)明顯癥狀到癥狀最明顯可分為5~7級(jí)，然后對(duì)每一個(gè)培養(yǎng)皿或花盆中供試植物的除草劑作用癥狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄，計(jì)算藥害綜合指數(shù)，最后依據(jù)藥害綜合指數(shù)判定除草劑活性。

藥害綜合指數(shù)（%）=[（每皿或每盆各受害級(jí)別株數(shù)×級(jí)別）/（每皿或每盆株數(shù)×最高級(jí)別）]×100。

也可以用鮮/干重抑制率來(lái)進(jìn)行等級(jí)劃分，唐慶紅等人研究油菜田新型除草劑丙酯草醚的殺草譜，對(duì)20種供試雜草根據(jù)其對(duì)丙酯草醚反應(yīng)程度進(jìn)行劃分，分成了五類，分別為很敏感（防效大于90%）、敏感（防效位于80%～90%）、中度敏感（防效位于60%～80%）、一般耐藥（防效位于30%～60%）以及耐藥雜草（防效低于30%）。研究結(jié)果表明，在600g a.i/hm2的推薦劑量下，以鮮重防效為評(píng)價(jià)指標(biāo)，看麥娘、日本看麥娘、早熟禾、薺菜、草、牛繁縷、棒頭草、刺果毛茛、硬草和小藜等10種雜草對(duì)丙酯草醚較敏感和敏感。

1.3 酶水平測(cè)定

在酶水平上進(jìn)行的生物測(cè)定，前提是已知該除草劑的作用靶標(biāo)。例如，草甘膦的作用靶標(biāo)為EPSP合成酶，是芳香族氨基酸合成過(guò)程中的重要酶，通過(guò)抑制EPSP合成酶活性可以導(dǎo)致莽草酸累積，所以通過(guò)測(cè)定植物體內(nèi)莽草酸累積量可以確定草甘膦活性大小[6]（Pline W.A.et al.，1999；Fuchs M.A. et al，2002）。另外，磺酰脲類除草劑的作用靶標(biāo)為乙酰乳酸合成酶，那么植物對(duì)磺酰脲類除草劑的敏感性可以通過(guò)乙酰乳酸合成酶的活性變化來(lái)判定[7]。

1.4 細(xì)胞或細(xì)胞器水平測(cè)定

特定作用機(jī)制的除草劑可采用細(xì)胞或細(xì)胞器水平測(cè)定，其中又以線粒體和葉綠體中的特定生理生化反應(yīng)的測(cè)定居多。在離體線粒體中，可以采用瓦氏呼吸裝置測(cè)定氧的吸收和磷氧比，進(jìn)而確定呼吸作用抑制劑類除草劑的活性[8]。三氮苯類等光合作用抑制劑類除草劑作用于光系統(tǒng)Ⅱ中質(zhì)體醌QB結(jié)合部位，替換與D1蛋白結(jié)合的質(zhì)體醌QB，致使電子傳遞受阻，這類除草劑可以測(cè)定希爾反應(yīng)活性，通過(guò)測(cè)定鐵氰化鉀光還原，折算成放氧活力，能很好地反映除草劑的除草活性[9]。另外，細(xì)胞器中特定物質(zhì)含量的測(cè)定也可以作為測(cè)定指標(biāo)用于除草劑活性評(píng)價(jià)，如葉綠素含量測(cè)定，在用于新型磺酰脲類除草劑HNPC-C9908活性測(cè)定時(shí)，藻細(xì)胞中葉綠素含量隨供試藥劑濃度的增加而逐漸降低，表現(xiàn)出良好的劑量——效應(yīng)關(guān)系[10]。

2 除草劑生物測(cè)定操作方法

2.1 生物測(cè)定中供試生物體的選擇

在除草劑的生物測(cè)定中，常常以植物為主，但特殊情況情況下也可選用其他生物。在實(shí)際操作中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同的作物或者雜草。比如需要測(cè)定除草劑對(duì)特定作物或雜草的生物活性，以特定的作物或雜草為實(shí)驗(yàn)材料；需要測(cè)量除草劑在土壤或水體中的殘留量，就要先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)或者實(shí)際經(jīng)驗(yàn)篩選敏感植物，之后通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用敏感植物在土壤或水中的生存情況來(lái)確定殘留情況。一般來(lái)講，生物測(cè)定中選擇供試植物應(yīng)遵循以下幾個(gè)原則：一是供試植物來(lái)源要充分、個(gè)體應(yīng)基本一致；二是供試植物對(duì)除草劑反應(yīng)是有規(guī)律性的，比如一定范圍內(nèi)劑量和死亡率（或生理生化指標(biāo)）成一定的相關(guān)性（正相關(guān)或負(fù)相關(guān)）等；三是現(xiàn)象具有可重復(fù)性，即相同或相似實(shí)驗(yàn)條件下，正相關(guān)的關(guān)系效應(yīng)可以重復(fù)顯現(xiàn)。在材料選擇上，主要以高等被子植物作為生測(cè)材料，有時(shí)也可選用低等生物如藻類作為生測(cè)材料，主要是藻類作為低等生物，材料生長(zhǎng)均勻一致性高、生長(zhǎng)周期短、生理生物指標(biāo)顯現(xiàn)明顯，準(zhǔn)確性較高。實(shí)際操作中，對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件較為完善、實(shí)驗(yàn)設(shè)備較為齊全的研究室，可以考慮開展藻類生物測(cè)定。對(duì)于基層實(shí)驗(yàn)單位，比如農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣系統(tǒng)、基層農(nóng)業(yè)廣播學(xué)校等技術(shù)員培訓(xùn)機(jī)構(gòu)，則建議采取作物或雜草作為指示植物，更利于操作和觀察。

2.2 生物測(cè)定中除草劑濃度的設(shè)置

除草劑的生物測(cè)定中，需要做系列濃度（或劑量）設(shè)置，可以采用等差或等比數(shù)列的方式，原則上濃度（或劑量）設(shè)置應(yīng)在5個(gè)以上，并且設(shè)置空白對(duì)照或清水對(duì)照，必要時(shí)還要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照或當(dāng)?shù)爻Ｓ贸輨?duì)照。供試除草劑的濃度設(shè)置應(yīng)在靶標(biāo)植物的正常響應(yīng)范圍內(nèi)，通常認(rèn)為靶標(biāo)植物對(duì)供試除草劑的反應(yīng)在0%～90%時(shí)的濃度（或劑量）設(shè)置是比較合理的，可以獲得較為準(zhǔn)確的回歸方程，應(yīng)用該回歸方程計(jì)算出EC10、EC50、EC90等試驗(yàn)所需濃度（或劑量）。為保證試驗(yàn)條件的一致性和試驗(yàn)結(jié)果的可比性，試驗(yàn)前應(yīng)先將原藥配制成一定濃度的母液后，采用梯度稀釋的方法進(jìn)行；試驗(yàn)方法也應(yīng)按照除草劑的使用方法，選擇噴霧處理或土壤處理。噴霧處理中，噴霧設(shè)備性能要良好，霧滴要均勻一致，如不具備良好的噴霧設(shè)備，可采用滴定法，即用微量移液器將定量藥液滴在供試植物的特定部位，如植物第二展開葉，該方法可以避免噴霧霧滴不勻造成的人為誤差。采用土壤處理時(shí)應(yīng)先配制成一定濃度的毒土，用相同土壤逐步稀釋成梯度濃度，均勻撒適于相應(yīng)處理中[11]。所有試驗(yàn)濃度（或劑量）都應(yīng)重復(fù)3次以上。

2.3 生物測(cè)定在新農(nóng)藥篩選中的應(yīng)用

篩選目標(biāo)化合物除草活性的一般步驟為：1.確定生物活性，在相同植物試材，相同劑量下，進(jìn)行新化合物普篩，明確化合物活性。2.確定活性大小，通過(guò)設(shè)置梯度濃度，初步確定目標(biāo)化合物的活性大小。3.確定除草劑作用特點(diǎn)和特性，通過(guò)不斷篩選、復(fù)篩，逐漸增加靶標(biāo)雜草的種類和擴(kuò)大試驗(yàn)作物的范圍，對(duì)除草劑自身特性和使用特點(diǎn)進(jìn)行研究，確定應(yīng)用劑量、除草劑選擇性、雜草譜和應(yīng)用階段，進(jìn)而確定對(duì)作物的安全性以及除草劑殘留消解動(dòng)態(tài)等[12,13]。目前，新農(nóng)藥創(chuàng)制中，生物測(cè)定時(shí)普遍采用培養(yǎng)皿法，也就是種子萌發(fā)法。具體做法是將靶標(biāo)生物種子放入鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，用移液槍加入稀釋成梯度濃度的目標(biāo)除草劑，放入人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，7天后對(duì)種子生物指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過(guò)發(fā)芽率、鮮重、根或莖的抑制情況等數(shù)據(jù)計(jì)算抑制中濃度，從而判斷比較目標(biāo)除草劑生物活性[14]。種子萌發(fā)法在除草劑新化合物篩選上具有一定的局限性，對(duì)氨基甲酸酯類除草劑具有很高的篩出率，但難以檢出大部分光合作用抑制型除草劑[2]，因此在除草劑新化合物篩選上應(yīng)進(jìn)一步拓展新方法、新思路，避免化合物的錯(cuò)選、漏篩。

[1]宋小玲,馬波,皇甫超河,等.除草劑生物測(cè)定方法[J].雜草科學(xué),2004(03):1-5.

[2]蘇少泉,宋順祖.中國(guó)農(nóng)田雜草化學(xué)防治[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1996.

[3]姚東瑞,陳杰,宋小玲,等.綠磺隆在三種土壤中的降解[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1998,14(04):215-219.

[4]范志金,錢傳范,陳俊鵬,等.單嘧磺隆對(duì)小麥的安全性及在麥田除草效果的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2003,19(03):4-8.

[5]褚秋華,朱云枝,強(qiáng)勝.苯噻酰草胺·芐嘧磺隆室內(nèi)配方篩選試驗(yàn)[J].雜草科學(xué),2002,(04):15-17.

[6]Pline W.A.,Wu J.R.,Hatzios K..Effects of temperature and chemical additivies on the response of transgenic herbicide-resistant soybeans to glufosinate and glyphosate applications[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,1999,65:119-131.

[7]謝娜,畢亞玲,李凌緒,等.不同玉米品種對(duì)氯吡嘧磺隆的耐藥性差異及其機(jī)制[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2012,(06):567-572.

[8]強(qiáng)勝.雜草學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001.

[9]譚惠芬,劉華銀,楊華錚.希爾反應(yīng)測(cè)定中新型抑制劑活性的鑒定方法[J].植物生理學(xué)通訊,1998,34(02):126-129.

[10]歐曉明,雷滿香,黃明智,等.新除草劑HNPC-C9908對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2003,5(03):16-23.

[11]宋小玲,馬波,皇甫超河,等.除草劑生物測(cè)定方法[J].雜草科學(xué),2004,(03):1-5.

[12]陳萬(wàn)義,薛振祥,王能武.新農(nóng)藥研究與開發(fā)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,1999.

[13]陳年春.農(nóng)藥生物測(cè)定技術(shù)[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1991：208-230.

[14]王樹鳳,徐禮根,馬建義,等.除草劑生物篩選研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,4(04):3-9.

S482.4

A

10.14025/j.cnki.jlny.2017.18.023

謝娜，碩士研究生，林業(yè)工程師，研究方向：農(nóng)藥毒理與有害生物抗藥性。