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三種不同產(chǎn)地蒙藥草烏炮制前后三種烏頭堿含量的比較研究

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目的：測(cè)定三種不同產(chǎn)地的生草烏和制草烏中的有效成分含量，檢定藥材質(zhì)量，對(duì)炮制前后的雙酯型生物堿含量變化進(jìn)行測(cè)定。方法：使用HPLC方法進(jìn)行測(cè)定，選擇四川、吉林與新疆三地的草包進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：Agilent SB-C18，尺寸4.6mm×250mm，粒徑5μm；流動(dòng)相：甲醇0.3mol·L-1三乙胺（65：35）；流速：1.0mol·min-1；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm，梯度洗脫。結(jié)果：草烏在炮制前后的雙酯型生物堿含量會(huì)有一定變化，呈降低趨勢(shì)，四川、新疆、吉林各產(chǎn)地的變化趨勢(shì)分別為：0.4405降低到0.1553，6.0910降低到2.3257，1.2328降低到1.0073。結(jié)論：產(chǎn)地不同，雙酯型生物堿含量差異也比較明顯，在入藥前要先測(cè)定含量，經(jīng)炮制后，再入藥，以確保用藥安全。

草烏；炮制；雙酯型生物堿；含量

草烏是毛莨科烏頭屬植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥塊根，作為一種中藥材，可以袪風(fēng)除濕，止痛溫經(jīng)，其活性成分主要是生物堿，所含雙酯型生物堿含有劇毒，溫?zé)釛l件下，性質(zhì)不穩(wěn)定，可能會(huì)分解為低毒性的單酯生物堿，因此，草烏一般要經(jīng)過(guò)炮制降低毒性后，才能入藥。為了確保用藥安全，使用草烏時(shí)需要測(cè)定其制品或者制劑中的雙酯型烏頭堿含量。

1 儀器與試劑

（1）儀器。高效液相色譜儀（Agilent 1100)，美國(guó)Agilent公司；電子天平(CPA225D），德國(guó)賽多利斯公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI B49），瑞士Buchi公司；超聲清洗儀，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；恒溫水浴鍋（W2-100SP），上海申生。

（2）試劑。烏頭堿對(duì)照品（MUST-15013008)，新烏頭堿對(duì)照品（MUST-14100909)，次烏頭堿對(duì)照品（MUST-14100908)，均為成都曼思特生物科技公司生產(chǎn)，純度均不低于98.0%；訶子，生草烏，濟(jì)南仁和；甲醇，色譜純，Thermo Fisher Scientific Inc.；三乙胺與其他試劑為分析純；草烏從四川、吉林和新疆采集，由松林教授鑒定為毛莨科植物北烏頭的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

（1）色譜條件。色譜柱∶Agilent SB-C18，尺寸4.6mm×250mm，粒 徑 5μm； 流 動(dòng) 相∶ 甲 醇 0.3mol·L-1三 乙 胺（65∶35）， 梯 度洗 脫∶0min-16min(5%-20%)，16min-45min(20%-30%)，45min-60min(30%-35%)，60min-70min(40%)； 流 速∶1.0mol·min-1； 柱 溫∶35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)∶235nm。

（2）制備對(duì)照品溶液。精密稱取烏頭堿對(duì)照品0.85mg、新烏頭堿對(duì)照品1.52mg、次烏頭堿對(duì)照品1.59mg，在5mL量瓶中放置，加入0.05%甲醇溶液，溶解并稀釋到刻度，搖勻后再使用0.45μm粒徑的濾膜過(guò)濾后即可獲得。

（3）制備炮制品。訶子3kg加入30L水蒸制，加入10kg的草烏，再浸泡2-3d后，口嘗時(shí)輕微麻舌即為適度，取出炮制品，干燥即可。

（4）制備供試品溶液

精密稱取生草烏與炮制草烏粉末（過(guò)4號(hào)篩）各2g，置具塞入錐形瓶中，加入3ml氨試液，濕潤(rùn)20min。精密加入異丙醇∶乙酸乙酯混合溶液（1∶1）50ml，搖勻后稱重，用超聲30min后冷卻，再稱重，加入異丙醇和乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足失去的重量，搖勻后，用0.45μm粒徑的濾膜過(guò)濾，取出續(xù)濾液后即可。

（5）線性關(guān)系。精密吸取制備的混合對(duì)照品溶液2、4、6、9、10，置入100ml瓶中，加入0.05%甲醇溶液以便定容，搖勻后，就能得到6種濃度不同的對(duì)照品溶液。注入液相色譜儀后，取峰面積當(dāng)作縱坐標(biāo)，取進(jìn)樣量當(dāng)作橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)的回歸方程，分別為∶烏頭堿回歸方程Y=942580X+28350，r=0.9997；次烏頭堿回歸方程Y=797130X+86810，r=0.9996；新烏頭堿回歸方程Y=540560X+97040，r=0.9998；計(jì)算可知，0.34μL-1.70μL線性范圍內(nèi)的烏頭堿、0.64μL-3.18μL線性范圍內(nèi)的次烏頭堿、0.61μL-3.04μL線性范圍內(nèi)的新烏頭堿，處于線性關(guān)系良好的狀態(tài)下。

（6）精密度試驗(yàn)。將第2項(xiàng)下制備的溶液稀釋100倍后，分別量取0.85、1.60、1、50mg/mL的烏頭堿、次烏頭堿以及新烏頭堿對(duì)照品溶液10μL進(jìn)樣，做5次連續(xù)進(jìn)樣，再測(cè)定這三種生物堿峰面積，計(jì)算RSD后，可知新烏頭堿、烏頭堿與次烏頭堿在0.48%、0.43%、0.33%的RSD下能夠保持良好的精密度。

（7）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一項(xiàng)草烏3份，按照第4項(xiàng)的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照第1項(xiàng)的色譜條件完成進(jìn)樣測(cè)定后，可以從結(jié)果樣品中分析新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的RSD平均為0.47%、0.52%、0.87%（n=3），根據(jù)特征色譜所測(cè)定的方法有良好的重復(fù)性。

（8）穩(wěn)定性試驗(yàn)。稱取同一個(gè)供試品溶液，在0、2、6、12、24h時(shí)分別進(jìn)樣1次，并記錄3種生物堿的峰面積，新烏頭原堿、次烏頭原堿、烏頭堿的RSD分別在0.68%、0.47%和0.45%，這些溶液能夠在24h維持基本的穩(wěn)定狀態(tài)。

（9）加樣回收率試驗(yàn)。取已知的3種生物堿含量相同的草烏5份，每份中分別加入適量的3種生物堿對(duì)照品，根據(jù)第4項(xiàng)中的方法制備供試品溶液，測(cè)定回收率后，可知烏頭堿、次烏頭堿與新烏頭堿回收率平均值分別為98.72%、98.27%和97.35%，RSD平均值分別為2.25、1.26、1.13。

（10）樣品測(cè)定。測(cè)定3產(chǎn)地樣品中的3種生物堿含量，結(jié)果為∶四川產(chǎn)草烏新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量分別為0.0302、0.004、0.4099，雙酯型生物堿總含量為0.4405；吉林產(chǎn)草烏新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量分別為0.9257、0.2272、0.0799，雙酯型生物堿總含量為1.2328；新疆產(chǎn)草烏新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量分別為2.8653、0、3.2257，雙酯型生物堿總含量為6.0910。生草烏中的雙酯型生物堿總含量在0.4405-6.0910mgg-1，烏頭堿含量最高，也最為普遍。

（11）炮制后三產(chǎn)地生物堿含量。測(cè)定草烏中3種生物堿炮制后的含量變化，結(jié)果為∶四川產(chǎn)草烏新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量分別為0.0075、0.0003、0.1475，雙酯型生物堿總含量為0.1553；吉林產(chǎn)草烏新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量分別為0.7581、0.1909、0.0583，雙酯型生物堿總含量為1.0073；新疆產(chǎn)草烏新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量分別為0.0984、0、2.2273，雙酯型生物堿總含量為2.3257。炮制后的三產(chǎn)地生物含量依然是新疆產(chǎn)最多，其次為吉林產(chǎn)，最后為四川產(chǎn)。

3 討論

草烏中的生物堿成分含量較大，其中雙酯型烏頭堿含量在不同產(chǎn)地間差異較大，新疆產(chǎn)草烏的雙酯型生物堿總含量遠(yuǎn)高于其他兩地，四川產(chǎn)草烏則含有最少的雙酯型生物堿，吉林產(chǎn)草烏雙酯型生物堿含量也很全面。草烏的成分測(cè)定，對(duì)于安全用藥有重要意義，毒性成分含量過(guò)高，則需要更加嚴(yán)格的炮制過(guò)程，最大限度保持安全用藥。如果毒性成分過(guò)低，為保留有效成分，則需要適度炮制。加入訶子炮制草烏后，能夠使部分毒性成分降低。訶子中的鞣質(zhì)成分能夠促進(jìn)生物堿的溶出，將訶子和草烏共煎后，更容易溶出雙酯型生物堿，降低毒性，同時(shí)還能更好地保留藥效。

（作者單位：內(nèi)蒙古阿拉善左旗吉蘭太衛(wèi)生院）

[1]薩仁高娃,陳紅梅.蒙藥制草烏的炮制時(shí)間對(duì)總烏頭堿含量的影響與中藥制草烏的總烏頭堿含量比較[C]// 中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨中國(guó)藥師周大會(huì).2010:1078-1081

[2]趙愛(ài)娟,李紅,圖雅,李霄.訶子與草烏不同比例配伍對(duì)3種雙酯型生物堿含量的影響[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,32(4):697-700