（天津市動物疫病預防控制中心天津300402）

豬體內(nèi)偽狂犬病毒分布及其神經(jīng)示蹤啟示

徐國棟

（天津市動物疫病預防控制中心天津300402）

偽狂犬病(Pseudoraies,PR)是當前國內(nèi)豬群中重要的疫病之一，掌握PRV在豬體內(nèi)的分布規(guī)律有利于理解豬感染PRV后發(fā)生的病理過程、指導臨床病理診斷和取樣；理清PRV作為神經(jīng)示蹤物在實驗動物神經(jīng)系統(tǒng)中的循行特點將有助于理解PRV疫苗毒株和野毒株對豬的侵染機制，并啟示豬神經(jīng)癥狀出現(xiàn)前PRV的可能循行路線，幫助業(yè)者探究現(xiàn)場豬群最初感染PRV的可能途徑，制定更合理的免疫程序，故筆者對國內(nèi)相關研究進行綜述。

1 PRV在豬體組織中的分布規(guī)律

1.1 適于PRV增殖的細胞系

PRV可在源于各胚層的細胞中復制，具有泛嗜性。在體外適于其增殖的細胞系有腎細胞（兔、豬、牛、羊、犬、猴等）、睪丸細胞（豚鼠、兔、牛等）、成纖維細胞（雞胚、小鼠）、Vero細胞（猴）、Hela細胞（人）、EP傳代細胞（兔）、BHK-21細胞（倉鼠）、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞等。在不同的細胞系中，PRV的致病性有差異，如2013年，余文蘭等研究了PRV Ra株在體外7種細胞系中的增殖規(guī)律和致病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株在不同細胞系中表現(xiàn)出時間依賴的致病性，隨時間延長細胞，其中6種細胞（未見關于F81細胞的記載）依次出現(xiàn)CPE：ST細胞和PK-15細胞（18 h）、Vero細胞（28 h）、MDCK細胞（22 h）、CEF細胞和DF1細胞（130 h）；此外，在感染量一致前提下，該毒株在ST細胞中的抗原滴度最高，在PK-15細胞、Vero細胞、F81細胞中的滴度與ST細胞中差異不明顯，其次在MDCK細胞中滴度較高，在CEF細胞和DF1細胞中的滴度較低。綜合考慮認為ST細胞系是研究該毒株的較適宜細胞。此外，兔、鼠和雞胚等是常用的試驗動物。

1.2 PRV在豬體組織中的分布規(guī)律

PRV的傳播方式包括水平傳播和垂直傳播，在動物體內(nèi)擴散有3條途徑：①扁 桃體和咽部上皮―嗅神經(jīng)和舌咽神經(jīng)-脊髓-大腦途徑；②扁桃體和鼻咽部上皮-淋巴管-淋巴結(jié)-嗅神經(jīng)、舌咽神經(jīng)和三叉神經(jīng)末梢-三叉神經(jīng)-腦橋和脊髓-小腦和大腦途徑；③病變部白細胞攝入或細胞表面吸附-病毒血癥-包括孕畜胎盤和胎兒在內(nèi)的全身組織途徑。1992年，張斌等將3株PRV（S株、閩A株、Shope株）分別按2個不同劑量和3種不同方式（滴鼻、腦內(nèi)注射、肌內(nèi)注射）感染18頭3周齡PRV抗體陰性仔豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①病豬以體溫升高可達42℃、神經(jīng)功能紊亂為主要臨床癥狀。主要組織學變化是非化膿性腦脊髓炎、神經(jīng)元變性和壞死、神經(jīng)纖維變性，肺、扁桃體、淋巴結(jié)的炎癥和壞死，部分病豬大腦皮層、胼胝體星狀膠質(zhì)細胞、神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元、肺、扁桃體和淋巴結(jié)中存在嗜酸性核內(nèi)包涵體。②不同毒株、不同感染方式所致不同器官病理變化和嚴重程度有差異：3個毒株感染后均在神經(jīng)節(jié)和淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)了包涵體，但3個毒株在神經(jīng)不同部位中的分布仍有差異；此外，發(fā)同S株偏于消化道致病，閩A株偏于呼吸道致病，Shope株偏于扁桃體致??；3種感染方式中腦內(nèi)感染病豬癥狀最嚴重，而肌內(nèi)注射感染豬因未發(fā)病且缺乏相關病變。

1997年，周復春等用研制的PRV gp50基因（第434～651位共217 bp）PCR診斷試劑盒對18頭自然發(fā)病仔豬組織檢測發(fā)現(xiàn)：不同組織（器官）檢出率不同，依次是：三叉神經(jīng)節(jié)（100%，14/14）、嗅球（85.71%，12/14）、腦（75%，9/12）、扁桃體（54.55%，6/11）、肝（46.15%，6/13）、肺（25%，3/12）、脾（25%，3/12）、腎（7.69%，1/13）、心肌（0%，0/9）。還對2頭體重35 kg的實驗豬以PRV滅活苗連續(xù)5次免疫造成潛伏感染模型，攻毒15 d后剖殺感染豬并取組織（器官）進行檢測，結(jié)果在三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球、腦和扁桃體組織呈陽性，在肝、脾呈陰性（心、肺、腎未檢測），認為PRV在豬體內(nèi)檢出率依次是：三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球、腦組織、扁桃體，其次是鼻拭子（66.67%，16/24），再次是內(nèi)臟器官。1998年，李學伍等用PCR法對34頭自然發(fā)病豬（死胎）組織（器官）中的PRV gp50基因進行檢測，檢出率由高到低依次為：三叉神經(jīng)節(jié)（100%，28/28）、嗅球（88.4%，23/26)、扁桃體（60.87%，14/23）、肝臟（41.38%，12/29）、脾臟（26.92%，7/26）、肺臟（25%，6/25）、腎臟（6.67%，2/30）、心?。?.3%，1/23）。2003年，唐萬勇將強毒株PRV-Ea(PRV鄂A株)頸部肌內(nèi)接種血清學陰性的15日齡哺乳仔豬后，推測病毒首先在頸部淋巴結(jié)復制，其后通過局部神經(jīng)未稍向中樞神經(jīng)系統(tǒng)、通過病毒血癥向全身兩種途徑擴散，最終致病，仔豬出現(xiàn)的癥狀和病理變化與毒株強弱、接種劑量相關。觀察到的病理模型是：①仔豬感染后2～11 d內(nèi)體溫變化在39.5～41.5℃間；低劑量病毒感染可致仔豬陣發(fā)性顫抖，高劑量時可致共濟失調(diào)、后肢癱瘓、昏厥和癢覺；②該毒株可引起多器官出血性變化，推測與血小板數(shù)量減少、微血栓形成有關；③H.E染色發(fā)現(xiàn)該毒株致病以非化膿性腦脊髓炎、出血性間質(zhì)性肺炎、壞死性脾炎和淋巴結(jié)炎為特征；電鏡下中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元、肝腎細胞壞死。2005年，谷長勤等將PRV-Ea頸部肌內(nèi)注射15日齡仔豬后發(fā)現(xiàn)：該毒株對新生仔豬致病性強，可致腦膜、肺臟、淋巴結(jié)、腎臟等多處組織（器官）出血和微血栓，尤其對肺組織嗜性較強，出血性肺炎變化顯明，認為PRV-Ea與Shope株、京A株所致出血性支氣肺炎變化類似，而與閩A株、S株所致輕微肺炎有差異。同年，郟自明等用H.E和SABC染色法（鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合物法染色）對8頭15日齡PRV-Ea感染仔豬的組織進行了觀察：①SABC法觀察到包括大腦、小腦、脊髓和脊神經(jīng)節(jié)（胸段）、淋巴結(jié)、肺、扁桃體、胸腺、脾、肝、腸、胃、腎、腎上腺等多種組織（器官）中存在陽性細胞，其中在神經(jīng)組織、肺和淋巴組織內(nèi)較多，組織損傷明顯，尤其是出血性間質(zhì)性肺炎嚴重，是應考慮重點的病理學指標；②病毒存在部位與該部位病理變化具有相關性，在組織增生明顯的部位病毒含量較高，在出血和壞死較明顯的組織病毒量含量較低甚至難以檢測到；③陽性細胞的胞漿和胞核均存在病毒，但胞漿內(nèi)較多。2007年，龍曉亭對4周齡PRV陰性仔豬使用滅活疫苗免疫1次、30 d后用標記毒株PRV gG-/LacZ+鼻內(nèi)接種1次后建立了PRV潛伏模型，用PCR法連續(xù)5d檢測鼻拭子中PRV gD基因陰性，認為該模型得以維持，再用注射地塞米松激活潛伏感染，其后用HE染色法和SABC（鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合物法）染色法對豬體組織中標記PRV時空分布規(guī)律進行了觀察：①攻毒后7 d內(nèi)豬體溫變化在39.5～41.5℃間，攻毒3 d后不再自鼻腔排毒，激活后又重新排毒，推測在大腦中的潛伏形成與抗體不易通過血腦屏障有關；②兩種方法觀察到的組織病變部位與陽性細胞分布部位基本一致；潛伏-維持-激活期間（攻毒后7～79 d），陽性細胞廣泛分布于大腦、小腦、腦干、三叉神經(jīng)、視神經(jīng)、扁桃體、肺和腎臟等組織（器官）；③潛伏維持期間PRV嗜神經(jīng)元性強，在神經(jīng)元豐富的大腦皮層陽性細胞數(shù)量較多，盡管HE染色未觀察到三叉神經(jīng)的明顯病變，但SABC法仍檢測到其中的PRV。潛伏期間PRV在非神經(jīng)組織中主要分布于復層扁平上皮、肺泡上皮細胞、腎小管上皮細胞等上皮細胞，其中以扁桃體內(nèi)陽性細胞數(shù)最多。在細胞水平，PRV分布于感染細胞的胞質(zhì)和胞核內(nèi)，且胞質(zhì)中較多。④激活后1～14 d，多數(shù)組織中陽性細胞數(shù)明顯多于潛伏期數(shù)量（除大腦外），期間大腦內(nèi)陽性細胞數(shù)量反而下降的原因可能與地塞米松能減低血腦屏障通透性或豬體內(nèi)中和抗體效價較高有關。激活后在14～2l d，PRV仍可沿脊髓-腦干方向逆?zhèn)?。⑤多?shù)組織內(nèi)陽性細胞數(shù)量隨攻毒后時間延長呈規(guī)律性減少，但神經(jīng)細胞和間質(zhì)性肺炎的病理損傷不易恢復或消散。2007年，劉俊磊對30日齡PRV血清學陰性仔豬2次免疫滅活疫苗，抗體達峰值時攻毒（PRV gG-/LacZ+）建立了PRV潛伏模型，用PCR法對每周采集的鼻拭子和剖殺豬組織進行檢測，并在攻毒70 d后連續(xù)5 d注射地塞米松2 mg/（kg·bw）激活維持的潛伏，再分別用PCR/RT-PCR方法在DNA/RNA水平檢測組織內(nèi)PRV相關基因分布情況，包括β-actin（看家基因）、IE180（立即早期基因180）、EP0（早期基因）、gD（糖蛋白D）、lacZ（β-半乳糖苷酶基因）和LAT（潛伏相關轉(zhuǎn)錄體）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①在攻毒后1～11 d內(nèi)實驗豬體溫變化在39.5～41.5C°間，激活后1～14 d內(nèi)其體溫變化在38.5～40.5C°間；②感染7 d后即可在豬大腦、小腦、肺和三叉神經(jīng)節(jié)中檢測到部分相關基因，陽性結(jié)果持續(xù)到試驗結(jié)束（攻毒后113 d或激活后38 d），此外，結(jié)果顯示IE180基因是唯一立即早期基因，其表達持續(xù)存在；LAT在感染初期不表達或很少表達，而潛伏感染建立以后即開始大量表達；EP0基因在激活中晚期基因表達后即停止自身表達；gD作為晚期基因，其表達依賴于IE180和EP0兩者的共作用；（3）PRV在組織（器官）中的分布規(guī)律是：三叉神經(jīng)（100%，8/8）和腦干（100%，8/8）及扁桃體（100%，2/2）、大腦（87.5%，7/8）和嗅球（87.5%，7/8）、鼻黏膜（83.33%，5/6）、小腦（75%，6/8）和淋巴結(jié)（75%，6/8）及肺（75%，6/8）、視神經(jīng)（62.5%，5/8）和脾（62.5%，5/8）、胸腺（28.57%，2/7）、腎（1.25%，1/8）、心肌（0%，0/8）和骨骼?。?%，0/7）。

2 從PRV作為神經(jīng)示蹤物看其在實驗動物神經(jīng)組織中的分布規(guī)律

PRV可由神經(jīng)突觸后向突觸前神經(jīng)元逆行侵染神經(jīng)系統(tǒng)，這使標記PRV作為揭示動物神經(jīng)傳導環(huán)路的病毒性示蹤物成為可能，常用的示蹤毒株有PRV-D、PRV-Bartha、PRV-BaBlu、PRV-Su等，毒株間毒力和神經(jīng)嗜性略有差異，自上世紀末，此類研究多用鼠作為實驗動物，未見有用豬作為實驗動物的報道，但總結(jié)PRV示蹤相關文獻有助于理解豬PR發(fā)生的病理過程。2006年，章鈞等總結(jié)了PRV示蹤神經(jīng)通路的進展，指出PRV膜蛋白gE、gI和Us9的缺失將致PRV-Bartha株毒力降低，但其跨神經(jīng)元傳播和在神經(jīng)纖維中進行復制的能力未見明顯下降，可沿神經(jīng)環(huán)路逐一侵染且不自神經(jīng)元胞體逸出感染鄰近細胞，示蹤特異性強，因此，可以作為神經(jīng)解剖學中神經(jīng)傳導通路及其功能研究的示蹤物。2014年，李碧等綜述了PRV神經(jīng)傳導機制：PRV囊膜中糖蛋白gB、gD、gL和gH與神經(jīng)傳導有關，gC、gE、gI、gG與傳導方向有關，因神經(jīng)細胞內(nèi)微管驅(qū)動蛋白3可與US9基因表達產(chǎn)物相結(jié)合后介導PRV的順行傳導，且US9.gE和gI基因的產(chǎn)物gE/gI影響了PRV順行傳導至軸突末端后的出胞運動，因此gE和gI基因均為PRV順行傳導必需基因，減毒PRV疫苗株因缺失了US9.gE和gI基因而使失去順行傳導能力，僅具有逆向傳導能力，野毒株因具有US9. gE和gI基因而具有雙向傳導（順行傳導／逆向傳導）能力。2006年，張敬東等在腦癱模型的SD大鼠坐骨神經(jīng)接種PRV（Su株）后，用免疫組化法觀察到接種鼠左側(cè)脊髓前角存在感染細胞，并于4天左右達到高峰，而同側(cè)脊髓后角、對側(cè)脊髓和頸段脊髓未見有感染細胞，即PRV沿坐骨神經(jīng)中的運動神經(jīng)纖維逆行傳導至脊髓前角，腰段脊髓神經(jīng)元和頸段脊髓神經(jīng)元并無直接神經(jīng)元突觸相連。2008年，張鳳用兩株標記PRV（PRV-gG—Lacz+、PRV-gG—TK—EGFP）作為神經(jīng)束路示蹤物，研究了SD雌性大鼠關元穴針刺信號向中樞神經(jīng)傳導的通路，分別在關元穴注射兩株PRV后對大鼠進行連續(xù)3 d電針刺激，其后取其腦和脊髓，用免疫組化法對冰凍切片組織中的陽性細胞核團進行定位和陽性細胞計數(shù)，用單因素方差對不同分組檢查結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn)：感染大鼠脊髓、腦干、下丘腦、前腦和皮層中的神經(jīng)核均發(fā)現(xiàn)了陽性細胞。不同毒株組均發(fā)現(xiàn)脊髓腹角中感染細胞較背角細胞大；不同毒株組在腦干中陽性細胞核團的分布略有差異，推測與毒株特性相關；不同毒株組的“去卵巢”大鼠下丘腦核團陽性細胞數(shù)均明顯減少，而“去卵巢+電針刺激”大鼠下丘腦核團陽性細胞數(shù)明顯升高，推測與內(nèi)分泌密切相關?？梢酝浦?，不同PRV毒株對大鼠中樞神經(jīng)細胞核團的侵染部位略有差異，且侵染程度與機體內(nèi)分泌功能密切相關。2009年，鞏騰用PRV（Bartha株）作為不跨膜逆軸漿神經(jīng)突觸示蹤物，研究了SD大鼠頸髓固有束相關周圍運動神經(jīng)通路（調(diào)控上肢隨意運動）體系的分布，將PRV穿刺侵染大鼠頸8或胸1神經(jīng)前根附近神經(jīng)束，并在術后4 h免疫組化染色法檢查相關組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRV在相關神經(jīng)組織中呈規(guī)律分布：頸部不同髓節(jié)的二級、多級運動性固有神經(jīng)元中PRV分布數(shù)量依次為3～4髓節(jié)、1～2髓節(jié)、5～6髓節(jié)，而7髓節(jié)中數(shù)量極少；頸部不同髓節(jié)的運動性固有束神經(jīng)纖維中PRV分布數(shù)量依次為3～4髓節(jié)、5～6髓節(jié)、頸8或胸1髓節(jié)、頸1～2髓節(jié)。2012年，葉達偉將PRV-614接種到C57BL/6J小鼠的左側(cè)腎臟上極，用熒光免疫組織化法觀察陽性神經(jīng)元的動態(tài)分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自第3天起至第6天，PRV存在于調(diào)節(jié)腎臟交感神經(jīng)活性的各級神經(jīng)元，依次向中樞逆?zhèn)髦良顾瓒?、延髓頭端腹外側(cè)核和中縫核、腦橋中A5區(qū)域和藍斑核及亞藍斑核、腳橋被蓋核致密部和尾端被蓋背外側(cè)核；隨接種時間延長，陽性神經(jīng)元逐漸增多。最終認為PRV接種后在相關神經(jīng)組織中的逆行傳遞具有時空特異性。

3 小結(jié)

1）豬PR的重要臨床指征有：①體溫升高。首次感染后體溫區(qū)間在39.5～41.5℃間，再次感染體溫區(qū)間在38.5～40.5℃間；②神經(jīng)系統(tǒng)征候。如哺乳仔豬八字腿、肌震顫、流涎、癲癇樣發(fā)作甚至搔癢等；③呼吸道征候。如干咳、喘；④消化道癥狀。如腹瀉，有研究認為近年來流行的哺乳仔豬腹瀉可能與PRV感染相關。

2）在細胞水平，PRV相關基因可發(fā)現(xiàn)于胞核和胞質(zhì)中；PRV在豬體內(nèi)分布及其含量的決定因素包括：毒株毒力、入侵途徑、免疫狀態(tài)，不同PRV株可引起不同組織（器官）不同程度的病理過程，強毒株常分布于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的全身各種組織，如PRV-Ea株、Shope株和京A可引起典型出血性肺炎，而弱毒株或中強毒株的增殖限于神經(jīng)系統(tǒng)，不引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)外的組織出現(xiàn)病變，臨床中最易檢測到PRV的器官有三叉神經(jīng)、嗅球、腦、脊髓、扁桃體和肺臟等，這些部位也常是該病毒的潛伏場所。

3）PRV侵染神經(jīng)系統(tǒng)將沿固定的神經(jīng)環(huán)路傳導，病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布和循行路線呈現(xiàn)規(guī)律性，且具有時空特異性，入侵神經(jīng)后數(shù)天可能存在感染高峰，或隨時間延長感染的神經(jīng)元增多，出現(xiàn)的神經(jīng)癥狀與相應神經(jīng)環(huán)路病理過程有關，不同感染部位、不同神經(jīng)通路將決定病豬出現(xiàn)不同神經(jīng)癥狀。

4）地塞米松激活PRV潛伏的事實提示：PRV高感染率豬群中存在的任何免疫抑制因素均可能激活潛伏的PRV，最終導致群體性發(fā)病，因此，消除潛在免疫抑制因素、慎用免疫抑制性藥物可提高豬群存活率。

5）PRV在SD大鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的分布和含量與生殖相關內(nèi)分泌激素相關的事實提示：豬群免疫程序的制定應充分考慮豬群的現(xiàn)實生產(chǎn)狀態(tài)，如孕后期豬群應用弱毒疫苗免疫是否合理？

6）PRV潛伏的部位包括神經(jīng)系統(tǒng)、扁桃體和肺臟等，其潛伏-維持-激活的特點有著內(nèi)在的分子機制，這種致病特點決定了野毒株不易自感染豬群中清除，根除和凈化是最好的豬PR防治策略，但代價高，若退而求其次，則合理運用弱毒疫苗和滅活疫苗的免疫學原理，免疫與逐步淘汰感染種豬相結(jié)合，不失為有效的防治策略?！?/p>

略

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.1.002