沈慧敏, 李 超, 高 利, 劉太國, 劉 博, 陳萬權

(中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

原生質體法介導真菌遺傳轉化的研究進展

沈慧敏, 李 超, 高 利*, 劉太國, 劉 博, 陳萬權

(中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

原生質體法介導真菌遺傳轉化體系是實現大規(guī)模隨機、定點突變和菌種改良的方法之一,為研究真菌致病性和侵染機制奠定了基礎。原生質體法構建轉化體系的步驟包括原生質體的制備、轉化與再生,其中關鍵是原生質體的制備,通常采用酶解法破除細胞壁獲得原生質體,其獲得率直接影響轉化效率。轉化通常借助于聚乙二醇(PEG)介導、電擊或限制性內切酶法完成,其中PEG介導的原生質體轉化法較傳統(tǒng),技術較成熟;電擊法操作較簡單;限制性內切酶(REMI)介導的整合轉化,因其轉化效率較高,可產生大量穩(wěn)定的轉化子,正被越來越多地應用于絲狀真菌的遺傳轉化。

原生質體; 制備與再生; PEG介導; 電擊; REMI; 轉化子

隨著真菌分子生物學研究的迅速發(fā)展,越來越多的真菌全基因組序列測序成功,真菌生物學研究進入了功能基因組學時代,對能夠實現大規(guī)模隨機和定點突變技術的需求日益增加。遺傳轉化技術是實現大規(guī)模隨機和定點突變的重要方法之一,利用該技術可改變真菌的遺傳物質,可為深入研究真菌的某些代謝及生理現象提供方法,還可致力于解析真菌的致病機理。目前,實現真菌遺傳轉化的方法很多,如針對原生質體的遺傳轉化方法有聚乙二醇(PEG)介導的轉化、電擊轉化和限制性內切酶(REMI)介導的基因整合;針對完整細胞的遺傳轉化有以根癌農桿菌Ti質粒為載體的轉化法、醋酸鋰轉化及基因槍法等。不同的轉化方法針對的對象不同,轉化效率也不同。

原生質體轉化法以萌發(fā)的孢子、芽管或新生菌絲制備原生質體,經Ca2+處理使之成為容易吸收外界物質的感受態(tài)。構建攜帶外源基因和遺傳選擇標記的質粒,將制備好的原生質體懸浮于含質粒DNA的溶液中,在聚乙二醇、電擊或限制性內切酶的作用下,外源DNA可被受體菌的原生質體吸收并整合到其基因組中,再生菌體即可表達外源基因賦予的新遺傳性狀。轉化子因帶有顯性選擇標記(如對抗生素的抗性和熒光標記),可通過選擇性培養(yǎng)基進行選擇和鑒定。原生質體的制備與再生是實現該方法的基礎,也是關鍵步驟,其活性和再生率直接決定轉化能否成功。以下是主要步驟的幾個方面。

1 原生質體的制備與再生

該部分是進行轉化的關鍵步驟,主要包括以下幾個內容:

(1)原始材料的準備

制備原生質體的材料一般為幼嫩菌絲、分生孢子或擔孢子。菌體的生長時期、生長溫度和培養(yǎng)時間均會影響原生質體的制備,應避免菌體培養(yǎng)時間過長或過短,影響原生質體的制備和再生。為了制備出較多的原生質體,需要優(yōu)化菌體的培養(yǎng)時間。如在CM液體完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi的分生孢子3 d后可獲得較多的原生質體[1],而培養(yǎng)4 d的黑曲霉Aspergillusniger幼嫩菌絲體更宜用來制備原生質體[2]。

(2)溶壁酶系統(tǒng)

真菌原生質體通常采用酶解法去除細胞壁。不同真菌的細胞壁組成不同,主要包括纖維素、半纖維素、幾丁質、葡聚糖及蛋白質等。研究中應根據真菌細胞壁的組成特點,選擇合適的細胞壁降解酶。常用的細胞壁降解酶有蝸牛酶、崩潰酶及溶壁酶等。蝸牛酶中含有纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶、幾丁質酶和脂酶等30多種酶,在pH 5.8～7.0有較好的裂解真菌細胞壁的作用,是制備真菌原生質體有效的工具酶之一,尤其適合于降解含葡聚糖較多的真菌,如紅色酵母Phaffiarhodozyma的細胞壁[3]。崩潰酶是一類含有昆布多糖酶、木聚糖酶及纖維素酶的復合酶,廣泛應用于多種植物病原真菌的原生質體制備,該裂解酶尤其適合疫霉Phytophthora的細胞壁裂解[4]。此外來自哈茨木霉Trichodermaharzianum的溶壁酶具有蛋白酶、幾丁質酶及纖維素酶等活性,在子囊菌如禾頂囊殼Gaeumannomycesgraminis的原生質體制備中效果較好[5]。稻瘟病菌Magnaporthegrisea產生原生質體效率最高的酶是裂解酶和崩潰酶,且當酶濃度為10 mg/mL時產生的原生質體數量最多,酶解2～3 h后即可獲得相當數量的原生質體,兩種酶的最適作用溫度分別為30℃和32℃[6];適于裂解小麥紋枯病菌Rhizoctoniacerealis的崩潰酶,最佳反應溫度是24℃,最適的酶解時間為3 h[7];無論是真菌菌絲還是孢子,細胞壁的成分都比較復雜,所以在制備原生質體過程中通常選取上述酶中的2～3種混合使用,酶的濃度通常在0.5%～5%,酶解時間一般在2～4 h,酶解的最適溫度為28～32℃。通常在實際操作中要根據不同真菌細胞壁的成分而選擇酶組合形式、酶解時間和酶解溫度。

(3)滲透壓穩(wěn)定劑

滲透壓穩(wěn)定劑主要起維持質膜系統(tǒng)滲透壓的作用,降解細胞壁的酶類會破壞膜質系統(tǒng)使其難以再生,甚至破裂、失活。當剛剛形成的原生質體被釋放到酶液中時,酶系統(tǒng)對原生質體會起到傷害作用,如果傷害過大,會直接影響原生質體的再生和轉化,此時需要滲透壓穩(wěn)定劑來維持細胞質膜的滲透壓,對原生質體起到保護作用[8]。因此,滲透壓穩(wěn)定劑種類的選擇至關重要。不同真菌細胞所需的滲透壓穩(wěn)定劑不同,如水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani較適滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/L MgSO4·7H2O[9];黑曲霉Aspergillusniger較適滲透壓穩(wěn)定劑為1 mol/L山梨醇[2];小麥全蝕病菌Gaeumannomycesgraminis和青霉Penicillium較適滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/L NaCl[10]。

(4)再生培養(yǎng)基

原生質體的再生和原生質體的制備同等重要,需要探索和嘗試合適的再生培養(yǎng)基,如1.0 mol/L甘露醇較適合水稻紋枯病菌R.solani原生質體的再生[9];CM培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基較適合玉米絲軸黑粉菌Sphacelothecareiliana原生質體的再生[11];0.6 mol/L蔗糖完全培養(yǎng)基較適合紅曲霉Monascusanka原生質體的再生[12]。

2 原生質體法構建遺傳轉化體系的原理以及已轉化成功的真菌

采用原生質體構建遺傳轉化體系時通常借助于PEG介導、電擊或限制性內切酶介導來完成。將制備好的原生質體懸浮后加入已構建好的質粒載體,然后分別加入一定量的PEG 緩沖液、限制性內切酶或者放入電極杯中進行電擊,按照一定的操作步驟處理好后再加入到選擇性再生培養(yǎng)基中,直到長出轉化子。

2.1 PEG介導的原生質體轉化法

PEG介導的遺傳轉化是使用較早較普遍的細胞融合方法。1978年,Hinnen等[13]首先利用聚乙二醇作為介質成功完成了酵母原生質體轉化,此后PEG介導的原生質體轉化法逐漸應用于粗糙鏈孢菌Neurosporacrassa和構巢曲霉Aspergillusnidulans等[14]。一般認為PEG能和Mg2+、Mn2+、Ca2+等二價陽離子及外源DNA在細胞表面形成沉淀,從而改變質膜的通透性,以利于外源DNA的進入。高靜等[15]建立了PEG介導的蘋果腐爛病菌Cytosporamandshurica原生質體遺傳轉化體系,為深入研究該病菌的致病相關基因奠定了基礎。寧平等[11]研究了PEG介導的玉米絲軸黑粉菌S.reiliana原生質體轉化,其轉化效率約10個轉化子/μg DNA,篩選出穩(wěn)定表達潮霉素B抗性的轉化菌株,繼代培養(yǎng)9代后仍有潮霉素抗性。另外,現采用PEG介導的方法已建立了大麥堅黑粉菌Ustilagohordei、紅曲霉M.anka、哈茨木霉T.harzianum、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum及玉米彎孢葉斑病菌Curvularialunata等遺傳轉化體系[16-19]。

2.2 電擊轉化法

電擊轉化法是傳統(tǒng)PEG轉化法的基礎,其原理是利用直流短電脈沖在原生質體膜或細胞膜上形成可逆的瞬間通道,以利于外源DNA進入,質膜具有可修復性,外加電場造成的膜穿孔可在一定時間內自動修復[20]。由于電擊轉化步驟簡單,轉化效率較高,目前已經應用于不同物種的完整細胞和原生質體,包括細菌[21]和真菌[22]。

2.3 限制性內切酶介導的原生質體轉化法

在PEG和Ca2+存在的情況下,限制性內切酶和DNA連接酶可進入原生質體中,在限制性內切酶的作用下,染色體DNA的相應位點被切開,接著在DNA連接酶的作用下外源DNA插入到目標基因組中,該技術應用于很多真菌致病相關基因的標記與克隆[23]。B?lker等[24]用限制性內切酶法轉化了玉蜀黍黑粉菌Ustilagomaydis,得到了約1 000個插入突變體;Sánchez等[25]通過REMI法轉化了構巢曲霉Aspergillusnidulans,并試圖通過此方法來標記參與真菌無性繁殖的新基因;Tanaka等[26]基于REMI法對鏈格孢菌Alternariaalternata進行了轉化;王秋華等[27]對尖孢鐮刀菌F.oxysporum的REMI轉化體系進行了優(yōu)化,并對部分轉化子的表型進行了初步分析;遲歸兵等[28]通過限制性內切酶介導稻瘟病菌Magnaporthegrisea原生質體轉化,建立了突變體庫?；赗EMI法成功進行原生質體轉化的真菌還有鏈格孢Alternariaalternata、玉米大斑病菌Exserohilumturcicum、玉米小斑病菌Cochliobolusheterostrophus、灰蓋鬼傘菌Coprinuscinereus、構巢曲霉Aspergillusnidulans、稻瘟病菌Magnaporthegrisea、哈茨木霉T.harzianum、紅曲霉Monascusanka、甘藍枯萎病菌Fusariumoxysporum、玉米彎孢葉斑病菌C.lunata、葡萄潰瘍病菌Lasiodiplodiatheobromae等[29-41]。

3 轉化子篩選

將轉化后的原生質體涂布在含有已篩選濃度的抗生素(常用的抗生素有潮霉素、腐草霉素、遺傳霉素及新霉素等)再生培養(yǎng)基上,經3～7 d左右長出菌落,進行轉化子的抗生素抗性鑒定[11];將在含抗生素平板上長出來的菌落轉接到新的抗生素平板上,等菌落長出后再以同樣的方法繼代培養(yǎng)5代以上,檢測轉化子的遺傳穩(wěn)定性;提取DNA用特定抗生素的引物PCR檢測抗生素插入的片段[20]。

4 展望

利用原生質體法構建遺傳轉化體系的關鍵是原生質體的制備與再生,一般采用新生菌絲或孢子來制備原生質體。影響真菌原生質體制備的因素有很多,如菌齡過長會使細胞壁不容易酶解,從而影響原生質體的釋放。真菌的細胞壁組成較復雜,混合酶液比單一酶液酶解效果要好,在制備原生質體時要根據不同的真菌細胞壁成分來選擇合適的酶以及酶液濃度。滲透壓穩(wěn)定劑在酶解時能夠維持原生質體的滲透壓穩(wěn)定,防止酶破壞膜系統(tǒng),使原生質體難以再生,所以滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度的選擇與酶的選擇同樣重要。酶解時間過短,不能充分制備數量較多的原生質體,酶解時間過長,會影響再生。選擇合適的酶解溫度,能使酶更好地發(fā)揮作用。綜上所述,菌齡、酶系統(tǒng)、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解時間及酶解溫度等都會影響原生質體的數量和質量。轉化時的質粒中通常含有抗性標記和熒光標記。以抗性標記為選擇系統(tǒng)時,受體真菌對抗生素的敏感性很重要,潮霉素對大多數真菌具有抑制作用,很多真菌在遺傳轉化中都選擇將潮霉素抗性基因連接在載體上,因此可以考慮在研究其他真菌的轉化時構建帶潮霉素抗性基因的載體,再在含敏感濃度的潮霉素平板上進行篩選。

PEG介導的原生質體轉化法自從1978年第一次轉化酵母成功后,近40年來,隨著技術不斷成熟,應用范圍越來越廣,已在玉米絲軸黑粉菌S.reiliana[11]和紅曲霉M.anka[36]等真菌中實現了轉化。電擊轉化操作較簡便,既可以應用于原生質體也可用于完整細胞,不僅適用于絲狀真菌還適用于細菌和哺乳動物。影響電擊轉化法的因素有電壓和連接反應混合物的鹽濃度等[42]。REMI法轉化率較高,轉化子較穩(wěn)定[37]。

原生質體的制備與再生是進行遺傳轉化的基礎,但對于有些真菌來說,其原生質體制備過程繁雜,再生較難,轉化效率較低,轉化子不穩(wěn)定,所以不適合進行原生質體轉化,因此在選擇轉化方法時要先確定原生質體的制備和再生是否能夠實現。在確定可以使用原生質體法轉化后,進一步進行條件優(yōu)化,提高轉化效率,不同真菌原生質體的制備與再生的優(yōu)化條件要進一步開展深入研究。

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(責任編輯：田 喆)

Research progress in transformation of fungi mediated by protoplasts

Shen Huimin, Li Chao, Gao Li, Liu Taiguo, Liu Bo, Chen Wanquan

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectsPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The use of protoplast-mediated genetic transformation system is one of the means to achieve large-scale randomized and site-specific mutagenesis as well as strain improvement in fungi. It lays a foundation for studying fungal pathogenicity and infection mechanism. The procedure of constructing a protoplast-mediated transformation system involves protoplast preparation, transformation and regeneration. Among them, protoplast preparation is the key step, which is usually obtained by enzyme digestion-based cell wall removal. Protoplast production rate directly affects transformation efficiency. Transformation is usually mediated by polyethylene glycol (PEG), electric shock or restriction endonuclease digestion; PEG-mediated protoplast transformation is a relatively traditional and mature technique. The electric shock method is featured by simple operation. Because of the higher transformation efficiency which can produce a large number of stable transformants, restriction enzyme mediated integration (REMI) method is increasingly used in the genetic transformation of filamentous fungi.

protoplast; preparation and regeneration; PEG-mediated; electrical stimulation; REMI; transformant

2016-03-23

2016-07-11

國家自然科學基金(31571965)；北京市自然科學基金(6162022)；北京市科技新星(Z131105000413057)；北京市自然科學基金北京市科學技術研究院聯合資助項目(L140012)；小麥產業(yè)技術體系(CARS-03)

Q 78

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.004

* 通信作者 E-mail:lgao@ippcaas.cn