段國建，張浩波，陳 暉，孫明霞，彭曉霞

（甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州，730000）

甘青報春化學成分的提取、分離及結(jié)構(gòu)分析

段國建，張浩波，陳 暉，孫明霞，彭曉霞

（甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州，730000）

為了進一步挖掘傳統(tǒng)中藥的活性成分，對報春花科植物甘青報春（Primula tangutica）的化學成分進行了分離及結(jié)構(gòu)分析。利用柱層層析、制備薄層層析等分離手段分離得到4種化合物，并利用核磁共振波譜，高分辨質(zhì)譜等，同時結(jié)合相關(guān)文獻數(shù)據(jù)及理化數(shù)據(jù)分析，初步對所得化合物的結(jié)構(gòu)進行了鑒定，4種化合物分別為4-羥基苯甲酸、槲皮素、山奈酚和萜類化合物。

甘青報春；分離；結(jié)構(gòu)鑒定

甘青報春（Primula tangutica）屬于報春花科報春花屬植物，主要產(chǎn)于西藏東部、青海、四川西北部、甘肅等省份，其生長環(huán)境大多位于海拔3 300～4 700 m的高山草原、山坡濕潤草地、高山灌叢等地帶。甘草報春為多年生草本，植株高約4 cm。其藏語又名相哲姆保，奧勒西，是藏藥“相相哲吾”中的一種原植物，為藏醫(yī)用傳統(tǒng)藥材。在甘孜藏族地區(qū)，藏民們也廣泛使用，其味微苦、澀，性微寒，無毒，具有安神止痛，退燒，清熱斂瘡，斂痛等功效，常用于治療神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)痛、高血壓及燙傷、瘡癤等疾病[1-2]。

對報春花科植物藥理作用的研究結(jié)果表明，此類植物廣泛具有抗炎、解痙，免疫調(diào)節(jié)功能，抗腫瘤作用等。例如報春花科植物過路黃干燥全草的提取物具有良好的抗炎、解痙作用[3]；點腺過路黃全草提取物對小鼠腹腔巨噬細胞具有吞噬功能，對脾淋巴細胞產(chǎn)生IL-2 的影響作用[4]；報春花科植物中皂苷類成分抗腫瘤作用的靶點和途徑廣泛，除可直接殺傷和抑制癌細胞外，在增強機體免疫功能、抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移、誘導癌細胞的再分化等多個方面具有良好的活性[5]。鑒于對甘青報春的研究相對較少，而該藥的藥理研究尚未見文獻報道。本文選擇具有清熱消炎功能藏藥甘青報春為研究對象，對其有效部位進行深入研究，通過運用現(xiàn)代分離 (柱色譜、HPLC、PTLC等)、分析技術(shù) (1H NMR、13C NMR、HRMS等) 對甘青報春提取物中多種化學組分進行了分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試藥材甘青報春于2014年9月購于甘肅省碌曲縣。經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學李成義教授鑒定為甘青報春。

1.1.2供試藥劑石油醚 (60～90 ℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇等均為分析純試劑。顯色劑：5%磷鉬酸-乙醇溶液及碘。

1.1.3試驗儀器1H NMR由Bruker Avanced III超導核磁共振儀測定，DMSO-d6作溶劑；柱層析硅膠(200～300目)，薄層層析硅膠 (硅膠H，GF 254) 均為青島海洋化工廠出品。薄層 (II C) 檢測用ZF-1三用紫外燈 (254和365 nm)。XMTD-8222型電熱恒溫鼓風干燥箱 (上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；SB-3200DTD型超聲波清洗機 (寧波新芝生物科技股份有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)；200～300 柱層層析硅膠精制型 (青島海洋化工有限公司)；薄層色譜硅膠預制板 (煙臺市化學工業(yè)研究所)。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品處理及制備干燥的甘青報春全草 (1.5 kg) 粉碎后用85%乙醇室溫浸泡3次，每次7 d，浸出液經(jīng)減壓蒸除溶劑得浸膏50 g。浸膏用二氯甲烷 (500 mL) 溶解兩次，過濾并減壓蒸餾除去溶劑得浸膏15 g，然后以硅膠(200～300目)拌樣，揮干溶劑后以200 g硅膠濕法裝柱，用洗脫劑 (石油醚∶乙酸乙酯=5∶1～2∶1，二氯甲烷∶甲醇=50∶1～20∶1～10∶1～5∶1～2∶1) 梯度洗脫，經(jīng)薄層檢測合并極性相近的餾分，得11 個極性段 (A-K)。選擇合適的極性段化合物進行進一步純化，得到4種化合物。

1.2.2測 試通過1H NMR、13C NMR等技術(shù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

試驗分離得到4種化合物，結(jié)構(gòu)鑒定如下。

化合物1，編號：PF-1，無色針狀結(jié)晶。

1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ：12.40 (s，1H)，10.22 (s，1H)，7.79 (d，J = 8.7 Hz，1H)，6.82 (d，J = 8.6 Hz，1H)，13C NMR(100 MHz ，DMSO-d6) δ167.5， 161.8，131.6，121.1，115.4。

由1H NMR（圖1）和13C NMR（圖2）數(shù)據(jù)可知，在化學位移為7.79和6.82 ppm處有兩組雙重峰，且偶合常數(shù)相等，可以推測此化合物應該含有一個對位取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)；另外，在化學位移為12.40和10.22 ppm處分別有一個單峰，可以推斷此化合物應該含有羥基、醛基或羧基結(jié)構(gòu)，因為兩個單峰出現(xiàn)的較為低場（化學位移大于10），同時兩個峰型不相同（化學位移為12.40的單峰，峰型較寬；化學位移為10.22的單峰，峰型較窄）；其他位置沒有特征峰出現(xiàn)，同時結(jié)合其薄層色譜法（TLC）極性較大的特點，可以推斷此化合物應為含苯環(huán)的羧酸化合物。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，該化合物鑒定為4-羥基苯甲酸。

圖1 化合物PF-1的1H NMR譜圖

圖2 化合物PF-1的13C NMR譜圖

化合物2，編號：PG-5，淡黃色粉末。

1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ：12.48 (s，1H)，10.77 (s，1H)，9.57 (s，1H)，9.33 (s，1H)，9.28 (s，1H)，7.67 (d，J=2.5 Hz，1H)，7.53 (dd，J=8.5，2.5 Hz，1H)，6.88 (d，J=8.5 Hz，1H)，6.40 (d，J=2.2 Hz，1H)，6.18 (d，J=2.2 Hz，1H)；13C NMR (100MHz，DMSO-d6) δ：175.8，163.8，160.7，156.2，147.7，146.8，145.0，135.7，121.9，119.9，115.6，115.0，103.4，98.1，93.3。

由1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)可以看出，在低場區(qū)有5個單吸收峰，其他均為苯環(huán)區(qū)吸收峰，可以大致推斷出此化合物應屬于含5個羥基的黃酮類化合物。通過文獻查詢可知，以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的槲皮素的核磁數(shù)值較為一致，故鑒定此化合物為槲皮素(quercetin)。

圖3 化合物PG-5的13C NMR譜圖

化合物3，編號：PG-2，淡黃色粉末。

1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ：12.47 (s，1H)，10.77 (s，1H)，10.10 (s，1H)，9.38 (s，1H)，8.03 (d，J=8.5 Hz，2H)，6.91 (d，J=8.5 Hz，2H)，6.43 (d，J=2.2 Hz，1H)， 6.18 (d，J=2.2 Hz，1H)。13C NMR (100 MHz，DMSO-d6) δ：175.9，163.8，160.7，159.2，156.1，146.8，135.6，129.5，121.6，115.4，103.0，98.2，93.4。

由1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)可以看出，此化合物與化合物2的結(jié)構(gòu)相似，但在低場區(qū)只有4個單吸收峰，說明分子中應含有4個酚羥基，又由于除了苯環(huán)區(qū)吸收峰外再無其他吸收峰，因此可以判斷此化合物應該同樣屬于黃酮類化合物。通過文獻查詢可知，以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的山奈酚的核磁數(shù)值較為一致，故鑒定此化合物為山奈酚(kaempferol)。

圖4 化合物PG-2的13C NMR譜圖

化合物4，編號：PI-3，白色粉末。

IR(KBr，cm-1)：3427，2956，2932，2870，1632，1460，1381，1076，1053，1028；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ：9.38 (s，1H)，4.78 (s，1H)，4.46 (s，1H)，4.12 (d，J = 6.0 Hz，1H)，3.87 (d，J = 8.2 Hz，1H)，3.69–3.56 (m，2H)，3.24 (d，J = 8.3 Hz，1H)，3.00 (dd，J = 11.4，4.3 Hz，1H)，2.73 (d，J = 16.0 Hz，1H)，2.15 (d，J = 12.4 Hz，1H)，2.00 (td，J = 13.4，12.9，6.1 Hz，2H)，1.86 (d，J = 13.3 Hz，1H)，1.70 (d，J = 16.0 Hz，4H)，1.55 (t，J = 12.4 Hz，4H)，1.40 (dd，J = 33.8，15.4 Hz，7H)，1.24 (s，7H)，1.16 (s，3H)，0.99 (s，3H)，0.96 (s，3H)，0.92 (s，3H)，0.86 (d，J = 6.4 Hz，1H)，0.82 (s，3H)，0.75 (s，3H)，0.69 (d，J = 9.8 Hz，1H)，13C NMR (100 MHz，DMSO) δ：212.60，207.16，106.27，88.09，85.78，74.40，73.17，71.48，68.08，65.52，55.60，55.11，54.92，49.84，49.64，47.66，45.42，42.75，40.03，38.91，36.58，33.50，31.35，29.47，27.94，26.29，25.58，24.10，21.87，18.81，18.50，17.52，16.64，16.21.

結(jié)合1H NMR（圖5），13C NMR（圖6）和DEPT（圖7）核磁數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，該化合物中除了δH =9.38 (s，1H)處有一個單峰外，氫譜的低場區(qū)再無其他吸收峰，尤其是在化學位移為7附近沒有任何吸收峰，同時，碳譜中在130 ppm附近也沒有任何的吸收峰出現(xiàn)，說明此化合物中沒有苯環(huán)結(jié)構(gòu)存在。同時結(jié)合氫譜中9.38 ppm處的吸收峰和碳譜中210 ppm處的兩個吸收峰，并且碳譜中210 ppm處的兩個吸收峰在DEPT譜中消失，可以推斷此化合物結(jié)構(gòu)中應該含有一個醛基。由于在碳譜中210 ppm處出現(xiàn)了兩個吸收峰，而氫譜的低場區(qū)只有一個單峰，可以推斷此化合物結(jié)構(gòu)中應該含有一個酮羰基或者丙二烯的結(jié)構(gòu)，結(jié)合碳譜中106 ppm和88 ppm附近的吸收峰可以推斷，此組信號峰更符合丙二烯的結(jié)構(gòu)信息。在氫譜的4.78和4.46處的若的寬單吸收峰與末端雙鍵質(zhì)子的吸收信號非常吻合，但在碳譜中沒有發(fā)現(xiàn)末端烯碳[δ 150 ppm]信號峰。結(jié)合氫譜中4.5～0.8 ppm區(qū)域內(nèi)的多組吸收峰和碳譜中74～15 ppm范圍內(nèi)的多個吸收信號說明此化合物的骨架應該屬于含有一個醛基和丙二烯結(jié)構(gòu)的萜類化合物。推薦結(jié)構(gòu)為4-(buta-2，3-dien-1-yloxy)-10-hydroxy-1，2，6a，6b，9，9，12 a-heptamethyldocosahydropicene-4a-carbaldehyde。此化合物結(jié)構(gòu)仍需進一步驗證。

圖5 化合物PI-3的1H NMR譜圖

圖6 化合物PI-3的13C NMR譜圖

圖7 化合物PI-3的DEPT NMR譜圖

3 討論與結(jié)論

報春花科植物中主要化學成分有黃酮類、萜類、甾醇類、有機酸類、醌類等。這些成分在其他藥物的研究中已有相關(guān)報道。王宇杰[8]和楊念云[9]分別從金錢草中分離到山萘酚及其系列衍生物、槲皮素、黃芪苷、金絲桃苷、vicenin22等黃酮類化合物。田景奎等[10-11]從黃連花和細梗香草中分別分離出cyclaminorin，pleglucocyclamin和 primulanin；candidoside、細梗香草皂苷I、細梗香草皂苷J等萜類化合物。甘青報春的化學成分的研究還未見相關(guān)報道。

試驗對甘青報春提取物中多種化學組分進行分析，分離出4種物質(zhì)，經(jīng)鑒定分別為4-羥基苯甲酸、槲皮素、山奈酚和萜類化合物，這為甘青報春有效成分的研究提供了參考，為甘青報春的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，有利于開發(fā)藏藥，利用其天然產(chǎn)物進行新藥研制和臨床應用。

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[11] 田景奎，鄒忠梅，徐麗珍，等. 細梗香草化學成分的研究[J]. 中國藥學雜志，2006， 41（3）：171-173.

（責任編輯：肖 亮）

Extraction, Separation and Structure Analysis on Chemical Compounds of Primula tangutica

DUAN Guo-Jian，ZHANG Hao-Bo1，CHEN Hui，SUN Min-Xia，PENG Xiao-xia
（College of Pharmacy, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, PRC）

The study of extraction, separation and structure analysis on chemical compounds of Primula tangutica has been conducted to develop traditional medicine of China in the future. Using the techniques of separation contain column chromatography (CC), preparative thin layer chromatography (PTLC) and recrystallization, through the results of H-Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR), C-Nuclear Magnetic Resonance (13C-NMR), High Resolution Mass Spectrum (HRMS), and combined with literature data, physicochemical data, we provided the reasonable structures of the separated compounds. Four kinds of chemical compounds were identifed as 4-hydroxy benzoic acid, quercetin, rhizoma kaempferiae phenol and terpenoids respectively.

Primula tangutica; separation; structure analysis

book=58,ebook=66

S512.1

A

1006-060X（2016）12-0058-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.019

2016-09-28

甘肅省高等學?？蒲许椖浚?013A-084）；甘肅中醫(yī)藥大學引進人才基金項目（BH2012-089）

段國建(1980－)，男，河北省冀州市，副教授，主要從事天然藥物分子的分離分析及全合成研究。

張浩波