鐘 麗，劉冠明，程 誠(chéng)，陳兆貴

（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510550；3.惠州市世紀(jì)五豐農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，廣東 惠州 516003）

不同粒型水稻品種遺傳差異的SRAP分子標(biāo)記分析

鐘 麗1，劉冠明2，程 誠(chéng)3，陳兆貴1

（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510550；3.惠州市世紀(jì)五豐農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，廣東 惠州 516003）

研究利用SRAP標(biāo)記方法對(duì)13種長(zhǎng)粒水稻和9種短粒水稻材料進(jìn)行遺傳差異分析，以探討不同粒型水稻品種的遺傳差異。結(jié)果表明：共擴(kuò)增了Me1～Me15和Em1～Em20兩兩配對(duì)形成的300對(duì)引物，其中帶型清晰、有4條帶以上的引物161對(duì)；161對(duì)引物組合共產(chǎn)生1 512條擴(kuò)增帶，1 244條呈多態(tài)性，多態(tài)性條帶比率平均為81.9%，說明品種間存在著較豐富的遺傳多態(tài)性。聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳距離0.66處，可將供試材料分為3大類群。

水稻；粒型；分子標(biāo)記；SRAP；遺傳差異

水稻是人類最重要的糧食作物之一，全世界超過30億人以稻米為主食。因此，水稻的安全生產(chǎn)受到國(guó)家的高度重視[1]。提高水稻產(chǎn)量仍是目前水稻育種研究的主要目標(biāo)。水稻的產(chǎn)量與粒型有密切關(guān)系。水稻粒型性狀的遺傳比較復(fù)雜，研究表明，粒長(zhǎng)受微效多基因控制[2]。石春海等[3]研究表明，粒長(zhǎng)的表現(xiàn)在很大程度上是由遺傳決定的，外界環(huán)境對(duì)其影響相當(dāng)小。這一結(jié)論在秈稻稻米外觀品質(zhì)性狀的遺傳主效應(yīng)和環(huán)境互作效應(yīng)分析中可以體現(xiàn)出來。芮重慶等[4]研究表明，粒長(zhǎng)的遺傳雖然存在正向部分顯性的現(xiàn)象，但是在很大程度上是由加性效應(yīng)決定的；同時(shí)也可能存在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核間的互作效應(yīng)，但未觀察到細(xì)胞質(zhì)和上位效應(yīng)的影響，其狹義遺傳率高達(dá)95.3%。石春海等[5]在早秈稻谷粒性狀遺傳效應(yīng)的分析研究中指出，加性效應(yīng)是粒長(zhǎng)的主要遺傳規(guī)律，其貢獻(xiàn)比率為50.6%～98.4%。

SRAP標(biāo)記（sequence-based amplified polymorphism）是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、易測(cè)序、引物通用等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，廣泛應(yīng)用于植物的遺傳基礎(chǔ)研究和育種等領(lǐng)域，并在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域都有所進(jìn)展[8-12]。由于多年來育種家不斷地對(duì)水稻資源材料進(jìn)行定向選擇，目前水稻資源已經(jīng)形成了較多的衍生系。因此，在進(jìn)行育種技術(shù)創(chuàng)新和優(yōu)良種質(zhì)資源收集篩選之前，要充分了解水稻資源的現(xiàn)狀。試驗(yàn)采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)部分長(zhǎng)粒水稻和短粒水稻進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳差異分析，為進(jìn)一步研究長(zhǎng)?；虻淖饔脵C(jī)理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

長(zhǎng)粒水稻品系：7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38；短粒水稻品系：1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85。全部水稻材料由惠州市世紀(jì)五豐水稻研究所提供。

水稻分蘗盛期在每個(gè)單株取上部1～3片長(zhǎng)約5～10 cm的幼葉葉尖，每種材料取4株植株，即每種材料取4個(gè)樣品。樣品采集時(shí)，用消好毒的剪刀將水稻幼葉葉尖剪下裝入已標(biāo)號(hào)的密封袋中；樣品采集完后，置于-80℃冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取采用DNA-TPS法提取水稻葉片的DNA[13]，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度，將提取的DNA置于4℃冰箱中冷藏待用。

1.2.2 PCR反應(yīng)選取15條正向引物與20條反向引物（表1，所有引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成），兩兩配對(duì)，組成300對(duì)引物對(duì)進(jìn)行PCR，以22種水稻材料的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（每個(gè)樣品總體積20 μL）： 10 mmol/ L的 dNTP 0.5 μL，含15 mmol/L MgCl2的10×PCR buffer 2 μL，2 μmol/L的引物M 1.5 μL，2 μmol/L的引物E 1.5 μL，5 U/μL的Taq酶0.1 μL，雙蒸H2O 12.4 μL，DNA模板2 μL?；靹蚍湃隤CR儀中開始反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，35℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 變性1 min，46 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.2.3銀染和結(jié)果記錄電泳結(jié)束后，輕輕將玻璃板從電泳槽上拆下，做好標(biāo)記，取出凝膠，在蒸餾水中漂洗2次；轉(zhuǎn)移至0.1%AgNO3溶液中染色，在搖床上輕搖10 min；然后將凝膠轉(zhuǎn)移至蒸餾水中漂洗2次；最后轉(zhuǎn)入NaOH顯色液中顯色，著色后轉(zhuǎn)入自來水中保存。記錄帶型結(jié)果或凝膠成像。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析對(duì)SRAP-PCR試驗(yàn)電泳凝膠成像結(jié)果進(jìn)行記錄，采用人工讀帶的方法，在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶的記為“1”，無DNA條帶記為“0”，缺失的記為“2”，獲得每個(gè)引物的Excel 0-1矩陣。應(yīng)用NTSYS-pc2.10軟件處理并采用非加權(quán)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，得到遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)建立聚類圖。

表1 試驗(yàn)所用的SRAP標(biāo)記引物

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量

將TPS法所提取的DNA在0.8 %瓊脂糖凝膠上電泳分離，結(jié)果如圖1。電泳顯示的條帶比較整齊明亮，說明DNA沒有降解，純度較好，所以TPS法提取的DNA可以用于SRAP分析。

圖1 0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA純度

2.2 引物的選擇

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，300對(duì)引物中，擴(kuò)增出帶型清晰、有4條帶以上的引物對(duì)有161對(duì)，另外有57對(duì)引物對(duì)沒有擴(kuò)增出任何條帶，有82對(duì)引物對(duì)擴(kuò)增出的條帶極少。

2.3 RAP標(biāo)記的多態(tài)性分析

由表2可知，每對(duì)引物產(chǎn)生4～18條不等擴(kuò)增帶，共產(chǎn)生1 512條擴(kuò)增帶，其中1 244條呈多態(tài)性，平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生9.4條擴(kuò)增帶和7.7條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率平均為81.9%。不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性比率分布在20.00%～100%之間，而且絕大多數(shù)引物擴(kuò)增的條帶多態(tài)性較高，說明水稻的遺傳多樣性分析可以采用SRAP技術(shù)。圖2是引物組合Me14/ Em11擴(kuò)增的22種水稻材料的SRAP圖譜。

表2 SRAP引物組合、擴(kuò)增帶數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)

續(xù)表2

圖2 由引物Me14/Em11擴(kuò)增的22種水稻材料的SRAP圖譜

2.4 聚類分析

根據(jù)UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，得到了22種水稻材料的SRAP聚類圖（圖3），從圖3可知，在遺傳距離0.66處，供試材料被分成了3大類群。第一類群包括13個(gè)材料，為7-1、7-2、8、10、14-1、14-3、36、38、14-2、35、13、13-1、13-2（圖5中從上至下的順序），包括全部的長(zhǎng)粒水稻品種。第二類群有8個(gè)材料，為1、15、HP26、HP27、HP85、HP41、HP63、HP25，均為短粒水稻品種。第三類群只有1個(gè)材料，是HP11，為短粒水稻品種。

圖3 22種水稻材料遺傳多樣性聚類圖

3 討 論

3.1 SRAP分子標(biāo)記的可靠性

在作物育種工作中，對(duì)品種間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究具有重要的理論與實(shí)踐意義。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)之所以能夠區(qū)分絕大多數(shù)的栽培品種，是因?yàn)槠渚哂休^高的鑒別能力和引物利用率[14]，與RAPD技術(shù)相比，其引物數(shù)量雖然較少，但因?yàn)镾RAP的正向引物和反向引物可以通用，即正向引物可以與任一反向引物配對(duì)，同時(shí)反向引物也可以與任一正向引物配對(duì)，這樣就能在很大程度上提高引物的利用率。SRAP技術(shù)沒有AFLP的酶切、連接和擴(kuò)增雜交等繁瑣步驟，同時(shí)該技術(shù)引物設(shè)計(jì)較容易，操作方便，與以往的一些分子標(biāo)記技術(shù)相比，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)具有較大的優(yōu)勢(shì)[15-17]。因此，SRAP技術(shù)自產(chǎn)生以來就受到了大多數(shù)分子生物學(xué)家的青睞。對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，研究者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、藥物以及其他實(shí)際情況來靈活選擇，因?yàn)镾RAP不但可以采用比較傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，還可以采用比較環(huán)保的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)（該檢測(cè)方法采用銀染法染色）。

3.2 長(zhǎng)粒和短粒水稻遺傳背景差異

盡管關(guān)于水稻粒長(zhǎng)的遺傳機(jī)理眾說紛紜，但近年來國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究結(jié)果傾向于粒長(zhǎng)由多基因控制，并且在表達(dá)過程中存在著不完全顯性效應(yīng)[18]。石春海等[19]用3個(gè)長(zhǎng)粒品種分別與3個(gè)短粒品種兩兩配對(duì)進(jìn)行雜交，結(jié)果表明粒長(zhǎng)性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，并且以加性效應(yīng)為主。筆者利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)擴(kuò)增22種不同粒型水稻材料的DNA，發(fā)現(xiàn)SRAP擴(kuò)增的多態(tài)性條帶比率平均為81.9 %，多態(tài)性比率較高，說明品種間存在著較豐富的遺傳多態(tài)性。

試驗(yàn)中，聚類分析結(jié)果顯示，22種水稻材料在遺傳距離0.66處，可分為3大類群，13種長(zhǎng)粒水稻材料歸為一類，8種短粒水稻材料歸為另一類，此外，HP11單獨(dú)聚為一類，說明HP11與其他品系之間遺傳差異較大。鑒于HP11的獨(dú)特性，在雜交育種工作中，選配親本配制雜交組合時(shí)，可以考慮選用HP11與其他材料進(jìn)行雜交組合，以便創(chuàng)造出更多雜交后代變異類型，提高育種工作效率。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Analysis on Genetic Differences in Rice by SRAP Molecular Markers

ZHONG Li1，LIU Guan-ming2，CHEN Cheng3，CHEN Zhao-gui1
（1. Department of Life Science, Huizhou University, Huizhou 516007, PRC; 2. Agronomy College, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510550, PRC; 3. Huizhou Century Harvest Agricultural Science and Technology Inc, Huizhou 516003, PRC）

Taking thirteen kinds of long grain rice and nine kinds of short grain of rice as materials, the genetic differences between rice varieties were investigated by using SRAP markers method. The results showed that 300 pairs of primers Me1-Me15 and Em1-Em20 pairwise were formed, and 161 pairs of primers were amplifed clear, each of them got more than 4 bands. 161 pairs of primers amplifed 1 512 bands in total, and 1 244 bands were polymorphic bands, with an average rate of 81.9%. It revealed that there were abundant genetic polymorphisms between rice varieties. Cluster analysis indicated that these tested materials could be divided into three groups in the genetic distance of 0.66.

rice; grain type; molecular markers; SRAP; genetic differences

book=5,ebook=13

Q346+.5

A

1006-060X（2016）12-0005-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.002

2016-09-12

2012年廣東省農(nóng)業(yè)科技推廣項(xiàng)目（201201162）

鐘 麗（1994-），女，廣東五華縣人，本科生，生物科學(xué)專業(yè)。

陳兆貴