李志偉，邵士良，李戌鋒，黃嘉勝，趙 波，牟 毅，儲(chǔ)張杰，高 陽(yáng)

（浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

黃腐酸作為飼料添加劑對(duì)泥鰍腸道免疫能力的影響研究

李志偉，邵士良，李戌鋒，黃嘉勝，趙 波，牟 毅，儲(chǔ)張杰，高 陽(yáng)

（浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

在基礎(chǔ)飼料中添加0%、0.5%、1.0%、1.5%和2%濃度梯度的礦源黃腐酸添加劑，0%作為對(duì)照組，研究黃腐酸添加劑對(duì)臺(tái)灣泥鰍腸道免疫功能的影響。實(shí)驗(yàn)選擇健康的體重（6.2±0.2）g的臺(tái)灣泥鰍為試驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行為期60 d的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)泥鰍腸道的免疫酶活性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組泥鰍腸道與對(duì)照組相比，溶菌酶、補(bǔ)體3、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、免疫球蛋白M活性明顯得到提高，尤其是當(dāng)添加水平達(dá)到1%時(shí)，表明飼料中添加黃腐酸能夠提高泥鰍腸道免疫功能。

黃腐酸；泥鰍；腸道免疫

抗生素的使用，在一定程度上減輕了疾病的危害，但藥物殘留問(wèn)題制約了它的使用。健康管理與生物安全已成為目前水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要關(guān)注事項(xiàng)。各種非抗生素飼料添加劑如益生菌、低聚糖、植物提取物或免疫增強(qiáng)劑等已被廣泛用于改善養(yǎng)殖生物的的自身免疫功能，從而提高他們對(duì)病原的抵抗力。

腐殖質(zhì)是一類復(fù)雜的天然大分子芳香族聚合物，其化學(xué)組成極其復(fù)雜，主要組成元素有C、H、O、N、P，是動(dòng)植物殘?bào)w在微生物作用以及一系列復(fù)雜的化學(xué)作用下生成的，在土壤、腐泥、泥炭、褐煤、風(fēng)化煤、動(dòng)植物殘?bào)w、江河湖海中均含有其組成成分[1-2]。腐殖質(zhì)類物質(zhì)包含四個(gè)級(jí)分：黃腐酸、棕腐酸、黑腐酸和腐黑物。黃腐酸，是腐植酸四個(gè)級(jí)分中最活躍的一個(gè)級(jí)分。黃腐酸組成中包含許多活性功能基團(tuán)，包括羧基、羥基、羰基、酚基、醌類和半醌類化合物等等[3]。這些基團(tuán)使黃腐酸具有許多對(duì)動(dòng)物機(jī)體有益的作用，如絡(luò)合重金屬[4]，提高抗氧化能力、抗應(yīng)激能力和免疫力[5]，以及提高抗炎癥和抗病毒[6]等性能。

作為腐植酸類物質(zhì)中的一員，黃腐酸在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)以及醫(yī)藥等方面，具有十分廣泛的應(yīng)用。農(nóng)業(yè)方面，具有提高農(nóng)作物抗逆性和增產(chǎn)的功能[7]，在畜牧業(yè)方面，腐植酸類物質(zhì)能夠提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)率，飼料效率和免疫力，減少疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，提高生產(chǎn)效益[8-11]，在醫(yī)藥方面，具有殺菌消炎及鎮(zhèn)痛作用[12]，將黃腐酸添加到養(yǎng)殖水體中具有凈化水質(zhì)的功效[13-14]，在羅非魚及鯽魚養(yǎng)殖過(guò)程中添加黃腐酸可以提高兩種魚類的生長(zhǎng)及非特異性免疫力[15-16]。然而目前尚沒(méi)有黃腐酸作為飼料添加劑在泥鰍養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究。因此本文通過(guò)在泥鰍基礎(chǔ)飼料中添加適量黃腐酸，研究其對(duì)泥鰍免疫功能的影響，進(jìn)而對(duì)黃腐酸的添加使用效果進(jìn)行深入綜合的評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)所用黃腐酸為褐煤黃腐酸，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所（純度為99.3%，分子量1127，碳含量56.2%）。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組泥鰍飼料為人工配制的基礎(chǔ)飼料，實(shí)驗(yàn)組飼料是在基礎(chǔ)飼料配方中添加0%、0.5%、1.0%、1.5%和2%的黃腐酸，兩組飼料均為顆粒飼料。基礎(chǔ)飼料營(yíng)養(yǎng)水平為魚粉21%、豆粕36%、小麥麩皮7%、菜籽餅4%、花生油2%、玉米17%、磷酸二氫鈣1.8%、維生素預(yù)混料0.12%、微量元素預(yù)混合飼料0.08%、羧甲基纖維素鈉1%、麥飯10%。過(guò)飽食量喂食1 h后，將剩余的飼料取出烘干，稱量，計(jì)算飼料的轉(zhuǎn)化率。

泥鰍初始體重（6.2±0.1）g，選體質(zhì)健壯、規(guī)格相近的泥鰍450尾，隨機(jī)分配于15個(gè)20 L水箱中，用4個(gè)12 W 4孔充氧機(jī)24 h連續(xù)充氣，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)水族箱放泥鰍30尾。正式試驗(yàn)周期為60 d，每天定時(shí)投餌（08：00、18：00），投喂量為目視飽食。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水溫保持在24±1℃，溶氧5.0～6.0 mg/L，pH 7.1±0.2，氨氮濃度低于0.06 mg/L，亞硝酸鹽濃度低于0.02mg/L，每天換水1/3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，從每個(gè)重復(fù)組隨機(jī)取10尾泥鰍，用MS-222（Sigma-Aldrich）麻醉。魚的表面用70%乙醇消毒，用手術(shù)刀切除幽門盲囊與肛門前大約1 cm之間的小腸，并用無(wú)菌鉗剝離粘液和糞便，用液氮冷凍后放置在-80℃超低溫冰箱中保存。分析時(shí)，取出樣品化凍，以10倍的冰凍去離子水低溫條件下（℃）制成勻漿后,以3000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行溶菌酶，補(bǔ)體3，免疫球蛋白M，堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的測(cè)定。酶活性的測(cè)定采用上海常斤生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定。

數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Tukey’s檢驗(yàn)用于各組間的比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果分析

腸道溶菌酶活性隨著黃腐酸濃度增加而增加（圖1）。當(dāng)黃腐酸濃度高于1.0%時(shí)，溶菌酶含量顯著提高相對(duì)于對(duì)照組和0.5%添加組（P＜0.05），而對(duì)照組和0.5%添加組之間沒(méi)有差異（P＞0.05）。酸性磷酸酶活性變化趨勢(shì)與溶菌酶一致（圖2），免疫球蛋白M含量隨黃腐酸濃度增加而增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著（P＜0.05），在1.5%添加水平時(shí)達(dá)到最高，而在2.0%時(shí)又有所降低（圖3）。當(dāng)黃腐酸含量達(dá)到1.0%以上時(shí)，補(bǔ)體3含量顯著高于對(duì)照組和0.5%添加組（P＜0.05），在2.0%添加水平達(dá)到最高（圖4）。堿性磷酸酶活性隨黃腐酸添加量增加而增加，實(shí)驗(yàn)組活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），并在2.0%添加水平達(dá)到最高（圖5）。

圖1 不同黃腐酸添加水平對(duì)泥鰍腸道溶菌酶活性的影響Fig.1 Effects of fulvic acid on intestinal lysozyme activities of loach

圖2 不同黃腐酸添加水平對(duì)泥鰍腸道酸性磷酸酶活性的影響Fig.2 Effects of fulvic acid on intestinal acid phosphatase activities of loach

圖3 不同黃腐酸添加水平對(duì)泥鰍腸道免疫球蛋白M含量的影響Fig.3 Effects of fulvic acid on intestinal IgM content of loach

圖4 不同黃腐酸添加水平對(duì)泥鰍腸道補(bǔ)體3含量的影響Fig.4 Effects of fulvic acid on intestinal complement 3 of loach

圖5 不同黃腐酸添加水平對(duì)泥鰍腸道堿性磷酸酶活性的影響Fig.5 Effects of fulvic acid on intestinal alkaline phosphatase activities of loach

3 討論

腐植酸類物質(zhì)具有特殊的結(jié)構(gòu)性能和生物活性,在植物生長(zhǎng)中起到了奇特的作用。我國(guó)在20世紀(jì)70年代曾掀起腐植酸類物質(zhì)的研究和應(yīng)用熱潮,主要是解決當(dāng)時(shí)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)肥料的短缺。黃腐酸結(jié)構(gòu)中具有的醌基，羥基、羧基、酚羥基等多種活性基團(tuán)，在動(dòng)植物機(jī)體的新陳代謝及氧化還原過(guò)程起到了很重要的作用，決定了腐植酸特殊的生物活性和較高的吸附能力、緩沖、催化能力[17]。腐植酸等物質(zhì)對(duì)消炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗菌、抗?jié)冇忻黠@的作用[18]。

作為一種飼料添加劑，黃腐酸已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，用于增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，減少疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[8]。而黃腐酸在水產(chǎn)動(dòng)物免疫方面的研究較少，在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到黃腐酸添加組的泥鰍腸道溶菌酶活性和酸性磷酸酶得到顯著提高，尤其是當(dāng)黃腐酸添加量達(dá)到1%以上時(shí)。實(shí)驗(yàn)證明高濃度的腐植酸添加量，可以提高血清溶菌酶水平[19-21]，與我們所觀察到的結(jié)果一致。ABDELWAHAB等[22]也證實(shí)飼料中添加腐植酸可以提高鯉魚的生長(zhǎng)與溶菌酶活性，最優(yōu)添加量是0.8%。這與我們實(shí)驗(yàn)中的添加水平有一定差別，一方面可能是由于我們添加了黃腐酸，另一方面是由于魚種的差別。溶菌酶是存在于魚類的血清、黏液及吞噬細(xì)胞中的一種水解酶，對(duì)各種病原微生物具有重要的防御作用[23]。黃腐酸同時(shí)也顯著增加了泥鰍腸道堿性磷酸酶的活性，堿性磷酸酶是動(dòng)物代謝過(guò)程中重要的調(diào)控酶，作為一種非特異性磷酸水解酶，它能催化磷酸單酯的水解和磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，對(duì)動(dòng)物的生存具有重要的意義[24]。烏蘭等[14]在鯽魚飼料中添加0.3%水平黃腐酸，發(fā)現(xiàn)鯽魚的堿性磷酸酶活性，溶菌酶活性都得到顯著提高，酸性磷酸酶活性也略有提高但效果不明顯，這與我們實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到的結(jié)果基本一致。趙杰等[25]認(rèn)為在中國(guó)對(duì)蝦飼料中添加0.10%～0.20%生化黃腐酸，可提高對(duì)蝦溶菌酶活性，增強(qiáng)了對(duì)蝦免疫力，提高了對(duì)蝦成活率。說(shuō)明黃腐酸可以一定程度上提高水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫相關(guān)酶活性。

腐植酸對(duì)動(dòng)物有免疫增強(qiáng)作用,在免疫過(guò)程中抗原物質(zhì)攝取、細(xì)胞免疫和體液免疫各階段均有促進(jìn)作用[18]。黃腐酸在腐植酸物質(zhì)中生物活性最高，毒性小，研究證明黃腐酸在體液水平和細(xì)胞水平均有一定的雙向免疫調(diào)節(jié)作用。常啟發(fā)等[5]試驗(yàn)報(bào)道稱，日糧中添加黃腐酸可顯著提高生長(zhǎng)豬血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量和血清中免疫球蛋白M的含量。高金崗等[26]試驗(yàn)證明，黃腐酸可提高小鼠的體液免疫功能，使抗體形成增加，對(duì)細(xì)胞免疫無(wú)顯著影響。薄芯等[27]指出，黃腐酸可以提高動(dòng)物機(jī)體的特異性和非特異性免疫力，抵抗外來(lái)病菌的侵入，降低機(jī)體發(fā)生病變的可能性。黃腐酸可以改善動(dòng)物腸道免疫功能而增強(qiáng)對(duì)病原菌的抵抗力如大腸桿菌[28]。NAKAGWA等[29]發(fā)現(xiàn)用腐植質(zhì)提取物喂養(yǎng)香魚可以有效的預(yù)防黃桿病毒感染。

同時(shí)，黃腐酸通過(guò)改善動(dòng)物的免疫功能和代謝能力而促進(jìn)各種動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育及降低應(yīng)激反應(yīng)。用添加黃腐酸的飼料喂養(yǎng)劍尾魚，可以降低劍尾魚的應(yīng)激反應(yīng)[30]。投喂腐植酸可以減輕鯉魚因密度脅迫引起的綜合癥。腐植酸類物質(zhì)還可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄控制生物轉(zhuǎn)化，抗氧化以及抗應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)修飾相關(guān)的酶活性[31-32]。

在本實(shí)驗(yàn)中，泥鰍腸道免疫酶活性得到明顯改善，但其具體的作用機(jī)制還不清楚。我們推測(cè)黃腐酸可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)非特異性免疫力，對(duì)病原微生物產(chǎn)生抗性；同時(shí)黃腐酸具有很強(qiáng)的吸附性和絡(luò)合性，可有效吸附飼料中及消化道代謝過(guò)程所產(chǎn)生的各種有毒有害物質(zhì)，并在腸道黏膜形成保護(hù)層而增強(qiáng)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)功能，從而減少動(dòng)物腸道炎癥的發(fā)生和消化疾病。鑒于黃腐酸的免疫增強(qiáng)作用，及其無(wú)毒害、無(wú)殘留的特性，可在一定范圍內(nèi)代替抗生素,用作防病藥劑，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

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Effects of Fulvic Acid on Intestinal Immunity of Juvenile Loach Paramisgurnus dabryanus(Sauvage)

LI Zhi-wei,SHAO Shi-liang,LI Xu-feng,et al
(Fishery School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

A 60-day feeding trial was conducted to determine the effect of dietary fulvic acid supplements on intestinal immune enzyme activity of juvenile loach(initial weight of 6.2±0.2 g)reared in experimental aquaria.Five test diets containing 0%,0.5%,1.0%,1.5%and 2%fulvic acid were randomly assigned to three aquaria,respectively.At the end of the experiment,lysozyme,addiment C3,immunoglobulin M,acid phosphatase activity and alkaline phosphatase activity were significantly elevated with concomitant increasing levels of dietary fulvic acid(P<0.05),especially when the additive level was above 1.0%.These results indicate that fulvic acid could improve intestinal immunity of juvenile loach.

fulvic acid;Paramisgurnus dabryanus;intestinal immunity

S963.5

A

1008－830X(2016)05－0379－05

2016-06-20

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目（2015R411010）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201510340010）；浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)省一流學(xué)科開放課題（20160010）

李志偉（1994-），男，山東煙臺(tái)人，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖.

高陽(yáng)，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖工藝與技術(shù).E-mail:gaoyang-82@163.com