陳 舒，陳若寒

(福建警察學(xué)院 計(jì)算機(jī)與信息安全管理系，福建 福州 350007)

腫瘤癌變細(xì)胞FISH圖像分析系統(tǒng)的研究

陳 舒，陳若寒

(福建警察學(xué)院 計(jì)算機(jī)與信息安全管理系，福建 福州 350007)

腫瘤癌變細(xì)胞FISH圖像分析系統(tǒng)中，需要解決粘連細(xì)胞核的分割問題。FISH屬于新興技術(shù)，產(chǎn)生的是特殊的熒光彩色細(xì)胞圖，現(xiàn)有細(xì)胞圖像分析方法并不適用。文章創(chuàng)新設(shè)計(jì)了基于深度凹陷檢測和構(gòu)造自然凹陷力的方法，分離粘連細(xì)胞核。首先，針對(duì)參差不齊的實(shí)驗(yàn)成像，在RGB模型下結(jié)合統(tǒng)計(jì)思想，將圖像分為三類，分別進(jìn)行預(yù)處理。繼而，利用融合了K-means聚類算法的改進(jìn)馬爾科夫隨機(jī)場(MRF)方法，將細(xì)胞核與癌變信號(hào)點(diǎn)進(jìn)行有效提取。在此基礎(chǔ)上，利用幾何原理，創(chuàng)新設(shè)計(jì)了一套粘連細(xì)胞核分離算法。最后，給出細(xì)胞核快速計(jì)數(shù)和信號(hào)點(diǎn)提取方法。該系統(tǒng)設(shè)計(jì)基本完整，并達(dá)到預(yù)期效果。

FISH圖像；細(xì)胞核提取；MRF模型；細(xì)胞核粘連；自然凹陷力

0 引言

較多研究表明，癌變細(xì)胞中都存在HER2蛋白的過表達(dá)或基因擴(kuò)增現(xiàn)象。當(dāng)前的檢測技術(shù)有很多種，其中的FISH技術(shù)雖是一項(xiàng)新興技術(shù)但已經(jīng)被公認(rèn)為業(yè)界的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[1-2]。

經(jīng)過FISH技術(shù)處理后產(chǎn)生的腫瘤癌變細(xì)胞圖像中，包含三個(gè)主要成分：背景(黑色)、細(xì)胞核(藍(lán)色)、信號(hào)點(diǎn)(紅色和綠色)。通過統(tǒng)計(jì)、分析細(xì)胞核與信號(hào)點(diǎn)的個(gè)數(shù)，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)HER2蛋白擴(kuò)增現(xiàn)象的檢測。

1 預(yù)處理

FISH圖像中，具有研究價(jià)值的區(qū)域恰好與RGB顏色模型的三個(gè)通道相吻合，不需要進(jìn)行復(fù)雜的映射或者換算，所以選用RGB模型來進(jìn)行設(shè)計(jì)。通過批量觀察以及相應(yīng)資料的查閱，F(xiàn)ISH技術(shù)呈現(xiàn)的細(xì)胞核大致具有3個(gè)特點(diǎn)：邊緣模糊(熒光強(qiáng)度不同)、核外輪廓各異(探針手工著色)、核內(nèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜(孔洞)，需要進(jìn)行預(yù)處理使得圖像呈現(xiàn)最佳效果，從而簡化算法。

1.1 FISH圖像分類

首先，根據(jù)成像的熒光效果，將圖像分為三類：(1)弱熒光信號(hào)圖；(2)暈染嚴(yán)重信號(hào)圖；(3)理想信號(hào)圖。分別如圖1(a)、(b)、(c)所示。在專家指導(dǎo)下進(jìn)行手工分類作為訓(xùn)練樣本，得出圖像在藍(lán)色通道上的分布規(guī)律，借助統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，進(jìn)行自動(dòng)分類。

圖1 三類腫瘤癌變細(xì)胞FISH圖像示例

1.2 非理想圖片的改善

需要對(duì)弱熒光圖進(jìn)行增強(qiáng)，對(duì)暈染現(xiàn)象進(jìn)行去除。

1.2.1 弱熒光圖自適應(yīng)增強(qiáng)

(1)原圖像進(jìn)行疊加，I=1.5×I(這步操作的實(shí)質(zhì)是對(duì)亮度進(jìn)行疊加)；

(2)重新判斷是否為弱熒光，如果是，則重新轉(zhuǎn)入步驟(1)，否則停止。實(shí)驗(yàn)效果如圖2所示。

圖2 弱熒光信號(hào)圖自適應(yīng)增強(qiáng)的前后對(duì)比

1.2.2 暈染現(xiàn)象的自動(dòng)去除

(1)將判別為“暈染嚴(yán)重”的原始圖像轉(zhuǎn)化為藍(lán)色亮度圖；

(2)運(yùn)用Otsu法進(jìn)行閾值分割，目標(biāo)標(biāo)記為1(白)，背景標(biāo)注為0(黑)；

(3)填補(bǔ)小于閾值Pc個(gè)像素點(diǎn)的連通區(qū)域(孔洞)；

(4)去除小于閾值Pc個(gè)像素點(diǎn)的連通區(qū)域(非細(xì)胞核區(qū)域)；

(5)將標(biāo)記為目標(biāo)的區(qū)域恢復(fù)成RGB圖，其他部分保持黑色背景；

(6)重新判斷是否暈染嚴(yán)重，如果是，則重新轉(zhuǎn)入步驟(2)，否則停止。實(shí)驗(yàn)效果如圖3。

圖3 嚴(yán)重暈染現(xiàn)象去除前后對(duì)比圖

其中Pc默認(rèn)為原圖總像素點(diǎn)的4%，這個(gè)百分比是根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)效果得出的經(jīng)驗(yàn)值，表示該圖片中的細(xì)小孔洞，可以自適應(yīng)各種尺寸的原始圖像。

2 FISH圖像細(xì)胞核的提取

2.1 傳統(tǒng)方法

對(duì)細(xì)胞核提取的常用方法主要依據(jù)四類原理，分別是：閾值分割、邊緣檢測、傳統(tǒng)區(qū)域思想以及基于特殊算法的理論[3-4]。

閾值分割雖然快速簡便、不需要先驗(yàn)知識(shí)，卻沒有考慮與鄰域像素點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性，分割較為粗糙，容易發(fā)生誤判；邊緣檢測雖然是基于各個(gè)像素點(diǎn)與其鄰域的差異，但是細(xì)胞核內(nèi)熒光信號(hào)產(chǎn)生了大量的梯度變化，給真實(shí)邊緣的檢測增加了困難；傳統(tǒng)區(qū)域思想需要先驗(yàn)知識(shí)并對(duì)圖像有一定要求，且不考慮空間信息，容易造成過分割；而基于特殊算法的理論，則因?yàn)槠涮囟ǖ膽?yīng)用條件、復(fù)雜的參數(shù)或?qū)D像計(jì)算量的要求等，在FISH圖像的細(xì)胞核提取中并不適用。

2.2 本文方法

綜合以上算法的優(yōu)缺點(diǎn)，本文考慮到像素點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)，選取馬爾科夫隨機(jī)場(MRF)[5-7]與無監(jiān)督的聚類算法相結(jié)合來進(jìn)行圖像分割，提取FISH圖像的細(xì)胞核。

從算法計(jì)算量和精度的角度考慮，在MRF建模中，選用二階8-鄰域系統(tǒng)的Potts模型作為標(biāo)記場模型，有限高斯混合模型(FGMM)建立觀測場，迭代條件模式(ICM)作為最優(yōu)化分割算法，其中Potts模型中的勢(shì)函數(shù)β改進(jìn)為可變勢(shì)函數(shù)βb。

2.2.1 可變勢(shì)函數(shù)

勢(shì)函數(shù)β的大小對(duì)分割結(jié)果影響很大。以圖4a為例進(jìn)行分割，選取其中β=0.5和β=5的情況，分割結(jié)果如圖4(b)和圖4(c)。

圖4 圖像在不同勢(shì)函數(shù)作用下的分割結(jié)果

顯然，當(dāng)勢(shì)函數(shù)β增大時(shí)，標(biāo)記場就越占主導(dǎo)，區(qū)域性就越好，分割結(jié)果細(xì)節(jié)也就越差；當(dāng)勢(shì)函數(shù)β變小時(shí)，標(biāo)記場的影響就弱了，觀測場占的比重變大，分割結(jié)果細(xì)節(jié)信息豐富，區(qū)域性差。由此引入可變勢(shì)函數(shù)βb，符合“前期著重在區(qū)域性的控制，后期集中在細(xì)節(jié)信息的判斷”的規(guī)律，勢(shì)函數(shù)應(yīng)該是逐漸變小的。

綜上所述，設(shè)計(jì)可變勢(shì)函數(shù)如下：

令初始勢(shì)函數(shù)β=1，總迭代次數(shù)限制為maxIter，當(dāng)前迭代次數(shù)為Iter，則當(dāng)Iter

(1)

上式保證在迭代次數(shù)Iter增加時(shí)，勢(shì)函數(shù)βb是緩慢變小的，并且不會(huì)偏離最初由經(jīng)驗(yàn)確定的β值太多。

2.2.2FISH圖像細(xì)胞核的提取具體步驟

(1)將原始圖像轉(zhuǎn)化為藍(lán)色亮度圖;

(2)設(shè)定實(shí)驗(yàn)圖像分類數(shù)K=2，初始勢(shì)函數(shù)β=1，最大迭代次數(shù)maxIter=10；

(3)應(yīng)用K-means聚類算法得到初始分割；

(4)估計(jì)觀測場參數(shù)μ和σ2；

(5)計(jì)算FGMM模型建立的觀測場能量；

(6)計(jì)算Potts模型建立的標(biāo)記場能量；

(7)根據(jù)能量最小原則，估計(jì)新的分割；

(8)判斷是否滿足迭代終止條件(MAP準(zhǔn)則和最大迭代次數(shù))，滿足則算法停止，得到最佳分割，否則更新勢(shì)函數(shù)βb的值，并重新轉(zhuǎn)入步驟(3)。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)效果

分別用Otsu自動(dòng)閾值法、傳統(tǒng)的K-means聚類算法以及本文算法對(duì)FISH細(xì)胞圖像進(jìn)行分割，效果如圖5所示?？梢钥闯?，本文算法比前兩種產(chǎn)生的分割結(jié)果更加連續(xù)，且錯(cuò)判產(chǎn)生的孔洞現(xiàn)象更少。這說明：融合了MRF模型的K-means聚類分割方法，在兼顧了區(qū)域完整性的同時(shí)較好地保有了細(xì)節(jié)信息。而引入可變的勢(shì)函數(shù)βb的優(yōu)勢(shì)，在前文已有分析。在判定為細(xì)胞核的一些區(qū)域內(nèi)，仍然存在一些細(xì)小的孔洞，用前文處理暈染圖片時(shí)使用的方法修復(fù)，效果如圖6所示。

圖5 三種算法對(duì)細(xì)胞核提取效果比較

圖6 本文算法對(duì)細(xì)胞核提取并修復(fù)

3 粘連細(xì)胞核的分離

對(duì)粘連細(xì)胞核分離的常用方法主要依據(jù)三類原理，分別是：基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)、基于形狀特征以及特定理論的方法。

3.1 傳統(tǒng)方法

當(dāng)目標(biāo)粘連緊密時(shí)，應(yīng)用基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的方法通常得不到理想的種子點(diǎn)個(gè)數(shù)。

基于形狀特征原理，主要是采用尋找凹點(diǎn)進(jìn)而分離的方法。將細(xì)胞核的粘連方式分為串聯(lián)和并聯(lián)兩類，根據(jù)每個(gè)區(qū)域凹點(diǎn)奇偶性或者其他準(zhǔn)則，來判斷屬于哪一類粘連。然后運(yùn)用不同的凹點(diǎn)匹配策略，進(jìn)行凹點(diǎn)連線劃分。但大部分的方法并沒有考慮更加復(fù)雜的串并聯(lián)混合情況，F(xiàn)ISH細(xì)胞核恰屬于復(fù)雜粘連情況，同時(shí)，F(xiàn)ISH細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，容易出現(xiàn)“假凹點(diǎn)”。

基于特定理論的方法中，比較適合FISH圖像復(fù)雜結(jié)構(gòu)的是文獻(xiàn)[8]中提出的基于水平集和隨機(jī)霍夫圓檢驗(yàn)方法來分離原生質(zhì)細(xì)胞核。但該算法融入了水平集算法，需要設(shè)定的參數(shù)非常多，隨著粘連細(xì)胞核個(gè)數(shù)的增加和粘連情況的復(fù)雜，相應(yīng)的參數(shù)也更加難以全面設(shè)置，并且需要用到統(tǒng)計(jì)學(xué)的霍夫投票法決定區(qū)域的分割歸屬問題，計(jì)算量較大，影響了總體分析效率，故不采用。此外，其他文獻(xiàn)中基于主動(dòng)輪廓模型[9-10]和圖論[11-12]等方法的改進(jìn)，都因計(jì)算量比較大，不予采用。

3.2 本文方法

在Harris和Susan算法的基礎(chǔ)上，改進(jìn)設(shè)計(jì)出“深度凹陷點(diǎn)”的檢測方法，尋找因粘連造成的真正凹陷，同時(shí)判斷出粘連現(xiàn)象的存在與否。接著，創(chuàng)新引入“自然凹陷力”的概念，令深度凹陷點(diǎn)的凹陷有規(guī)律有方向地加深，并逐漸產(chǎn)生區(qū)域斷裂，最終實(shí)現(xiàn)粘連的分離。

3.2.1 深度凹陷點(diǎn)檢測

本文將角點(diǎn)分為以下4種點(diǎn)情況：鈍角凸點(diǎn)、銳角凸點(diǎn)、輕微凹陷點(diǎn)、深度凹陷點(diǎn)。本文定義的深度凹陷點(diǎn)必須滿足以下條件：以該角點(diǎn)作為圓形模板的中心，角點(diǎn)的兩條線段在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)構(gòu)成的夾角必須大于225°。

本文設(shè)計(jì)的深度凹陷檢測方法：

(1)設(shè)FISH細(xì)胞核二值圖I中，目標(biāo)(細(xì)胞核區(qū)域)標(biāo)記為1，背景標(biāo)記為0，同時(shí)構(gòu)造半徑R=5的圓形模板M，模板內(nèi)標(biāo)記為1的像素點(diǎn)總個(gè)數(shù)為MMAX；

(2)利用Harris角點(diǎn)檢測算法對(duì)I進(jìn)行掃描，得到一個(gè)角點(diǎn)集合J(j1,j2,...,jn)；

(3)將圓形模板M的中心與J(j1,j2,...,jn)逐點(diǎn)重合；

(4)借鑒Susan算法的思想，得到每一個(gè)角點(diǎn)位置上的USAN值MUSAN；

(5)當(dāng)MUSAN>5/8×MMAX時(shí)，該角點(diǎn)判定為深度凹陷點(diǎn)，存入集合H中，用于下一階段運(yùn)算。

3.2.2 粘連判斷

當(dāng)某個(gè)目標(biāo)連通區(qū)域內(nèi)存在深度凹陷點(diǎn)時(shí)，該區(qū)域存在粘連現(xiàn)象，需要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離，否則是獨(dú)立細(xì)胞核。

3.2.3 自然凹陷力

設(shè)想：在現(xiàn)實(shí)世界中，要讓這些粘連的細(xì)胞核產(chǎn)生分離，可以對(duì)每一個(gè)深度凹陷處施加作用力，要求該作用力的大小一致，方向順應(yīng)每個(gè)凹陷處的凹陷方向，這樣在凹陷處就會(huì)不斷地加深凹陷程度，粘連的細(xì)胞核們也會(huì)逐漸被擠壓得分離開。當(dāng)某幾處作用力匯集到一點(diǎn)時(shí)，該局部的粘連區(qū)域就被分離；當(dāng)圖像中所有深度凹陷處施加的作用力都匯集到某一處時(shí)，則粘連部分被完全分離。

為了滿足實(shí)時(shí)性的需求，本文采用純幾何的線性思想來模擬自然凹陷力的作用，如圖7所示。

圖7 本文設(shè)計(jì)的自然凹陷力作用示意圖

本文設(shè)計(jì)的自然凹陷力具體作用過程為：

(1)取深度凹陷點(diǎn)集合H(H1,H2,...,Hn)；

(2)定位至其中一點(diǎn)Hi(i=1,2...,n)，以該點(diǎn)為圓心、R=8(多次實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)值)為半徑構(gòu)造一個(gè)圓，設(shè)該圓交Hi兩條邊的交點(diǎn)分別為J1和J2；

(4)逐個(gè)定位至H中的其他點(diǎn)，重復(fù)步驟(2)和(3)，遍歷一輪后，將產(chǎn)生的集合H′作為新的凹陷點(diǎn)集合H，完成一輪自然凹陷力作用；

(5)定位至更新過的Hi點(diǎn)，重復(fù)步驟(2)～(4)，直至新產(chǎn)生的Hi′不再在目標(biāo)內(nèi)時(shí)，停止Hi點(diǎn)的繼續(xù)凹陷，跳至H中的其他點(diǎn)繼續(xù)操作，直至所有的H′都在背景中時(shí)(表示粘連產(chǎn)生的凹陷區(qū)域都完成分離)，停止所有操作。

3.2.4 本文粘連分離方法

(1)讀取一張?jiān)糉ISH細(xì)胞核圖Iy；

(2)利用前文設(shè)計(jì)的方法，將Iy分類并預(yù)處理為理想圖I，使用前文設(shè)計(jì)的細(xì)胞核提取方法，將I中的細(xì)胞核提取出來，并將圖像轉(zhuǎn)化為二值圖I0；

(3)對(duì)I0做邊界提取，記錄目標(biāo)初始邊緣ED0；

(4)利用半徑R=3的近圓形結(jié)構(gòu)元素SE，對(duì)I0圖像做腐蝕運(yùn)算，分離輕微粘連的細(xì)胞核；

(5)利用前文設(shè)計(jì)的“深度凹陷檢測方法”，檢測出當(dāng)前圖中深度凹陷點(diǎn)，存入集合H；

(6)利用前文“自然凹陷力”，逐點(diǎn)加深H點(diǎn)處的凹陷，最終使得細(xì)胞核粘連區(qū)域全部得以分離；

(7)對(duì)分離后的各個(gè)區(qū)域進(jìn)行連續(xù)粗化運(yùn)算(保持不連通性)，使各個(gè)區(qū)域復(fù)原成原始大小，直至區(qū)域邊緣達(dá)到ED0的極限，且結(jié)果不再變化為止；

(8)對(duì)當(dāng)前二值圖I0做邊界提取，記錄當(dāng)前目標(biāo)的邊緣ED，則ED為細(xì)胞核的分離界線；

(9)將分離界線轉(zhuǎn)化為紅色，疊加于圖像I上，作為輸出結(jié)果。

3.2.5 實(shí)驗(yàn)效果

分別選取“簡單粘連”和“復(fù)雜粘連”的FISH細(xì)胞核圖像進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8、圖9所示，實(shí)驗(yàn)效果理想。

圖8 簡單粘連的分離效果

圖9 復(fù)雜粘連的分離效果

4 細(xì)胞核計(jì)數(shù)和信號(hào)點(diǎn)提取

4.1 細(xì)胞核計(jì)數(shù)

讀取一張經(jīng)過粘連分離后的細(xì)胞核二值圖I0，繼而計(jì)算標(biāo)記為目標(biāo)(標(biāo)記為1)的連通區(qū)域數(shù)，即為細(xì)胞核個(gè)數(shù)。

4.2 信號(hào)點(diǎn)提取

紅色信號(hào)點(diǎn)的提取方法：先將G和B的值減為0，得到R-紅色熒光圖，再通過閾值分割和極限腐蝕法得到幾何中心，用于后續(xù)分析。同理，可用于綠色信號(hào)點(diǎn)的提取。

5 結(jié)論

系統(tǒng)主要實(shí)現(xiàn)4個(gè)功能：(1)FISH圖像預(yù)處理；(2)FISH細(xì)胞核的提??；(3)粘連細(xì)胞核的分離；(4)細(xì)胞核技術(shù)和信號(hào)點(diǎn)提取。上述設(shè)計(jì)，都在滿足精確度和視覺效果要求的范圍內(nèi)，盡可能構(gòu)造計(jì)算量小、直觀性強(qiáng)的方法。但仍存在著不足：無法實(shí)現(xiàn)某些特殊情況下的粘連分離，比如在細(xì)胞核嚴(yán)重團(tuán)簇、細(xì)胞核發(fā)生多層粘連時(shí)，內(nèi)層細(xì)胞核相互擠壓，沒有形成凹陷，使之無法分離。這有待進(jìn)一步改善。

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Research on the FISH image analysis system of tumor cell

Chen Shu，Chen Ruohan

(Department of Computer and Information Security Management，F(xiàn)ujian Police College,Fuzhou 350007， China)

In FISH image analysis system, the segmentation of the cell nucleus is needed. FISH is a new technology, it is a special fluorescent color cell image, the existing cell image analysis method is not applicable. In this paper, we design a method based on deep depression detection and constructing the natural sag force to separate the adhesion nucleus. Firstly, according to the different experimental imaging, the images are divided into three kinds according to the RGB model, and the images are preprocessed. Then, using the improved Markov Random Field (MRF) method with the integration of K-means clustering algorithm, to extract nuclei and carcinogenesis signal points. On this basis, using geometric principles, a set of adhesion cell nuclear separation algorithm is designed. In the end, the method of nuclear fast counting and signal point extraction is presented. The design of the system is basically complete, and achieve the desired results.

FISH image；nucleus extraction；MRF model；nucleus adhesion；natural depression force

R857.3;TP391

A

10.19358/j.issn.1674- 7720.2017.01.015

陳舒，陳若寒. 腫瘤癌變細(xì)胞FISH圖像分析系統(tǒng)的研究[J].微型機(jī)與應(yīng)用，2017,36(1)：48-51，55.

2016-10-20)

陳舒(1988-)，女，碩士研究生，助教，主要研究方向：圖像處理，模式識(shí)別。

陳若寒(1987-)，男，碩士研究生，助教，主要研究方向：圖像處理，模式識(shí)別。