劉 暢，鄭云昊，劉兆榮，要茂盛（北京大學環(huán)境科學與工程學院，環(huán)境模擬與污染控制國家重點實驗室，北京100871）

人體呼出氣中內(nèi)源性揮發(fā)性有機物篩選研究

劉 暢，鄭云昊，劉兆榮*，要茂盛*（北京大學環(huán)境科學與工程學院，環(huán)境模擬與污染控制國家重點實驗室，北京100871）

人體代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性揮發(fā)性有機物（VOCs）可用作健康狀況的標志物.本研究選擇17～26歲無呼吸系統(tǒng)疾病的高校學生（73人）作為觀察對象，使用氣相色譜-火焰離子化檢測器/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-FⅠD/MS）分析收集到的呼出氣樣本，對呼出氣中VOCs的種類、濃度進行研究，發(fā)現(xiàn)了其5種鹵代物的濃度高于室內(nèi)濃度，其次是室外濃度.其中，在人體呼出氣中1，1-二氯乙烯的濃度為室內(nèi)濃度的近20倍，是室外濃度的近300倍，人體呼出氣是環(huán)境中1，1-二氯乙烯的一個重要源.定量分析健康人呼出氣，對比其與環(huán)境空氣樣本的濃度差異，并進行統(tǒng)計學檢驗，共篩選出1，1二氯乙烯、丙酮、1-己烯、甲基環(huán)己烷、2-戊酮、反-2-戊烯、2，4-二甲基戊烷、3-戊酮、四氯乙烯、對二氯苯、間二氯苯11種特征性內(nèi)源性VOCs.

呼出氣；內(nèi)源性VOCs；無呼吸系統(tǒng)疾病人群；GC-FⅠD/MS

細胞的代謝產(chǎn)物通過其生存的微環(huán)境進入循環(huán)系統(tǒng)，其中絕大部分揮發(fā)性、半揮發(fā)性有機物通過肺的氣體交換作用從呼吸中排出體外因此，人的呼吸氣體中包含了一定的個體生理信息，通過檢測人呼吸氣可以對人體健康進行監(jiān)測，對病癥進行診斷，是現(xiàn)代醫(yī)學檢測的一個發(fā)展方向.

呼出氣分析開始于健康人，1971年P(guān)auling等［1］首次利用氣相色譜儀進行健康人人體呼出氣的分析，共檢出200多種揮發(fā)性有機物（VOCs）. 1999年P(guān)hilips等［2］用活性炭吸附濃縮采樣和質(zhì)譜分析的方法，檢測108例健康人人體呼出氣，檢出了3480種揮發(fā)性有機物，每個個體呼出揮發(fā)性有機物約有150～250種，有27種共有VOCs，個體間有一定的差異，揮發(fā)性有機物的成分變化一定程度上能夠反映機體的病理、生理狀態(tài).

國際上對于人體呼出氣中的VOCs成分研究較為豐富，如對于青少年呼出氣中異戊二烯濃度的研究［3］，對于多種物質(zhì)濃度的長期監(jiān)測研究［4］等.此外，對于血液及呼出氣中58種VOCs濃度的定量比較研究也有重要意義，研究表明有多種VOCs同時存在于血液和呼出氣中，多種VOCs在室內(nèi)室外均存在，可依此次篩選內(nèi)源性VOCs和外源性VOCs［5］.也有研究通過對人體呼出氣的分析，將高于背景值50%的VOCs定義為內(nèi)源性VOCs.但是目前的研究仍存在很多不足，定量研究的VOCs的種類局限于碳氫化合物、酮類、酯類、醛類、醇類等，類似研究樣本量小，一般30人左右.由于樣本量限制，入選規(guī)則不限定，故能夠得出的結(jié)論十分有限.

國內(nèi)研究較為貧乏，通過對111例健康人呼出氣進行的檢測分析，篩選出了檢出率最高的20種VOCs［7］；此外利用質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應飛行時間質(zhì)譜（PTR-MS）對健康人呼出氣進行檢測，定性19種離子強度，推測實驗中測得的一些離子為乙醇、丙酮和苯的質(zhì)子化產(chǎn)物，還有相當一部分相近離子強度不能定性.

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應飛行時間質(zhì)譜（PTR-MS）、選擇性離子流管質(zhì)譜（SⅠFT-MS）等在線檢測手段可以實時檢測，因此應用越來越廣泛，但是他的缺點是只能對確定的目標化合物進行檢測，無法探究可能存在的新物質(zhì)類型.目前的疾病診斷絕大多數(shù)依靠物質(zhì)的檢出率，很少在濃度上進行區(qū)分，對于健康人的人體呼出氣的基本成分的定量研究工作十分匱乏.此外，若能將呼出氣組分濃度應用到人體健康監(jiān)測，將會進一步推進整個領(lǐng)域的研究進展.基于此，本研究篩選特定健康人群，利用氣相色譜-火焰離子化檢測器/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-FⅠD/MS）分析呼出氣中VOCs，最大限度定性分析人體呼出氣，找到可能存在的新的物質(zhì)種類，并定量分析健康人呼出氣，對比其與環(huán)境空氣樣本的濃度差異，以發(fā)現(xiàn)更多的特征性內(nèi)源性VOCs.健康人VOC排放清單的建立能夠為疾病早期診斷提供參考.

1 實驗過程

1.1 受試者篩選

隨著年齡的增長，氧化應激水平越來越高［9］，有吸煙史人群、1周內(nèi)有感冒癥狀的患者可能會伴隨急性呼吸道感染等癥狀，也會導致氧化應激水平較高［10］，氧化應激水平較高的人群呼出氣中C4～C20烷烴和單甲基烷烴的檢出率更高.有慢性呼吸道疾病患者，如COPD，哮喘等患者的呼出氣VOCs種類濃度水平也會異于健康人［11］.飲食會影響到呼出氣中丙酮水平，0.5h內(nèi)運動人群呼出氣中異戊二烯的水平高于靜坐人群［12］，飲酒會導致呼出氣中乙醇含量增高.

根據(jù)上述研究，首先制定問卷篩選受試者，年齡在17～26周歲之間，剔除1周內(nèi)有感冒癥狀、1h內(nèi)飲食、0.5h內(nèi)運動、受試前1d飲酒、有吸煙史、有慢性呼吸道疾病病史患者.

受試者根據(jù)調(diào)查問卷選擇，入選標準為：17～26歲環(huán)境學院在校學生，無吸煙史，受試者在采樣前的2h內(nèi)，無飲食行為，1周內(nèi)無呼吸系統(tǒng)疾病癥狀，無慢性呼吸系統(tǒng)疾病.采集受試者的年齡、性別、身高、體重4項基本信息，受試者呼氣前漱口0.5min.

1.2 呼出氣采集

將一次性吹嘴與球形冷凝管及Tedlar采樣袋（5L）相連接，組成基本的采樣裝置.受試者鼻子吸氣，嘴呼氣，按照正常呼吸強度均勻向氣袋中吹入呼出氣，將氣袋吹滿為止.將采集到的呼出氣轉(zhuǎn)移到summa罐（3.2L）中儲存.采樣前，采樣罐內(nèi)部抽負壓，氣袋中樣氣自動吸入采樣罐.

同期采集室內(nèi)外環(huán)境空氣樣本（間隔2h采集1次），采集方法為直接打開summa罐閥門，由于罐內(nèi)抽成真空，形成負壓，環(huán)境空氣會自動抽入罐中.

1.3 呼出氣分析

采用罐采樣-預濃縮-GC-MS/FⅠD分析系統(tǒng)，共定性化合物114種，標樣定量的化合物有97種.

預處理及分析所用的儀器：3100A型多通道采樣罐清洗儀（EntechⅠnstruments Ⅰnc.，美國）；4600型動態(tài)稀釋儀（EntechⅠnstruments Ⅰnc.，美國）；7100型低溫預濃縮儀（EntechⅠnstruments， Ⅰnc.，美國）；7890GC/5973MSD聯(lián)用儀（Agilent公司，美國）.所用的標準氣體：高純氦氣（純度≥99.999%）；高純氮氣（純度≥99.99%）；高純氫氣；壓縮空氣；液氮；混合標氣，用作質(zhì)量控制的4種內(nèi)標化合物（溴氯甲烷、對二氟苯、D5-氯苯、4-溴氟苯）［13］.

采集的環(huán)境樣品首先通過Entech7100A預濃縮系統(tǒng)進行富集濃縮，進樣時對冷阱加熱，使富集的組分迅速氣化進入GC-MSD/FⅠD系統(tǒng)進行分離和定量.GC分析系統(tǒng)采用Dean-Switch模塊，建立了VOC的二維MSD/FⅠD分析方法，采用DB-624和PLOT（AL/KCL）色譜柱進行一級和二級分離，MSD和FⅠD同時檢測，實現(xiàn)一次進樣中完成對C2～C12NMHCs、烷基硝酸酯及鹵代烴的分離和測定.

1.4 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制QA/QC

用氮氣做平行測試，檢測氣袋、summa罐的本底值.

避免呼出氣中高濃度水蒸氣對樣本檢出VOCs有影響，加冷凝管進行冷凝脫除.避免采樣裝置對VOCs吸附，采用呼出氣采集專用的Tedlar采樣袋，并盡快將氣樣轉(zhuǎn)移到summa罐.保證采樣室內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，門窗開閉狀態(tài)不變.

2 結(jié)果與討論

2.1 呼出氣中VOCs的種類

本研究共檢測人體呼出氣樣本73例，其中男性39例，女性34例，與采集人體呼出氣樣本同時期的室內(nèi)空氣樣本3個，室外樣本4個.GC-FⅠD/ MS定量研究97種VOCs.圖1對比了本研究與前人研究的差異，Pauling等［1］沒有進行定性定量的研究，Teshima等［14］，Turner等［15］，Spnal等［16］采用SⅠFT-MS作為分析手段，樣本量小，對目標人群進行長時間的呼出氣研究；Enderby等［4］、Taucher等［17］和Smith等［3］的研究采用SⅠFT-MS作為分析手段，樣本量大，但是物質(zhì)數(shù)只有一兩種，進行短時研究；Lingor等［6］、Mochalski等［5］使用GC-MS進行定性定量的研究，樣本量都在30例左右，定量的VOC只有38種和67種；Phillips等［2］的研究定性VOCs種類比較多，但是沒有進行定量研究.

圖1 各研究組檢測物質(zhì)定性定量種類及樣本量對比Fig.1 Comparison of qualitatively and quantitatively detective substances and sample numbers

從官能團種類看，本研究定量檢測的VOCs共92種，包含碳氫化合物63種，鹵代烴13種，醛類9種，酮類4種，醚類1種，含氮化合物1種.前人研究中檢測的物種僅有碳氫化合物、酮類、醛類、醇類，以及少量的酸類和酯類，未曾報道鹵代烴化合物以及醚類化合物，如圖2所示.

圖2 研究組檢測化合物種類Fig.2 Types of compound each study group detected

C4～C20的碳氫化合物是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物， 可以作為人體氧化應激水平的潛在標志物.脂質(zhì)過氧化反應還會產(chǎn)生烷烴（乙烷和戊烷）、丙二醛和其他醛類、乙醇等.直鏈烷烴類如乙烷、戊烷是不飽和脂肪酸末端氧化的產(chǎn)物在血液中的溶解度非常低，反應幾分鐘后就會排放到呼出氣中，雖然細菌代謝過程中的蛋白質(zhì)分解也是戊烷的來源，但對戊烷總濃度的影響非常小.芳香類化合物，如甲苯、乙苯、二甲苯等可能來自于肝臟，高血糖會抑制肝臟酶（細胞色素P450系統(tǒng)）代謝這些氣體，轉(zhuǎn)而循環(huán)到血液系統(tǒng)中去.

酮類化合物也是人體最常檢測的化合物種類，丙酮是人體產(chǎn)生最多的VOCs之一，它是由脂肪酸b氧化產(chǎn)生乙酰CoA，肝細胞通過過量的乙酰CoA脫羧作用產(chǎn)生丙酮.丙酮的出現(xiàn)是由于胰島素不能把葡萄糖傳輸?shù)郊毎?，若大量丙酮積聚在血液并通過尿液排出體外時會導致酮酸中毒，可作為糖尿病的標志物.

鹵代烴化合物在人體存在的原因也可能是由于近些年人體接觸含氯制品更多，導致在人體富集，還有可能是未曾發(fā)現(xiàn)的生理機理，將無機鹽中的氯離子轉(zhuǎn)化成為含氯的有機物.

2.2 篩選內(nèi)源性VOCs

內(nèi)源性化合物包括無機氣體（如NO，CO）、揮發(fā)性有機化合物VOCs和其他非揮發(fā)性物質(zhì)（如異前列烷，過氧亞硝酸鹽或細胞因子），都可以在呼出氣中檢測到.內(nèi)源性VOCs是由體內(nèi)的各種生化過程產(chǎn)生，維持細胞膜完整性、能量代謝、氧化應激等過程都與揮發(fā)性有機物的產(chǎn)生相關(guān).通過檢測人呼吸氣體中揮發(fā)性、半揮發(fā)性有機物的成分和含量，可以對人體健康進行監(jiān)測，對病癥進行診斷.

由于人體產(chǎn)生這些VOCs，導致呼出氣中可以檢測到的濃度較高，又由于人在室內(nèi)活動時間高于室外，室內(nèi)空間狹小，房間空氣流通差，故室內(nèi)濃度與室外濃度有很大差異.

本研究將人體呼出氣濃度（H）＞室內(nèi)濃度（Ⅰ）＞室外濃度（O）的VOCs定義為內(nèi)源性VOCs，根據(jù)這一原則篩選出內(nèi)源性VOCs 21種.將此21種內(nèi)源性VOCs分為三組，第1組：人體濃度高于室內(nèi)濃度10倍以上的物種有5種，占比24%；第2組：人體濃度高于室內(nèi)濃度3～4倍的有6種，占比28%；第3組：人體濃度高于室內(nèi)濃度1～2倍以上的物種有10種，占比48%.如表1所示.

表1 內(nèi)源性VOCs分組Table 1 Groups of endogenous VOCs

2.3 篩選特征性內(nèi)源性VOCs

本研究發(fā)現(xiàn)的21種內(nèi)源性VOCs中，篩選人體呼出氣濃度平均值高于室內(nèi)濃度3-10倍的VOCs，即第1、2組作為健康人特征性內(nèi)源性VOCs，以便更具有特征性.

篩選出的物種為：1，1-二氯乙烯，丙酮，1-己烯，甲基環(huán)己烷，2-戊酮，反-2-戊烯，2，4-二甲基戊烷 ，3-戊酮，二氯苯，四氯乙烯，對二氯苯.這些物質(zhì)在人體呼出氣中濃度濃度高于室內(nèi)環(huán)境3倍以上，可以推測為人體自身產(chǎn)生的VOCs，而不是從環(huán)境中吸收的.對這些物質(zhì)的人體呼出氣濃度平均值與室內(nèi)空氣濃度平均值進行SPSS統(tǒng)計學檢驗，使用Wilcoxon符號秩檢驗，P＜0.05，有顯著性差異.這些物質(zhì)的濃度平均值（AVE）、最大值（MAX）、最小值（MⅠN）、相對標準偏差（RSD）如表2所示.

首先需要重點關(guān)注的是1，1-二氯乙烯，在人體呼出氣中AVE為4.15μg/m3，室內(nèi)AVE為0.18μg/m3，室外AVE為0.02μg/m3，人體濃度高于室內(nèi)濃度近20倍，室內(nèi)濃度高于室外濃度近10倍，說明人體呼出氣是環(huán)境中1，1-二氯乙烯的一個重要源.同時，我們檢測的73例樣本的1，1-二氯乙烯濃度的標準值（RSD）為0.80，小于1，濃度分布比較平均，離散度并不高，個體間差異不大，說明其為人體呼出氣中比較普遍存在的物質(zhì).間二氯苯在人體呼出氣中AVE為10.15μg/m3，室內(nèi)AVE為3.28μg/m3，室外AVE為1.4μg/m3，對二氯苯在人體呼出氣中AVE為11.15μg/m3，室內(nèi)AVE為3.48μg/m3，室外AVE為1.58μg/m3，也是人體呼出氣中的內(nèi)源性VOC，間二氯苯、對二氯苯在人體產(chǎn)生機理不明確，但是確定有生物累積性，1，1-二氯乙烯在人體的生物累積性不明確.

表2 特征性內(nèi)源VOCs的最大值、最小值、平均值及相對標準偏差Table 2 MAX MIN AVE RSD of significant endogenous VOCs

2-戊酮，反-2-戊烯，3-戊酮三種物質(zhì)可以與人體最常檢出的碳氫化合物戊烷聯(lián)系起來，戊烷產(chǎn)生于人體的脂質(zhì)過氧化反應.Phillips［2］等人的研究中采集的50例樣本中全部檢出戊烷，由于他們的研究中沒有研究含氧化合物，所以不確定是否有戊酮產(chǎn)生.病人和吸煙人群呼出氣中戊烷會有所增加，吸煙人群高可能由于煙霧中的碳氫化合物含量高，也可能是吸煙引起的氧化損傷導致的.已有研究表明，2-戊酮會在糖尿病、禁食、高脂肪攝入人群呼出中含量較高，在使用胰島素治療的病人呼出氣中含量較低［11-12］.

本研究檢出丙酮濃度為1264.63μg/m3，室內(nèi)濃度為95.41μg/m3，室外濃度為13.94μg/m3.前人研究中報道丙酮呼出氣含量在297-830×10-9，平均值477×10-9［4］.本研究濃度值高于以往研究，可能與不同人群的年齡、飲食習慣有關(guān).

3 結(jié)論

3.1 選擇17～26歲無呼吸系統(tǒng)疾病高校學生作為觀察對象，使用GC-FⅠD/MS分析收集到的73例人體呼出氣樣本，定性定量92種VOCs.根據(jù)人體呼出氣濃度（H）＞室內(nèi)濃度（Ⅰ）＞室外濃度（O）的VOCs定義為內(nèi)源性VOCs這一原則，篩選出21種內(nèi)源性VOCs.

3.2 發(fā)現(xiàn)了5種鹵代物在人體呼出氣中濃度高于室內(nèi)濃度，室內(nèi)濃度高于室外濃度.其中，1，1-二氯乙烯，在人體呼出氣中的濃度是室內(nèi)濃度的近20倍，是室外濃度的近300倍，人體呼出氣是環(huán)境中1，1-二氯乙烯的一個重要源.

3.3 根據(jù)人體呼出氣濃度平均值高于室內(nèi)濃度3～10倍的VOCs為特征性內(nèi)源VOCs原則，篩選出包括1，1-二氯乙烯在內(nèi)的11種VOCs，對篩選出的每一種VOC在73例呼出氣樣本及室內(nèi)、室外空氣樣本進行種類、濃度、來源的綜合分析.同時進行SPSS統(tǒng)計學檢驗，使用Wilcoxon符號秩檢驗，P＜0.05，有顯著性差異，表明這11種VOCs可以作為健康人呼出氣的特征性內(nèi)源VOCs.研究數(shù)據(jù)顯示人是重要的VOC的貢獻源，同時VOC清單為疾病診斷提供參考.

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Screening of endogenous volatile organic compounds in human exhaled breath.

LIU Chang， ZHENG Yun-hao， LIU Zhao-rong*， YAO Mao-sheng*（State Key Lab of Environmental Simulation and Pollution Control， College of Environmental Sciences and Engineering， Peking University， Beijing 100871， China）. China Environmental Science，2016，36（10）：3112～3117

Exhaled breath contains thousands of volatile organic compounds （VOCs）， and relevant composition could vary with their health status. A cohort of healthy volunteers （73 students without respiratory disease） was recruited in this work. The breath samples were collected using gas-bag and further analyzed by gas chromatography with mass spectrometric detection and flame ionization detector. Five halides in human exhaled breath were found to have higher concentration levels than those of both indoor and outdoor environments. Among them， 1，1-dichloroethylene concentration in human exhaled breath was detected nearly 20times higher than its indoor air concentration， and about 300 times higher than the outdoor one， which suggests that human breath is an important source of 1，1-dichloroethylene in the environment. By quantitative analysis of exhaled breath of recruited healthy people with parallel comparison with indoor counterparts， eleven endogenous VOCs were detected and can be attributed primarily to humans， including 1，1-Dichloroethene， acetone， 1-hexene， methylcyclohexane， 2-pentanone， trans-2-pentene， 2， 4-dimethylpentane，3-pentanone， C2Cl4， m-dichlorobenzene and p-dichlorobenzene.

exhaled breath；endogenous；endogenous VOCs；healthy people；GC-FID/MS

X18

A

1000-6923（2016）10-3112-06

劉 暢（1991-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向，室內(nèi)環(huán)境與健康.

2016-02-23

科技部支撐計劃“區(qū)域性大氣污染來源識別與預測技術(shù)及應用”（2014BAC06B02）與科技部重點項目（2015CB553401）；環(huán)境模擬與污染控制國家重點實驗室專項經(jīng)費（13Z05ESPCP）

* 責任作者， 劉兆榮， 副教授， zrliu@pku.edu.cn； 要茂盛， 研究員，yao@pku.edu.cn