孫 凱， 陳文華, 2▲， 張 穎， 李 燕， 安夢瑤， 潘瑩瑩， 吳艷娜， 康 毅， 高衛(wèi)真， 婁建石△

(1天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學系，天津 300070； 2寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院藥劑科，寧夏 銀川 750004)

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無創(chuàng)性延遲肢體缺血預適應對心肌梗死大鼠預后的影響*

孫 凱1， 陳文華1, 2▲， 張 穎1， 李 燕1， 安夢瑤1， 潘瑩瑩1， 吳艷娜1， 康 毅1， 高衛(wèi)真1， 婁建石1△

(1天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學系，天津 300070；2寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院藥劑科，寧夏 銀川 750004)

目的： 研究無創(chuàng)性延遲肢體缺血預適應(noninvasive delayed limb ischemic preconditioning，NDLIP)對動物心肌梗死(myocardial infarction, MI)后的心臟功能、心肌形態(tài)以及心肌凋亡等方面的作用。方法: 取45只健康SD大鼠隨機分成3組: MI組：手術結扎動物冠狀動脈左前降支(left anterior descending artery，LAD)，2周后成模；NDLIP組：動物MI模型成功后，每隔1 d進行1次遠端肢體缺血預適應，直至第4、6、8周；假手術(sham)組：作為陰性對照組，心臟LAD只穿線不結扎，不實施NDLIP。將各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，于第4、6、8周末進行心室插管，監(jiān)測血流動力學指標；接著再進行腹主動脈取血、離心，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清Bcl-2和Bax水平；最后再取左心室前壁、勻漿，用ELISA法測定心肌組織線粒體呼吸鏈復合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的含量。結果: 與MI組相比，在實施心肌梗死4、6、8 周后，NDLIP組可使左心室收縮壓顯著升高(P<0.05)，左心室舒張末壓顯著降低(P<0.05)；線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ水平都顯著升高(P<0.05)；血清Bcl-2水平顯著升高(P<0.01)，Bax水平顯著降低(P<0.01)。結論: 大鼠心肌梗死后實施NDLIP干預可改善其血流動力學，促進線粒體呼吸功能，抑制細胞凋亡，從而起到改善預后的作用。

心肌梗死； 無創(chuàng)性延遲肢體缺血預適應； 左心室收縮壓； 線粒體功能； 細胞凋亡

近年來，隨著心血管病危險因素的不良變化以及人口老齡化的加速，使得心血管病發(fā)生率增加。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是當前最常見的心血管疾病，其死亡率逐漸提高且發(fā)病年齡也呈年輕化，主要病因是冠狀動脈粥樣斑塊脫落以及血栓栓塞使心肌組織大面積缺血缺氧而受損。目前心肌梗死的治療手段主要有藥物治療、介入治療及手術治療[1-3]等，雖然這些手段能使阻塞的血管再通、受損的心肌重新恢復血流供應，但是并沒有從根本上改善已受損的心臟功能以及預后。因此，探索一種可以應用于臨床上切實有效的方法或手段具有重要意義。

大量實驗研究表明，心臟缺血預適應(cardiac ischemic preconditioning，CIP)對心臟有一定的保護作用[4-6]，其中肢體缺血預適應(limb ischemic preconditioning，LIP)也可對心臟引發(fā)保護作用，而無創(chuàng)性延遲肢體缺血預適應(noninvasive delayed limb ischemic preconditioning，NDLIP)可長效地保護心臟[7-9]。有關缺血預適應對心肌梗死前的預防性心臟保護作用研究非常多[10-12]，但是到目前為止，對心肌梗死預后的相關研究幾乎沒有。因此，本實驗將對NDLIP干預心肌梗死預后康復的情況進行研究。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗對象 鼠齡相同、體重(250±10)g的SD雄性大鼠45只(SPF級)，實驗動物質(zhì)量合格許可證號為SCXK-(軍)2012-0004，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 0.9% NaCl、25%烏拉坦、肝素鈉、戊巴比妥鈉、蘇木素染液和伊紅染液；Bcl-2試劑盒、Bax試劑盒和線粒體呼吸鏈復合物試劑盒(Hermes Criterion Biotechnology)。

1.3 儀器 BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)、HX-100E小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；L420臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；HZS-H水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)。

1.4 液體配制 肝素鈉注射液：臨用前用生理鹽水配制成1 mL 1.25×106U和1%的溶液，4 ℃，避光保存。1 mL 1.25×106U的肝素鈉注射液用于充滿動脈插管體外抗凝；1%的肝素鈉注射液用于取血時肝素化試管。25%烏拉坦溶液：稱取烏拉坦12.5 g，加三蒸水至50 mL，攪拌使其溶解，室溫保存?zhèn)溆谩?%甲醛溶液：臨用前用雙蒸水將甲醛溶液稀釋成4%溶液，避光，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 心肌梗死模型的建立 大鼠用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉。常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，沿胸骨左緣3 mm處剪開皮膚，鈍性分離前鋸肌和胸大肌。彎止血鉗于胸骨左緣處第4肋間進入胸腔，并迅速沿肋間隙方向撐開止血鉗而鈍性分離肋間肌，右手用另一止血鉗垂直肋間隙撐開肋骨，暴露心臟。左手拇指與食指置于大鼠胸部兩側，中指與無名指置于左肋弓緣下，適當用力快速擠出心臟，此時右手立刻將止血鉗取下，然后迅速在左心耳與肺動脈圓錐交界處平左心耳下緣2 mm進針，以7-0手術縫合線結扎冠狀動脈左前降支(left anterior descending artery，LAD)。進針深度1.5 mm左右，結扎完成后立即將心臟放回胸腔，置入塑料軟管并與注射器連接，迅速對合、捏緊皮膚，抽出胸腔內(nèi)氣體，立即拔管并進行胸外按壓。觀察心電圖，心搏正常且動物呼吸平穩(wěn)后，換用直鉗夾緊對合的皮膚，縫合。傷口消毒，保持體溫在36.5～38 ℃。肌肉注射2×105U青霉素鈉。2周后模型成功。

2.2 無創(chuàng)性肢體缺血預適應模型的建立 用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，以改良的動物無創(chuàng)血壓測試儀自制套管套住大鼠單側后肢根部，脈搏傳感器緊貼在足背動脈上，啟動動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)軟件，連續(xù)監(jiān)測血壓和脈搏，加壓使脈搏消失、肢體遠端體溫下降、皮膚發(fā)紺，即為阻斷股動脈標志，持續(xù)5 min；減壓，脈搏出現(xiàn)、體溫回升、皮膚潮紅，為再灌標志，連續(xù)5 min，共3個循環(huán)，心肌梗死模型成功后開始，每隔1天進行1次遠端肢體缺血預適應直至第4、6、8周。

2.3 血流動力學參數(shù)的測定 大鼠經(jīng)烏拉坦腹腔注射麻醉后，實施右側頸總動脈插管，導管插入右頸總動脈約1～1.5 cm，等脈壓穩(wěn)定后記錄動脈血壓，然后繼續(xù)向心臟方向插入導管，同時觀察壓力曲線，當曲線振幅突然變大且形狀如正弦波形時，表明導管已通過主動脈瓣進入左心室，穩(wěn)定10 min，分別記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。觀察各指標變化情況并記錄心電圖。

2.4 心肌線粒體呼吸鏈復合物含量的測定 各組動物于第4、6、8周實驗結束后，取心臟，放入預冷的生理鹽水中洗去殘血，用濾紙吸干多余水分；用刀片切取100 mg左右的心室肌，放入預冷的勻漿液中，將心肌組織剪碎并研磨成勻漿，然后立即低溫(4 ℃、3 000 r/min離心10 min)分離上清液，然后利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定心肌組織中的線粒體呼吸鏈復合物的含量。

2.5 血清Bcl-2和Bax含量的測定 大鼠在第4、6、8周實驗結束時，腹主動脈取血約5 mL，離心取血清(3 000 r/min離心15 min)，置于-80 ℃保存。采用不同的試劑盒用ELISA法測定各自的含量。

2.6 實驗分組 本實驗分為MI組、NDLIP組和假手術(sham)組，每組15只。

3 統(tǒng)計學處理

所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 18.0軟件計算分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 NDLIP對動物心肌梗死4、6、8周后心臟大體形態(tài)的影響

實施心肌梗死手術2周后可見梗死區(qū)變白，與周圍心肌形成明顯的分界，表明MI造模成功。在實施心肌梗死手術4、6、8 周后，心臟左心室前壁梗死區(qū)域明顯變白，與非梗死區(qū)域有明顯的區(qū)別；另外，觀察心臟的左心室前壁可見明顯變薄，發(fā)白，呈梗死狀，見圖1。心肌組織經(jīng)HE染色后，如圖2所示，MI 4周組可見標本中有大片陳舊性心肌梗死灶，該區(qū)域心肌纖維被增生的纖維組織取代，其余部分心肌纖維排列紊亂且見斷裂、間質(zhì)輕度水腫、充血及少量炎細胞浸潤，未見紅細胞滲出。心外膜水腫、充血及炎細胞浸潤。MI 6周組可見小片陳舊性梗死灶，周邊部分心肌纖維排列紊亂，肌絲斷裂，散在及小灶性炎細胞浸潤，心外膜病理改變同MI 4周組。MI 8周組可見大片新鮮及小片陳舊性梗死，前者水腫及炎細胞浸潤明顯；后者纖維組織增生，周邊個別心肌梗死，炎細胞浸潤，心外膜病理改變同MI 4周組。NDLIP 4周組可見病變減輕，小部分心肌纖維正常，心肌間水腫、少量炎細胞浸潤，心外膜病理改變同MI 4周組。NDLIP 6周組未見大片心肌梗死灶。其余部分心肌纖維排列紊亂且見斷裂明顯、間質(zhì)輕度水腫、充血及炎細胞浸潤，心外膜水腫、充血及炎細胞浸潤。NDLIP 8周組可見外膜下有小片心肌纖維排列紊亂，肌絲斷裂，炎細胞浸潤，外膜病變同MI 4周組但更明顯。Sham 4周組可見外膜下個別心肌梗死，炎細胞浸潤，余心肌大致正常，未見顯著改變，心外膜病理改變同MI 4周組。Sham 6周組可見心肌纖維大致正常，未見顯著改變，心外膜病理改變同MI 4周組。Sham 8周組可見外膜下有小片心肌纖維排列紊亂，肌絲斷裂，炎細胞浸潤。局部心肌纖維見規(guī)律的波紋狀變形，心外膜病理改變同MI 4周組。HE染色顯示MI組、NDLIP組和sham組都可見心外膜損傷，考慮為手術擠壓心臟時對心外膜造成的損傷。

Figure 1. The rat hearts after myocardial infarction. W: weeks.

圖1 心肌梗死4、6、8 周后心臟大體形態(tài)

2 NDLIP對動物心肌梗死4、6、8 周后血流動力學參數(shù)的影響

心肌梗死模型4、6、8 周缺血預適應結束后監(jiān)測動物血流動力學指標。與MI組相比，NDLIP組大鼠的LVSP有所上升，分別升高了16%、20%和12%(P<0.05)。與MI組相比，NDLIP組大鼠的LVEDP明顯降低，分別降低了42%、39%和30%(P<0.05)。與MI組相比， NDLIP組大鼠的+dp/dtmax有所升高，分別升高了20%、20%和7%(P<0.05)。與MI組相比，NDLIP組大鼠的-dp/dtmax有所降低，分別降低了13%、13%和17%(P<0.05)。4、6、8 周組間相互比較無顯著差異，見圖3。

Figure 2.The pathological changes of every experimental group after MI (HE staining, ×200). W: weeks.

圖2 HE染色后，MI組和NDLIP組以及sham組心肌組織的病理學變化

Figure 3.The changes of hemodynamic parameters in every experimental group 4, 6 and 8 weeks (W) after myocardial infarction (MI). Mean±SD.n=5.*P<0.05vsMI group.

圖3 NDLIP對動物心肌梗死4、6、8周后血流動力學參數(shù)改變的結果

3 NDLIP對動物心肌梗死4、6、8 周后心肌線粒體功能的影響

動物實施心肌梗死手術4、6、8周后，與MI組相比，NDLIP組心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的濃度都明顯上升。NDLIP組心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的濃度比MI組分別增加了79%、91%和52%(P<0.01)；NDLIP組心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ的濃度比MI組分別增加了79%、64%和95%(P<0.05)；NDLIP組心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ的濃度比MI組分別增加128%、62%和66%(P<0.05)；NDLIP組心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ的濃度比MI組分別增加了52%、62%和103%(P<0.01)。4、6、8 周組間相互比較無顯著差異，見圖 4。

Figure 4.The changes of mitochondrial respiration chain complexesⅠ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ in every experimental group 4, 6 and 8 weeks (W) after myocardial infarction (MI). Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsMI group.

圖4 NDLIP對動物心肌梗死4、6、8周后心肌線粒體功能的影響

4 NDLIP對動物心肌梗死4、6、8周后凋亡相關蛋白的影響

動物實施心肌梗死手術4、6、8周后，sham組Bcl-2的表達最高，MI組最低，NDLIP組Bcl-2的表達比MI組分別增加了43%、81%和67%(P<0.01)；MI組的Bax表達最高，sham組最低，NDLIP組Bax的表達比MI組分別降低了60%、67%和55%(P<0.01)；sham組的Bcl-2/Bax值最高，NDLIP組比MI組增加了252%、440%和267%(P<0.01)。雖然Bcl-2、Bax均來自血清，但這些凋亡相關蛋白的變化主要來源于心臟。4、6、8周組間相互比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖5。

討 論

急性心肌梗死是冠狀動脈急性缺血缺氧所引起的一類嚴重危害人類身體健康的心血管疾病。近年來，研究者們開始關注心肌梗死患者的預后以及生活質(zhì)量問題。然而關于心臟缺血預適應對心肌梗死患者的預后影響研究卻幾乎沒有，少量文獻從心電ST段變化和心肌酶的表達水平等方面對其進行了描述[13-14]。本實驗采用NDLIP的方法，通過觀察心臟收縮、舒張功能的變化，監(jiān)測心肌細胞線粒體呼吸功能以及心臟心肌凋亡相關蛋白水平等方面研究了NDLIP對心肌梗死預后的影響。

血流動力學指標是動物心功能改變的最重要反映[15]。本實驗通過建立大鼠心肌梗死模型，模擬人心肌梗死狀態(tài)，在大鼠預后過程中給予NDLIP隔天1次進行干預。其血流動力學結果顯示，NDLIP干預后，與MI組相比，LVSP明顯升高，LVEDP明顯降低，其±dp/dtmax絕對值明顯升高，且差異都有統(tǒng)計學顯著性。這就表明NDLIP對大鼠心肌梗死預后有積極的意義，可以顯著改善其心功能。這一結果與高建波等[8]對正常大鼠進行隔天1次、連續(xù)1周 NDLIP所產(chǎn)生的能減輕缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)所致?lián)p傷、減小心肌梗死面積、有強大的心肌保護作用的結果相同。實驗結果顯示，NDLIP不僅對I/R所致的心肌損傷有保護作用，其對急性心肌梗死所致的損傷也有強大的保護作用，對改善心肌梗死的預后有積極的效果。

Figure 5.The serum concentrations of Bcl-2, Bax and Bcl-2/Bax in every experimental group 4, 6 and 8 weeks (W) after myocardial infarction (MI). Mean±SD.n=5.**P<0.01vsMI group.

圖5 NDLIP對動物心肌梗死4、6、8 周后凋亡相關蛋白的影響結果

心肌梗死后線粒體功能障礙主要表現(xiàn)在線粒體呼吸功能喪失和呼吸酶活性降低。而已知有氧真核生物細胞呼吸產(chǎn)生能量的過程絕大部分都是在線粒體呼吸鏈末端細胞色素氧化酶上通過4步單電子將氧還原生成水完成的[16-19]，線粒體呼吸鏈的電子傳遞全程由電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共同作用來完成的。本試驗中，動物實施心肌梗死4、6、8周后，sham組線粒體呼吸鏈復合物的水平最高，MI組最低，但實施NDLIP組的線粒體呼吸鏈復合物水平比MI組有顯著升高，表明實施NDLIP后可增加線粒體呼吸鏈復合物的水平，從而提高細胞的呼吸功能，增加ATP的產(chǎn)生，對改善動物心肌梗死預后有積極作用。

發(fā)生心肌梗死后，梗死區(qū)會同時存在細胞凋亡和壞死，故設法阻斷凋亡信號傳導，減少細胞凋亡是保護心臟的重要手段。細胞凋亡調(diào)控途徑之一就是依賴于線粒體中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax對細胞凋亡起到信號轉(zhuǎn)導和執(zhí)行的作用。近期有研究顯示，Bcl-2/Bax的比值可反映Bcl-2和Bax在細胞凋亡中的作用，若Bcl-2/Bax比值升高，則產(chǎn)生抑制細胞凋亡的作用，反之則會促進細胞凋亡[20-21]。本實驗通過分析Bcl-2和Bax的表達研究NDLIP對線粒體的保護作用。結果顯示，心肌梗死大鼠經(jīng)NDLIP干預后，Bcl-2的表達與MI組相比明顯升高，Bax的表達與MI組相比明顯降低，Bcl-2/Bax的值與MI組相比明顯升高，雖然Bcl-2、Bax均來自血清，但這些凋亡相關蛋白的變化主要來源于心臟。NDLIP可以逆轉(zhuǎn)急性心肌缺血引起的Bcl-2表達減少，說明Bcl-2可以調(diào)節(jié)NDLIP引起的心臟保護作用。同時，NDLIP也降低了Bax的活性。該結果說明NDLIP可以顯著調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達，NDLIP可通過線粒體途徑減少細胞凋亡。

綜上所述，NDLIP可通過改善心臟血流動力學，促進線粒體呼吸功能，抑制細胞凋亡等方面對心肌梗死大鼠起到長期改善預后的作用。且該方法是無創(chuàng)性的，簡單易操作，不良反應小，對于患心肌梗死后病人，具有改善預后機體能力、提高帶病生活質(zhì)量的積極意義，所以在臨床應用方面具有較大的應用潛力和前景。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of noninvasive delayed limb ischemic preconditioning on prognosis of myocardial infarction

SUN Kai1, CHEN Wen-hua1, 2, ZHANG Ying1, LI Yan1, AN Meng-yao1, PAN Ying-ying1, WU Yan-na1, KANG Yi1,GAO Wei-zhen1, LOU Jian-shi1

(1DepartmentofPharmacology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;2PharmacyDepartment,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China.E-mail:jianshilou@126.com)

AIM: To study the effects of noninvasive delayed limb ischemia preconditioning (NDLIP) on animal cardiac function, myocardial morphology and myocardial apoptosis after myocardial infarction (MI). METHODS: Healthy SD male rats [n=45, weighing (250±10) g] were randomly divided into 3 groups: MI group: the animal model of MI was established by surgical ligation of left anterior descending artery (LAD) after 2 weeks; NDLIP group: after the success of the MI animal model, NDLIP was carried out every other day until the 4th, 6th and 8th weeks; sham group: as the negative control group, the animals were taken heart LAD threading but no ligation. All rats were fed conventionally. At the end of the 4th, 6th and 8th weeks, all rats were made ventricular intubation, and then the hemodynamic parameters were recorded. The blood samples were withdrawn from the abdominal aorta and the serum was separated via centrifugation. The serum contents of Bcl-2 and Bax were measured by ELISA. Left ventricular anterior wall was homogenized. The mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ in the myocardial tissues were detected by ELISA. RESULTS: At the end of the 4th, 6th and 8th weeks, compared with MI group, left ventricular systolic pressure in NDLIP group was significantly increased, while left ventricular end-diastolic pressure in NDLIP group was significantly decreased (bothP<0.05). Mitochondrial respiratory chain complexesⅠ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ in NDLIP group were significantly increased (P<0.05). The serum level of Bcl-2 in NDLIP group was significantly increased and Bax level was reduced remarkably (bothP<0.01). CONCLUSION: NDLIP improves the hemodynamic indexes, promotes the mitochondrial respiratory function and inhibits cell apoptosis, thus improving the prognosis of MI.

Myocardial infarction; Noninvasive delayed limb ischemic preconditioning; Left ventricular systolic pressure; Mitochondrial function; Apoptosis

1000- 4718(2017)01- 0116- 07

2016- 06- 23

2016- 10- 16

國家自然科學基金資助項目(No. 81072631)；天津自然科學基金資助項目(No. 09JCZDJC21100)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.019

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