朱震寒， 齊 潔

(1中國人民解放軍第四零一醫(yī)院急診科，山東 青島 266071; 2濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院老年內(nèi)科，山東 濱州 256603)

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依達拉奉通過microRNA-25抑制高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡

朱震寒1△， 齊 潔2

(1中國人民解放軍第四零一醫(yī)院急診科，山東 青島 266071;2濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院老年內(nèi)科，山東 濱州 256603)

目的： 探討依達拉奉通過微小RNA-25 (microRNA-25, miR-25)對高糖誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡的抑制作用及其機制。方法: 將SH-SY5Y細胞用含高濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基和依達拉奉的聯(lián)合培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h。 MTT比色法測定SH-SY5Y細胞存活率；DCFH-DA熒光探針法檢測SH-SY5Y細胞中活性氧簇(ROS)的水平；采用流式細胞術(shù)檢測SH-SY5Y細胞的凋亡率； Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2的表達水平； 實時定量PCR檢測細胞中miR-25的表達水平。為進一步闡明依達拉奉抑制高糖誘導的神經(jīng)細胞凋亡的作用靶點，我們將miR-25抑制劑應(yīng)用于細胞，之后采用caspase-3凋亡試劑盒檢測細胞的凋亡率。結(jié)果: 與對照組相比，高糖誘導后細胞存活率明顯降低，細胞中的ROS水平和細胞凋亡率明顯升高，Bax的表達明顯增加，Bcl-2的表達明顯降低， miR-25的表達水平也明顯降低。給予依達拉奉治療之后，細胞存活率明顯升高，ROS含量和細胞凋亡率明顯降低，Bax的蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高，miR-25的表達水平亦明顯升高。進一步給予miR-25抑制劑后，caspase-3的水平明顯升高，此時同時給予依達拉奉后并不能抑制高糖引起的神經(jīng)細胞的凋亡。結(jié)論: 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡具有抑制作用，其作用靶點可能是miR-25。

依達拉奉； 微小RNA-25; 高糖； SH-SY5Y細胞; 細胞凋亡

糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素缺陷引起的高血糖為特征的代謝綜合征。近年來研究顯示其并發(fā)癥視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病變和動脈粥樣硬化的發(fā)病風險日益增加，其中神經(jīng)病變越來越受到人們的關(guān)注，臨床上常表現(xiàn)為認知功能障礙、學習能力下降、記憶力衰退、癡呆、精神性疾患等慢性腦病癥狀，被稱為糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)[1-2]。而高血糖誘導的DNA氧化損傷是引起的神經(jīng)元凋亡進而引發(fā)糖尿病腦病的主要原因[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在細胞內(nèi)過度蓄積導致DNA氧化損傷[6-7]。

微小RNA(microRNA, miRNA, miR)能夠調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和凋亡，臨床研究和動物實驗表明，miRNAs是神經(jīng)細胞病變的潛在生物標志物和治療靶標點。miR-106b～25是由位于Mcm7基因同一內(nèi)含子區(qū)編碼的家族，包含miR-106b、miR-93和miR-25。研究表明miR-106b～25家族在成人神經(jīng)干細胞增殖方面具有極其重要的作用。Brett等[8]更進一步證實，miR-106b～25家族中主要是miR-25發(fā)揮促進神經(jīng)細胞增殖作用，并揭示其在腦缺血再灌注后呈高表達趨勢。此外，在心血管系統(tǒng)中研究表明，miR-25在H2O2處理的心肌細胞中反應(yīng)性地顯著增加，進一步高表達的miR-25通過抑制線粒體凋亡途徑來對抗氧化損傷[9]。由此可見，miR-25在糖尿病腦病氧化損傷方面可能具有調(diào)節(jié)作用，并可能成為糖尿病腦病治療的重要靶點。

依達拉奉(edaravone，EDA)早在2001年在日本被批準用于缺血性中風病的治療，其主要作用是清除氧自由基和抗氧化，目前臨床上多用于治療腦出血、腦水腫和腦梗死。最新研究顯示，依達拉奉可通過抑制氧自由基的生成進而對抗糖尿病性心肌病的發(fā)展[10]。本實驗采用高糖(high glucose，HG)誘導SH-SY5Y細胞建立神經(jīng)元凋亡模型，探討依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響及其作用靶點。

材 料 和 方 法

1 細胞、試劑及儀器

SH-SY5Y細胞購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；依達拉奉購自南京先聲藥業(yè)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和小牛血清購自Gibco；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、甘露醇(mannitol)、Bax抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體及Ⅱ抗均購自Sigma；Annexin V-FITC流式檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、活性氧檢測試劑盒及caspase-3活性檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；miR-25引物及抑制劑購自上海吉瑪生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa。低溫超速離心機(Thermo)；Western blot電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(天能公司)；普通顯微鏡和熒光顯微鏡(Olympus)；分析天平(Mettler Toledo)；細胞培養(yǎng)箱和酶標儀(Sanyo)；流式細胞儀(Bekman)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細胞采用置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基聯(lián)合10%小牛血清培養(yǎng)，每2～3 d進行換液。選取對數(shù)生長期細胞，換用無血清5 mmol/L低糖DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后進行實驗。細胞分別給予25、50、100和200 μmol/L依達拉奉，處理24 h后通過MTT檢測細胞存活率以確定依達拉奉最佳給藥濃度，同時給予甘露醇94.5 mmol/L(連同DMEM低糖培養(yǎng)基中5.5 mmol/L葡萄糖，故與含100 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基滲透壓相同)，觀察高糖培養(yǎng)基滲透壓對細胞活力的影響。另取細胞分為正常培養(yǎng)基組[正常對照(control)組]、葡萄糖100 mmol/L DMEM培養(yǎng)液組(HG組)以及依達拉奉100 μmol/L和100 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液組(HG+EDA組，加入高糖及依達拉奉培養(yǎng)24 h)。

2.2 MTT實驗 SH-SY5Y細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，根據(jù)實驗分組予以相應(yīng)處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育2～3 h。小心吸取上清液，每孔加入DMSO，置于搖床上至甲臜完全溶解。酶標儀選取波長490 nm讀取吸光度(A)值。細胞存活率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2.3 DCFH-DA探針法檢測細胞中ROS水平 SH-SY5Y細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，根據(jù)實驗分組予以相應(yīng)處理后，棄掉培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基按1∶1 000稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L，每孔加入200 μL DCFH-DA，在37 ℃孵箱中孵育20 min，5 min搖勻1次，以無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次后用熒光酶標儀檢測。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞中ROS水平 各組細胞予以相應(yīng)處理后，吸取上清液，1 000 r/min離心10 min，提取上清液，按試劑盒說明書進行處理，用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值。

2.5 Annexin V-FITC流式細胞儀分析細胞凋亡率 各組細胞予以相應(yīng)處理后，胰酶消化后將其制成單細胞懸液，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次后，重懸細胞于250 μL結(jié)合緩沖液中，調(diào)節(jié)濃度至1×109/L，吸取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶(20 μg/L)，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加400 μL PBS，流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率。

2.6 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達 SH-SY5Y細胞以每孔2×105個接種于6孔板中，根據(jù)實驗分組予以相應(yīng)處理后，提取細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白含量，配制5%濃縮膠和12%或15%分離膠，上樣，電泳，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并于5%脫脂奶粉或5% BSA封閉液中室溫下封閉2 h，洗膜，加Ⅰ抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)，室溫孵育2 h，洗膜，加Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，洗膜，采用ECL化學發(fā)光法顯色，使用Quantity One軟件對結(jié)果進行處理分析。

2.7 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 采用TRIzol法抽提MCF-7細胞總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系(20 μL)如下：總RNA 50 ng～5 μg；GSP(RT-Primer) 2 μL，1 pmol；2×TS Reaction Mix 10 μL；Transcript RT/RI Enzyme Mix 1 μL；RNase-free water 加至20 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min，所得cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.8 Real-time PCR檢測細胞中miR-25的表達水平 以U6作為內(nèi)參照， miR-25的上游引物為5’-AGAACGCATTGCCACCATACA-3’，下游引物為5’-TGCTTAACCCCTCACCTTGA-3’；U6的上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTGCG-3’。反應(yīng)體系(20 μL)如下：SYBR Green Mix 9 μL、RT-Product 2 μL、正義引物0.8 μL(終濃度為200 nmol/L)、反義引物0.8 μL(終濃度為200 nmol/L)和ddH2O 7.4 μL，輕輕混勻后，采用2步法進行qPCR擴增，擴增參數(shù)為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；最后進行熔解曲線的測定：95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s， 95 ℃ 15 s。用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對含量。

2.9 Caspase-3的活性檢測 按照試劑盒說明書設(shè)置96孔板反應(yīng)體系，依次加入反應(yīng)試劑。置于37 ℃孵育至肉眼可見顏色發(fā)生變化時，進行A405檢測。

3 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學處理計量資料均以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，使用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P< 0.05為方差有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 依達拉奉及等滲甘露醇對SH-SY5Y細胞存活率的影響

SH-SY5Y細胞經(jīng)DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，給予不同濃度的依達拉奉繼續(xù)處理24 h，結(jié)果顯示小于100 μmol/L對細胞沒有明顯的損傷作用，大于 200 μmol/L的依達拉奉細胞成活率明顯降低。因此，我們選取100 μmol/L為最大給藥濃度。

為了觀察誘導SH-SY5Y細胞凋亡所用高糖(100 mmol/L)培養(yǎng)基滲透壓對細胞的影響，本實驗中采用DMEM低糖(5.5 mmol/L)培養(yǎng)基和甘露醇(94.5 mmol/L)模擬100 mmol/L葡萄糖等滲條件，共培養(yǎng)SH-SY5Y細胞 24 h，結(jié)果顯示，100 mmol/L葡萄糖對細胞存活率沒有影響，見圖1。

Figure 1.The effects of edaravone (EDA) or mannitol (94.5 mmol/L) on the viability of the SH-SY5Y cells detected by MTT assay. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1 依達拉奉及等滲的甘露醇對SH-SY5Y細胞存活率的影響

2 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

正常對照組細胞貼壁良好，細胞周邊有突起；高糖組細胞胞體變小變圓，突起減少，折光性增強；較與高糖模型組相比較，給予依達拉奉后細胞突起增多，貼壁明顯改善，周邊折光性減弱，見圖2。

Figure 2.The effects of edaravone (EDA) on the morphology of SH-SY5Y cells induced by high glucose (HG; 100 mmol/L glucose) observed under optical microscope (×200).

圖2 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

3 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響

與正常對照組比，模型組的細胞存活率，明顯降低；與高糖模型組比，依達拉奉組細胞存活率為明顯增加，見圖3。

Figure 3.The effects of edaravone (EDA) on the viability of SH-SY5Y cells induced by high glucose (HG; 100 mmol/L glucose) detected by MTT assay. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖3 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響

4 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞中ROS水平的影響

DCFH-DA和酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果均顯示，與對照組相比，模型組細胞中ROS水平明顯升高；與高糖組相比，依達拉奉給藥組細胞中ROS水平明顯降低，見圖4。

5 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

與正常對照組比較，高糖模型組的細胞凋亡率明顯升高；與高糖模型組比較，依達拉奉給藥后細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，見圖5。

6 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與正常對照組相比，模型組凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達明顯降低，促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯增加；與模型組相比，給予依達拉奉后Bcl-2的表達明顯升高，Bax的表達水平明顯降低,說明依達拉奉可以抑制細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平，見圖6。

Figure 4.The effects of edaravone (EDA) on ROS levels in the SH-SY5Y cells induced by high glucose (HG; 100 mmol/L glucose) determined by DCFH-DA fluorescent probing (A; ×200) and ELISA (B). Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖4 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞中ROS水平的影響

Figure 5.The effects of edaravone (EDA) on the apoptotic rate of SH-SY5Y cells induced by high glucose (HG; 100 mmol/L glucose) detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖5 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

7 依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞中miR-25表達的影響

與對照組相比，高糖組細胞中miR-25的含量明顯降低；與高糖模型組相比，依達拉奉給藥組細胞中miR-25含量明顯升高，說明依達拉奉可以明顯升高細胞中miR-25的表達含量，見圖7。

Figure 6.The effect of edaravone (EDA) on the apoptosis-related protein levels in the SH-SY5Y cells induced by high glucose (HG; 100 mmol/L glucose) determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖6 依達拉奉高糖誘導的SH-SY5Y細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

Figure 7.The effects of edaravone (EDA) on the miR-25 levels of the SH-SY5Y cells induced by high glucose (HG; 100 mmol/L glucose) determined by real-time PCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖7 依達拉奉高糖誘導的SH-SY5Y細胞中miR-25表達的影響

8 依達拉奉通過miR-25對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

為進一步闡明依達拉奉抑制高糖誘導的神經(jīng)細胞凋亡的作用靶點，我們將miR-25抑制劑應(yīng)用于細胞。如圖8A所示，SH-SY5Y細胞以每孔5×104接種于24孔板中，經(jīng)miR-25抑制劑(5 μg)孵育24 h后，real-time PCR檢測細胞中的miR-25，結(jié)果顯示，給予miR-25抑制劑后 miR-25的表達水平顯著降低，降低幅度約為30%。

與對照組相比，高糖組細胞的caspase-3活性明顯升高；與高糖模型組相比，依達拉奉給藥后組細胞的caspase-3活性明顯降低，給予miR-25抑制劑后的caspase-3活性明顯增加，將miR-25抑制劑與依達拉奉聯(lián)合應(yīng)用后，并不能抑制高糖引起的細胞的凋亡,說明miR-25為依達拉奉抑制高糖誘導的神經(jīng)細胞凋亡的關(guān)鍵靶點，見圖8B。

Figure 8.The effects of edaravone (EDA) and/or miR-25 inhibitor on the caspase-3 activity in the SH-SY5Y cells induced by high glucose (HG; 100 mmol/L glucose). A: miR-25 inhibitor decreased miR-25 expression; B: the caspase-3 activity was detected in each group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖8 依達拉奉通過miR-25對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

討 論

本實驗采用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導SH-SY5Y細胞凋亡模型，前期結(jié)果顯示，40 mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細胞24 h，仍不能誘導該細胞凋亡，后采用Xue等[11]報道的造模方式，用含100 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細胞24 h成功建立細胞凋亡模型。研究結(jié)果顯示，模型組細胞的存活率明顯下降；細胞凋亡率明顯升高；鏡下觀察模型組細胞胞體變小變圓，折光性增強，細胞間的連接消失；凋亡抑制蛋白Bcl-2表達明顯降低，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達明顯增加，說明含有100 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h引起SH-SY5Y細胞凋亡。為探討依達拉奉是否對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡具有保護作用，選擇濃度100 μmol/L依達拉奉與高糖同時作用SH-SY5Y細胞24 h，結(jié)果顯示，與模型組相比，依達拉奉組細胞存活率明顯增加；細胞凋亡率明顯降低；顯微鏡下細胞形態(tài)明顯改善；凋亡抑制蛋白Bcl-2表達明顯升高，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達降低，說明依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡具有抑制作用。綜上所述，高糖可誘導SH-SY5Y細胞凋亡，且依達拉奉可抑制高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。

為進一步探討依達拉奉對高糖誘導的細胞凋亡的作用機制，我們檢測細胞中ROS水平和miR-25的含量。ROS在細胞內(nèi)過度蓄積能夠?qū)е翫NA氧化損傷[9]。結(jié)果顯示模型組細胞中ROS水平明顯增加，miR-25的表達明顯降低；依達拉奉給藥處理后，細胞中ROS水平明顯降低，miR-25的表達明顯升高。說明依達拉奉可以保護DNA免受氧化損傷，其可能是依達拉奉對高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡作用的機制。為進一步探討miR-25是否為依達拉奉對高糖誘導的細胞凋亡作用機制的關(guān)鍵靶點，我們應(yīng)用了miR-25抑制劑，結(jié)果顯示，給予依達拉奉治療后，并不能抑制高糖引起的細胞的凋亡。這說明依達拉奉能夠抑制氧自由基的生成進而抑制高糖引起的細胞凋亡，且miR-25為其關(guān)鍵作用靶點。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of edaravone on high glucose-induced apoptosis in SH-SY5Y cells via regulating microRNA-25

ZHU Zhen-han1, QI Jie2

(1DepartmentofEmergency,The401thHospitalofTheChinesePeople’sLiberationArmy,Qingdao266071,China;2DepartmentofGeriatricMedicine,AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256603,China.E-mail:zhuzhenhan2016@163.com)

AIM: To observe the effects of edaravone on high glucose-induced apoptosis of SH-SY5Y cells and its potential mechanism. METHODS: The SH-SY5Y cells were cultured in the DMEM medium with 100 mmol/L glucose and 100 μmol/L edaravone for 24 h. The viability of the SH-SY5Y cells was detected by MTT assay. The levels of ROS in the cells were determined by DCFH-DA fluorescent probing. The apoptotic rates of the cells were analyzed by flow cytometry. The protein expression of Bax and Bcl-2 in the cells were detected by Western blot. The expression levels of micro-RNA-25 (miR-25) were determined by real-time PCR. To further clarify the target sites of edaravone on inhibiting apoptosis induced by high glucose, miR-25 inhibitor was applied to the SH-SY5Y cells and the activity of caspase-3 was measured.RESULTS: Compared with control group, the cell viability was decreased significantly in model group, and the ROS level was increased significantly. The protein expression of Bax was up-regulated significantly, while the expression levels of Bcl-2 and miR-25 were significantly down-regulated. Compared with model group, the cell viability was increased significantly in edaravone group. The ROS level was decreased significantly. Meanwhile, the expression of Bax was down-regulated, while the expression of Bcl-2 and miR-25 was up-regulated with statistical significance. The caspase-3 activity of the cells incubated with 100 mmol/L glucose and miR-25 inhibitor was increased. However, no alteration of caspase-3 activity with edaravone added simultaneously was observed. CONCLUSION: Edaravone inhibits the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by high glucose with the potential target site of miR-25.

Edaravone; MicroRNA-25; High glucose; SH-SY5Y cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)01- 0092- 06

2016- 09- 20

2016- 12- 05

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.015

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0532-51870120; E-mail: zhuzhenhan2016@163.com