吳柳松， 錢民章

(遵義醫(yī)學(xué)院 1生物化學(xué)教研室， 2附屬醫(yī)院小兒內(nèi)二科，貴州 遵義 563004)

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絞股藍(lán)總苷對(duì)PCSK9基因表達(dá)及辛伐他汀降血脂作用的影響*

吳柳松1,2， 錢民章1△

(遵義醫(yī)學(xué)院1生物化學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院小兒內(nèi)二科，貴州 遵義 563004)

目的： 探討絞股藍(lán)總苷(gypenosides， GPs)對(duì)大鼠肝臟前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因表達(dá)及辛伐他汀的降血脂作用的影響。方法: 采用高脂飼料喂飼建立大鼠高脂血癥模型。60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control組)、高脂模型組(model組)、辛伐他汀組(simvastatin組)、GPs組和GPs與辛伐他汀聯(lián)合用藥組(combined組)。除正常對(duì)照組喂食普通飼料外，其余3組大鼠均喂食高脂飼料。將GPs溶于0.3%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液中，用灌胃方式給藥。Control組和model組灌0.3% CMC-Na(1 mL/100 g)，GPs組灌GPs 160 mg·kg-1·d-1，simvastatin組灌辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1，combined組灌兩者聯(lián)合劑量。實(shí)驗(yàn)8周后，處死大鼠。取腹腔動(dòng)脈血，測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；稱大鼠體重及肝臟組織濕重，測(cè)定肝指數(shù)；取肝臟用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色作常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)；另取肝臟提取總RNA，real-time PCR測(cè)定PCSK9和低密度脂蛋白受體(LDLR)的mRNA表達(dá)；提取肝臟總蛋白，Western blot測(cè)定PCSK9和LDLR蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 成功建立高脂血癥大鼠模型。與model組大鼠比較，simvastatin組、GPs組以及combined組TC、TG和LDL-C水平均明顯下降(P<0.05)，各組HDLC水平有不同程度的上升(P<0.05)。與model組大鼠比較，simvastatin組、GPs組以及combined組肝指數(shù)均明顯下降(P<0.05)。肝組織病理結(jié)果顯示，高脂血癥性大鼠出現(xiàn)脂肪肝病變；simvastatin組、GPs組以及combined組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度有不同程度減輕，尤以combined組效果顯著。與model組比較，simvastatin組PCSK9和LDLR的mRNA表達(dá)均明顯升高，GPs組以及combined組PCSK9 的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，GPs組LDLR的mRNA表達(dá)變化不明顯，combined組LDLR的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與model組比較，simvastatin組PCSK9和LDLR的蛋白表達(dá)均明顯升高；GPs組和combined組的PCSK9 蛋白表達(dá)明顯降低，LDLR 蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。結(jié)論: GPs能抑制肝臟PCSK9表達(dá)，增加LDLR表達(dá)量；與辛伐他汀聯(lián)用可增強(qiáng)其降血脂和減輕肝臟脂肪病變的效果。

絞股藍(lán)總苷； 高脂血癥；PCSK9 基因； 低密度脂蛋白受體； 辛伐他汀

高脂血癥(hyperlipidemia，HL)是指血脂高于正常參考值的上限的現(xiàn)象，是由多種原因?qū)е轮鞍缀铣膳c清除平衡紊亂所致。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，一些基因缺陷或表達(dá)失衡，使參與脂蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的受體、酶或載脂蛋白異常，導(dǎo)致血脂升高[1]。高脂血癥是引起動(dòng)脈粥樣硬化、腦中風(fēng)等心腦血管疾病的重要原因，利用藥物控制血脂水平，可以減少心腦血管疾病的發(fā)病率，具有重要的臨床意義[2]。2003年，Seidah等[3]發(fā)現(xiàn)一個(gè)新基因——前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9)基因，該基因編碼一種前蛋白轉(zhuǎn)化酶，名為神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1)，可介導(dǎo)低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)降解，升高血漿中低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的水平，該基因的各種突變會(huì)導(dǎo)致異常膽固醇血癥。他汀類是目前臨床上最常用的降脂藥物，降脂效果得到認(rèn)可，但也存在部分副作用[4]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物在降脂的同時(shí)，能增強(qiáng)PCSK9表達(dá)，從而增強(qiáng)LDLR降解，使他汀類藥物降脂效果受到抑制[5]。

絞股藍(lán)是葫蘆科絞股藍(lán)屬的多年生草質(zhì)藤本植物，其主要藥效成分為絞股藍(lán)總苷(gypenosides，GPs)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GP及GPs均能明顯降低實(shí)驗(yàn)性高脂大鼠總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、LDL-C、極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)和過氧化磷脂，同時(shí)升高高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，使高脂血癥得到明顯改善[6-8]。臨床試驗(yàn)也證實(shí)，GPs可顯著降低血脂水平，有調(diào)節(jié)血脂代謝的作用[9-10]。GPs是否能通過影響PCSK9的表達(dá)發(fā)揮降脂效應(yīng)以及與辛伐他汀聯(lián)用能否拮抗辛伐他汀對(duì)PCSK9的誘導(dǎo)作用而增強(qiáng)其降脂效果，未見報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)建立了高脂血癥大鼠模型，對(duì)上述問題進(jìn)行了研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60 只，體重(200±20) g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK(渝)2012-0005。分籠喂養(yǎng)于室溫下明暗各12 h的動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)，飲水不限。

2 主要實(shí)驗(yàn)材料

絞股藍(lán)總苷(純度98.06%)購自西安賽邦醫(yī)藥科技有限公司;辛伐他汀分散片(廣州南新制藥有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；PCSK9、LDLR和GAPDH引物(上海生工生物工程公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa)；兔抗人抗PCSK9和LDLR抗體(Abcam);兔抗人抗β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊 II 抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；PMSF/RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；丙烯酰胺(Solarbio)；PVDF膜(Millipore)；Tris(Solarbio)。

3 主要儀器設(shè)備

核酸蛋白分析儀(Thermo)；普通PCR儀(Eppendorf)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96)、酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)、垂直電泳-轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad)；超低溫冰箱(海爾公司)；超純水系統(tǒng)(Millipore)；電子天平(Tokyo)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)。

4 主要方法

4.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)(喂食普通飼料)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(control組)、高脂模型組(model組)、辛伐他汀組(simvastatin組)、絞股藍(lán)總苷組(GPs組)和絞股藍(lán)總苷與辛伐他汀聯(lián)合用藥組(combined組)5組。Control組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組均以高脂飼料(配方為：10%豬油、2%膽固醇、5%蔗糖、0.5%膽鹽、0.2%丙硫氧嘧啶和82.3%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)。根據(jù)人體實(shí)驗(yàn)劑量和成人與大鼠的體重折算系數(shù)折算成大鼠用藥量。造模同時(shí)灌胃給GPs和辛伐他汀，GPs劑量為每天160 mg/kg，辛伐他汀劑量為每天5 mg/kg，combined組以兩者聯(lián)合劑量給藥；control組和model組每天灌服0.3%的CMC-Na，每周稱重1次用以調(diào)整灌胃量，連續(xù)給藥8周。

4.2 動(dòng)物處置及標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥后，禁食12 h，不禁水，稱體重，7%水合氯醛皮下麻醉，腹主動(dòng)脈采血5 mL。將大鼠處死后，迅速剝?nèi)∑淙扛闻K，用預(yù)冷4 ℃的生理鹽水反復(fù)沖洗，直到未見淤血，用濾紙吸干，做好標(biāo)記并稱重、拍照。標(biāo)本采集完后，所剩動(dòng)物尸體按有關(guān)要求進(jìn)行處置。

4.3 大鼠血脂的測(cè)定 將采集的大鼠血液4 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TC、TG、HDL-C和LDL-C。

4.4 大鼠肝指數(shù)的測(cè)定 按肝指數(shù)(%)=肝臟濕重/大鼠體重×100%，計(jì)算各組大鼠肝指數(shù)。

4.5 大鼠肝臟病理學(xué)檢測(cè) 取部分肝臟組織4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水透明后，石蠟包埋，切片經(jīng)梯度乙醇脫蠟至水合，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察肝臟病理學(xué)變化。

4.6 Real-time PCR檢測(cè)大鼠肝臟PCSK9和LDLR的mRNA表達(dá) 在冰上將肝臟組織用TRIzol試劑勻漿至無明顯組織顆粒，并按TRIzol試劑盒操作要求提取肝臟總RNA，按RT-PCR試劑盒操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增的cDNA加入至20μL的反應(yīng)體系中。PCSK9的上游引物序列為5’-GCACTGGAGAACCACACAGG-3’，下游引物序列為 5’-TGGCTGCATGACATTGCTTCTC-3’；LDLR的上游引物序列為5’-CCTCAGCTACCAGCACCTCT-3’，下游引物序列為5’-AGCCATGTCACCTTGGACTT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GGCATTGCTCTCAATGACAA-3’，下游引物序列為5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。Real-time PCR的反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，59.5 ℃ 30 s，39 個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，目的基因PCSK9和LDLR的表達(dá)根據(jù)經(jīng)real-time PCR儀器檢測(cè)的Ct值，通過公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

4.7 Western blot法檢測(cè)大鼠肝臟PCSK9和LDLR蛋白的表達(dá) 在冰上將肝臟組織用細(xì)胞裂解液勻漿至無明顯組織顆粒，靜置充分裂解，離心后取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白定量120 μg，煮沸5 min，上樣于10% SDS-PAGE膠電泳1.5 h，全濕式電轉(zhuǎn)將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉封閉1 h。加入I抗(兔抗鼠PCSK9和LDLR多克隆抗體，1∶1 000；兔抗鼠β-actin抗體,1∶5 000)及 II 抗(1∶5 000)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)目的條帶，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析并拍照。用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，資料經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)法，以P<0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 GPs對(duì)高血脂模型大鼠血清血脂水平的影響

各組大鼠血清經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)其血脂水平，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)，HDL-C水平則明顯下降，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)。與模型組大鼠比較，辛伐他汀組、GPs組以及聯(lián)合用藥組TC、TG和LDL-C水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)，其HDL-C水平均明顯升高，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)。辛伐他汀組與GPs組比較，以上指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而與兩者單獨(dú)用藥比較，聯(lián)合用藥組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均明顯降低(P<0．05)，HDL-C水平明顯升高(P<0．05)，見圖1。

2 GPs對(duì)高血脂模型大鼠肝指數(shù)變化的影響

各組大鼠肝指數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠肝指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)。與模型組大鼠比較，辛伐他汀組、GPs組以及聯(lián)合用藥組肝指數(shù)均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)，辛伐他汀組與GPs組肝指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而與兩者單獨(dú)用藥比較，聯(lián)合用藥組大鼠肝指數(shù)則明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05),見圖2。

Figure 1. The levels of blood lipids in different groups of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0．05vscontrol group;▲P<0．05vsmodel group;★P<0．05vscombined group.

圖1 各組大鼠血清的血脂水平

3 GPs對(duì)高血脂模型大鼠肝臟病理學(xué)變化的影響

3.1 肉眼觀察 Control組大鼠肝臟均無明顯異常，顏色紅潤，質(zhì)地柔軟，富有彈性；model組大鼠肝臟呈灰白色脂肪病變,體積呈彌漫性增大，邊緣鈍而厚實(shí)，質(zhì)地變硬，指壓可出現(xiàn)凹陷，切面有油膩感；辛伐他汀組、GPs組以及聯(lián)合用藥組脂肪病變明顯減輕，呈淡紅色，色澤較暗，質(zhì)地、彈性及切面油膩感等介于control組與model組之間，但此3組之間肉眼觀察變化不太明顯，見圖3。

Figure 2.The change of liver index in different group of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0．05vscontrol group;▲P<0．05vsmodel group;★P<0．05vscombined group.

圖2 各組大鼠肝指數(shù)的變化

Figure 3.The macroscopic observation of the liver in different groups of the rats.

圖3 各組大鼠肝臟肉眼觀察

3.2 鏡下病理學(xué)觀察 Control組的肝細(xì)胞索排列較整齊，以中央靜脈居中，肝竇正常不增寬，胞核清晰，肝小葉輪廓不明顯，未見結(jié)締組織，肝細(xì)胞內(nèi)僅可見少量細(xì)小脂滴。 模型組的肝細(xì)胞嚴(yán)重腫脹，病變?nèi)砸灾醒腱o脈為中心，可見大量脂肪空泡，脂滴大小不等，部分融合為大泡性脂肪變性，肝竇狹窄或消失，部分區(qū)域見有點(diǎn)狀壞死、脂肪變性的細(xì)胞布滿視野，肝細(xì)胞排列松散。辛伐他汀組的病變程度較模型組明顯減輕，可見少量小脂滴，肝細(xì)胞腫脹較模型組也較輕，胞漿疏松化，可見到正常的肝細(xì)胞。GPs組也可見肝細(xì)胞脂肪變性，但較model組明顯減輕，肝細(xì)胞腫脹較model組也較輕，與辛伐他汀組比較區(qū)別不明顯。聯(lián)合用藥組可見脂肪病變程度較model組、辛伐他汀組及GPs組明顯減輕，細(xì)胞空泡變明顯減少致未見，脂滴少而小，接近正常組，肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)基本正常，偶見少數(shù)無核肝細(xì)胞。細(xì)胞腫脹程度較模型組腫脹顯著減少，略重于正常組，見圖4。

Figure 4.The pathological observation of the liver in different groups of the rats (HE staining, ×200).

圖4 各組大鼠肝臟的病理學(xué)觀察

4 GPs對(duì)高血脂模型大鼠肝臟PCSK9和LDLR的mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測(cè)各組大鼠肝臟PCSK9和LDLR的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，高脂模型組PCSK9的mRNA表達(dá)明顯升高，LDLR的mRNA表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。與高脂模型組比較，辛伐他汀組PCSK9和LDLR的mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；GPs 組PCSK9的mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，LDLR的mRNA表達(dá)差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；combined組PCSK9的mRNA表達(dá)同樣明顯降低，LDLR的mRNA表達(dá)則明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。與GPs組及simvastatin組比較，combined組PCSK9和LDLR的mRNA表達(dá)均介乎單獨(dú)兩組之間，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The mRNA expression of PCSK9 and LDLR in the rat liver of different groups. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsmodel group;★P<0.05vscombined group.

圖5 各組大鼠肝臟PCSK9和LDLR mRNA的表達(dá)

5 GPs對(duì)高血脂模型大鼠肝臟PCSK9和LDLR 蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)各組大鼠肝臟PCSK9和LDLR蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，高脂模型組PCSK9的蛋白表達(dá)明顯升高，LDLR的蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。與高脂模型組比較，simvastatin組的PCSK9和LDLR 蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；GPs組的PCSK9蛋白表達(dá)明顯降低，LDLR蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；combined組的PCSK9蛋白表達(dá)明顯降低，LDLR蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。與GPs組及simvastatin組比較，combined組的PCSK9蛋白表達(dá)均低于單獨(dú)兩組各自的蛋白表達(dá)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，combined組的LDLR蛋白表達(dá)則均高于單獨(dú)兩組各自的蛋白表達(dá)值，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The protein expression of PCSK9 and LDLR in the rat liver of different groups. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsmodel group;★P<0.05vscombined group.

圖6 各組大鼠肝臟PCSK9和LDLR 蛋白的表達(dá)

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過喂飼高脂飲食建立大鼠高脂血癥模型，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠TG、TC和LDL-C水平明顯升高。此外，模型組大鼠肝指數(shù)與空白對(duì)照組比較也明顯升高；病理學(xué)檢查也證實(shí)肝臟具有明顯脂肪病變，這些結(jié)果說明大鼠高脂血癥模型構(gòu)建成功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，GPs組的TC、TG和LDL-C水平均明顯下降，肝指數(shù)明顯降低，肝臟脂肪病變較模型組也有明顯減緩和改善。這些結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符，進(jìn)一步證實(shí)了絞股藍(lán)總苷具有降低血脂、減輕肝脂肪變性的作用。

PCSK9不同類型的突變，對(duì)血漿膽固醇水平有不同的調(diào)節(jié)作用[11-12]?；谝訮CSK9為靶點(diǎn)的降脂藥物研發(fā)已受到關(guān)注[11,13-14]。本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，GPs組大鼠肝臟PCSK9 mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯下降，LDLR蛋白水平較模型組則明顯升高，提示GPs能抑制PCSK9的表達(dá)，減少LDLR的降解，從而增加LDL-C的清除，是其降脂的機(jī)理之一。另外，與模型組比較，GPs組大鼠肝臟LDLR mRNA的變化不明顯，說明GPs對(duì)LDLR的轉(zhuǎn)錄沒有影響。這提示PCSK9對(duì)LDLR轉(zhuǎn)錄也沒有影響，其對(duì)LDLR表達(dá)調(diào)控是發(fā)生在蛋白水平，屬轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，與Wang等[15]和Fisher等[16]報(bào)道一致。

辛伐他汀是目前最強(qiáng)效和最常用的降脂藥物之一，該藥是膽固醇合成的關(guān)鍵酶HMG-CoA還原酶的抑制劑，可抑制內(nèi)源性膽固醇合成[17]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置辛伐他汀組作為陽性對(duì)照，并設(shè)置了辛伐他汀與GPs兩者聯(lián)合用藥組，目的是觀察GPs對(duì)辛伐他汀降脂效應(yīng)的影響。結(jié)果表明辛伐他汀組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平較模型組大鼠均明顯下降，雖然其下降的幅度大于GPs組，但兩組之間比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，尚不能確定辛伐他汀降血脂作用是否強(qiáng)于GPs；combined組大鼠血清中的TC、TG和LDL-C水平較模型組大鼠也明顯下降，且均強(qiáng)于單獨(dú)用藥組，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示辛伐他汀和GPs在降血脂效應(yīng)上具有協(xié)同作用。

新近的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物在降脂的同時(shí)，能增強(qiáng)PCSK9表達(dá)，從而增加LDLR降解，使他汀類藥物降脂效果受到抑制[5]。而在PCSK9基因敲除鼠中，使用他汀類藥時(shí)，其LDLR的量明顯高于野生型鼠，血脂對(duì)降脂藥的敏感性增高[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辛伐他汀組PCSK9和LDLR 的mRNA及蛋白表達(dá)與模型組比較均明顯升高，說明辛伐他汀能增強(qiáng)LDLR 的表達(dá)，從而可降低LDL-C水平，起到降血脂作用。然而在本實(shí)驗(yàn)中，辛伐他汀也同時(shí)增強(qiáng)了PCSK9基因的表達(dá)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。Combined組與model組比較PCSK9蛋白表達(dá)明顯降低，LDLR蛋白表達(dá)明顯升高；與GPs組及simvastatin組單獨(dú)用藥組比較，combined組PCSK9蛋白表達(dá)均低于單獨(dú)兩組的PCSK9蛋白表達(dá)值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，combined組的LDLR蛋白表達(dá)則均高于單獨(dú)兩組的LDLR蛋白表達(dá)值，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，表明二者聯(lián)用后，可能由于GPs抑制了辛伐他汀單獨(dú)治療導(dǎo)致的PCSK9表達(dá)增加，減少了LDLR的降解，故降脂效果明顯優(yōu)于單用。這提示GPs有可能作為他汀類降脂治療的補(bǔ)充，增強(qiáng)和改善他汀類藥物降脂的療效。本研究為GPs的降脂治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of gypenosides on PCSK9 gene expression and blood lipids lowered by simvastatin

WU Liu-song1,2, QIAN Min-zhang1

(1DepartmentofBiochemistry,2TheSecondDepartment,Pediatrics,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563004,China.E-mail:qian_mzh@hotmail.com)

AIM: To explore the effect of gypenosides (GPs) onPCSK9 gene expression in hyperlipidemic rat liver and the blood lipids lowered by simvastatin.METHODS: Healthy male SD rats (n=60) were randomized into 5 groups: normal control group, hyperlipidemic model group, simvastatin group, GPs group and GPs combined with simvastatin group (combined group). The rats in all groups were fed high-fat diet except normal control group which were fed with ordinary diet. The rats in control group and hyperlipidemic model group were gavaged with 0.3% CMC-Na every day. The rats in GPs group were gavaged with GPs at 160 mg·kg-1·d-1. The rats in simvastatin group were gavaged with simvastatin at 5 mg·kg-1·d-1. The rats in combined group were gavaged with GPs and simvastatin. The experiment lasted for 8 weeks. The rats were anesthetized with chloral hydrate, and abdominal arterial blood samples were collected to detect the total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). The body weight and the wet weight of the livers were measured, and the liver index was calculated. The pathological changes of the livers were observed under microscope with HE staining. The expression of PCSK9 and low-density lipoprotein receptor (LDLR) at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The model of hyperlipidemia rats was established successfully. Compared with model group, the levels of TC, TG and LDL-C in simvastatin group, GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05), and the HDL-C levels were obviously upregulated (P<0.05). Compared with model group, the liver indexes in simvastatin group, GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05). The pathological changes of the liver tissues showed that hepatic adipose appeared in model group, and that in simvastatin group and GPs group had different degrees of relief, especially in combined group. Compared with model group, the mRNA expression levels of PCSK9 and LDLR in simvastatin group were obviously increased, while the mRNA expression levels of PCSK9 in GPs group and combined group were obviously decreased (P<0.05), and the mRNA expression of LDLR in combined group was obviously increased (P<0.05). Compared with model group, the protein expression of PCSK9 and LDLR in simvastatin group was obviously increased, while the protein expression levels of PCSK9 in GPs group and combined group were obviously reduced, and the LDLR protein levels were obviously increased (P<0.05). CONCLUSION: Gypenosides inhibit the expression of PCSK9 and increase the expression of LDLR in the liver. The combination of gypenosides and simvastatin promotes the lipid-lowering effect of simvastatin and attenuates hepatic steatosis, which may be related to inhibiting the expression of PCSK9 in the liver.

Gypenosides; Hyperlipidemia;PCSK9 gene; Low-density lipoprotein receptor; Simvastatin

1000- 4718(2017)01- 0079- 07

2016- 01- 28

2016- 08- 09

貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目(黔科合J字【2009】2-178號(hào))

R543.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.013

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