王正義， 甘霖莉， 賈義平， 崔恒敏， 鄧俊良， 左之才

(四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 溫江 611130)

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滴鼻大腸桿菌對高脂誘導肥胖小鼠糖脂代謝的影響*

王正義， 甘霖莉， 賈義平， 崔恒敏， 鄧俊良， 左之才△

(四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 溫江 611130)

目的： 探討滴鼻大腸桿菌對高脂誘導肥胖小鼠糖脂代謝的影響。方法: 選取48只高脂誘導的肥胖小鼠作為肥胖組，48只非肥胖小鼠作為對照組，滴鼻40 μL含4×109CFUs大腸桿菌菌液，于感染前及感染后1、2、3、4 d檢測2組小鼠血清糖脂代謝相關指標及肝臟脂質沉積情況。結果: 與感染前比較，肥胖小鼠體質量、附睪脂肪組織質量及指數(shù)在感染后1～4 d顯著降低(P<0.05)；血清空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)水平以及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)在2～4 d顯著升高(P<0.05)；血清游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)和極低密度脂蛋白(VLDL)水平在1～4 d顯著升高，總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平在1～3 d顯著降低(P<0.05)；肝臟質量、指數(shù)及TG含量在1～4 d顯著升高(P<0.05)，肝細胞脂滴蓄積在感染后2和4 d明顯增多。與對照組比較，肥胖組小鼠血清TC、LDL-C和HDL-C水平在感染后顯著降低，其余指標均明顯升高(P<0.05)。結論: 滴鼻大腸桿菌可加劇肥胖小鼠糖脂代謝紊亂程度，促進其胰島素抵抗及肝臟脂肪化的發(fā)生、發(fā)展。

肥胖； 感染； 糖脂代謝

隨著生活水平的提高，肥胖已經成為全球性的公共衛(wèi)生問題。肥胖不僅是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)等代謝綜合征的高危發(fā)病因子，還影響機體免疫防御應答，使宿主對感染性疾病更易感[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，每增加40磅體重會使社區(qū)獲得性肺炎的易感性增加2倍，且肺部感染病原菌主要以G-桿菌(肺炎克雷伯菌和大腸埃希氏菌)多見[3-5]。同時，感染對機體代謝也起到重要調控作用，細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)及一些細胞因子等均可引起機體糖脂代謝紊亂，從而促進T2DM、冠心病的發(fā)生[6]。然而，近年來關于肥胖與感染的研究多集中于肥胖對機體免疫系統(tǒng)的影響，少有關于感染對肥胖機體代謝影響的報道。課題組前期研究表明，鼻內滴注40 μL含4×109CFUs大腸桿菌菌液可導致小鼠出現(xiàn)肺部感染及全身炎癥反應，且肥胖小鼠表現(xiàn)出更強烈的炎癥應答，能夠誘導更多炎性細胞、細胞因子、脂肪因子表達[7]。在此基礎上，本實驗通過鼻內滴注大腸桿菌感染高脂誘導的肥胖小鼠構建肺部感染模型，檢測血液及肝臟中糖脂代謝相關指標的變化，初步探討肺部感染對肥胖機體糖脂代謝的影響。

材 料 和 方 法

1 菌株

大腸桿菌從患水腫病竹鼠腹腔積液中分離，由四川農業(yè)大學獸醫(yī)內科實驗室保存。

2 試劑和儀器

游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)、極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)、葡萄糖(glucose，GLU)和胰島素(insulin，INS)ELISA試劑盒均購自R&D；甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)測定試劑盒均購自南京建成生物研究所；酶標儀為Thermo產品。

3 實驗動物

SPF級昆明雄鼠120只，3～4周齡，體重14～16 g，購于成都達碩動物科技有限公司(動物合格證號：0001683)。

4 主要方法

4.1 小鼠肥胖模型的建立 隨機選取60只小鼠飼喂常規(guī)飼料，60只飼喂高脂飼料[7]，連續(xù)飼喂8周，實驗期間小鼠自由攝食及飲水，每周稱量1次體重。根據(jù)人類肥胖標準，將肥胖度大于20%視為肥胖模型建立成功，肥胖度(%)=(實驗組實際體重-對照組平均體重) /對照組平均體重×100%[8]。

4.2 實驗動物的分組與處理 飼喂8周后，從高脂飼喂組中選取造模成功的小鼠48只作為肥胖組，從常規(guī)飼喂組中選取48只小鼠作為對照組，兩組小鼠鼻內滴注40 μL含4×109CFUs的大腸桿菌菌液，構建肺部感染模型[7]，連續(xù)觀察4 d。實驗期間各組小鼠按常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由攝食和飲水。

4.3 樣本采集與指標檢測 于感染前及第1、2、3、4天，每組隨機選取6只小鼠，稱重，經眼球采血并分離血清，用相應的試劑盒檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、空腹胰島素(fasting blood insulin，F(xiàn)INS)、FFA、TG、TC、HDL、LDL和VLDL含量，并計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model of assessment for insulin resistance，HOMA-IR)，計算公式為：HOMA-IR=FBG (mmol/L)×FINS (mIU/L)/22.5；取附睪脂肪和肝臟稱重，計算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器重量/體重×100%)；取部分肝臟進行組織勻漿并按照試劑盒說明書檢測TG含量，另一部分制作冰凍切片，經油紅O染色后在光學顯微鏡下觀察肝臟脂質情況。

5 統(tǒng)計學處理

采用Excel軟件和SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。以單因素方差分析(one-way ANOVA)比較同組各時點間的差異，以獨立樣本t檢驗比較相同時點的組間差異。結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 小鼠體質量、附睪脂肪組織質量及指數(shù)的變化

從圖1可見，高脂飼喂8周，肥胖組小鼠體質量、附睪脂肪組織質量及指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，表明營養(yǎng)性肥胖模型造模成功。

滴鼻大腸桿菌后，2組小鼠體質量、附睪脂肪組織質量及指數(shù)呈先下降后稍有回升的趨勢。與感染前比較，對照組小鼠體質量在感染后2～4 d、附睪脂肪組織質量在感染后3～4 d顯著降低(P<0.05)，且均于第3天達到低谷，而附睪脂肪指數(shù)無顯著性變化；肥胖組小鼠體質量、附睪脂肪組織質量及指數(shù)在感染后1～4 d均顯著降低(P<0.05)，在第3天降至最低。2組間比較，肥胖小鼠體質量、附睪脂肪組織質量及指數(shù)在整個實驗期間均顯著高于對照組(P<0.05)。

Figure 1.The effects of intranasalEscherichiacolion body weight, fat mass and fat index in high-fat diet-induced obese mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group at the same time point;#P<0.05vs0 d in obese group;△P<0.05vs0 d in control group.

圖1 滴鼻大腸桿菌對高脂誘導肥胖小鼠體重、附睪脂肪組織質量及指數(shù)的影響

2 小鼠FBG、FINS水平及HOMA-IR的變化

由圖2可知，高脂飼喂8周，肥胖組小鼠FBG、FINS及HOMA-IR顯著高于對照組(P<0.05)。滴鼻大腸桿菌后，2組小鼠FBG、FINS及HOMA-IR先升高后稍有降低。與感染前比較，對照組FBG、FINS及HOMA-IR在感染后1～4 d顯著升高(P<0.05)，其中FBG在2 d，F(xiàn)INS及HOMA-IR在1 d升到峰值；肥胖組FGB、FINS及HOMA-IR在感染后2～4 d顯著升高(P<0.05)，且均于3 d達到頂峰。與對照組比較，肥胖組FBG在感染后3～4 d，F(xiàn)INS及HOMA-IR在感染后2～4 d顯著升高(P<0.05)。

Figure 2.The effects of intranasalEscherichiacolion the levels of FBG, FINS and HOMA-IR in high-fat diet-induced obese mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group at the same time point;#P<0.05vs0 d in obese group;△P<0.05vs0 d in control group.

圖2 滴鼻大腸桿菌對高脂誘導肥胖小鼠FBG、FINS水平及HOMA-IR的影響

3 小鼠血清中脂代謝相關指標的變化

如圖3所示，高脂飼喂8周，肥胖組小鼠血清FFA、TG、TC、VLDL和LDL-C水平均顯著高于對照組，HDL-C水平顯著低于對照組(P<0.05)，表明高脂飲食導致肥胖小鼠出現(xiàn)血脂代謝紊亂。

滴鼻大腸桿菌后，2組小鼠血清FFA、TG和VLDL水平呈先升高后降低的趨勢，除對照組FFA僅在感染后3～4 d，其余指標均在感染后1～4 d顯著高于感染前(P<0.05)；其中對照組血清FFA和TG在第3天，VLDL在第2天達到峰值，肥胖組血清FFA、TG和VLDL水平則均在第3天升到最高。2組間比較，肥胖組血清FFA、TG和VLDL水平在各個時點均顯著高于對照組(P<0.05)。

2組小鼠血清TC、LDL-C和HDL-C水平則在感染后先下降再緩慢回升。與感染前比較，對照組血清TC僅在感染后1 d， LDL-C和HDL-C在感染后1～4 d顯著降低(P<0.05)，其中LDL-C在第4天，HDL-C在第1天最低；肥胖組TC和LDL-C在感染后1～4 d顯著降低(P<0.05)，第2天降到最低，HDL-C在感染后1～3 d顯著降低(P<0.05)，第1天最低。與對照組比較，肥胖組小鼠TC在第2天，LDL-C在第1～3天，HDL-C在第1～2天顯著降低，LDL-C和HDL-C在第4天顯著升高(P<0.05)。

Figure 3.The effects of intranasalEscherichiacolion the levels of serum lipid metabolism parameters in high-fat diet-induced obese mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group at the same time point;#P<0.05vs0 d in obese group;△P<0.05vs0 d in control group.

圖3 滴鼻大腸桿菌對高脂誘導肥胖小鼠血清中脂代謝相關指標的影響

4 小鼠肝臟組織脂質沉積的變化

從圖4可見，高脂飼喂8周，肥胖組小鼠肝臟質量及指數(shù)、TG含量顯著升高(P<0.05)，油紅O染色結果(圖5)也顯示，感染前肥胖組小鼠肝細胞有少量橘紅色脂滴蓄積，說明高脂飲食可導致小鼠肝細胞脂質積聚。

滴鼻大腸桿菌后，2組小鼠肝臟質量、指數(shù)及肝臟TG含量呈先升高后降低的趨勢。與感染前比較，對照組小鼠肝臟質量在第2天，肝臟指數(shù)在第2～4天，肝臟TG含量在第1～4天均顯著升高(P<0.05)，其中肝臟質量和指數(shù)在第2天，肝臟TG含量在第1天最高；肥胖組肝臟質量、肝臟指數(shù)及TG含量在感染后1～4 d均顯著升高(P<0.05)，其中肝臟質量和指數(shù)在第3天，肝臟TG含量在第2天達最高。油紅O結果也顯示，感染后2和4 d，2組小鼠肝臟橘紅色脂滴均明顯增多。與對照組比較，肥胖組小鼠肝臟質量及TG含量在整個實驗期間均顯著升高(P<0.05)，但肝臟指數(shù)的差異無統(tǒng)計學顯著性。

Figure 4.The effects of intranasalEscherichiacolion hepatic steatosis in high-fat diet-induced obese mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group at the same time point;#P<0.05vs0 d in obese group;△P<0.05vs0 d in control group.

圖4 滴鼻大腸桿菌對高脂誘導肥胖小鼠肝臟脂肪化的影響

Figure 5.The changes of hepatic lipid accumulation (oil red O staining,×400).

圖5 肝臟脂質沉積的變化

討 論

隨著物質生活水平的提高，肥胖已成為繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，對人類健康帶來了嚴重的威脅。隨著對肥胖的關注與重視，人們發(fā)現(xiàn)肥胖不僅是一種機體代謝異常狀態(tài)，也是一種系統(tǒng)慢性低度炎癥，而牙周炎等慢性炎性疾病也被證明有利于肥胖大鼠胰島素抵抗及T2DM的發(fā)生[9]。本研究顯示鼻內滴注大腸桿菌誘導急性肺部感染也可加劇肥胖小鼠糖脂代謝紊亂，促進胰島素抵抗及肝臟脂質沉積的發(fā)生。

通過持續(xù)8周飼喂高脂飼料成功建立小鼠肥胖模型，其體質量、附睪脂肪組織質量及指數(shù)均顯著高于對照組小鼠。感染大腸桿菌后，肥胖小鼠體質量、附睪脂肪組織質量及指數(shù)在感染后1 d急劇下降，直到第4天才稍有回升，對照組小鼠體質量及附睪脂肪組織質量在第3天顯著下降，但脂肪指數(shù)沒有明顯變化，可見在相同感染情況下肥胖小鼠更先動用脂肪組織以滿足體能的消耗，表現(xiàn)出更強的脂解能力。但倪佳[10]研究表明牙周炎感染對肥胖大鼠體質量和脂肪質量均無影響，與我們的結果相矛盾。這可能與實驗動物以及建立肥胖感染模型的方法不一致有關，本實驗采用鼻內滴注大腸桿菌的方式構建小鼠肺部急性感染模型，刺激較大，而倪佳是通過皮下注射谷氨酸鈉溶液構建大鼠肥胖模型，并以4種牙周炎特異性致病菌混合液以埋線的方式誘導牙周炎造成慢性感染。

胰島素抵抗與肥胖緊密相關，是冠心病、T2DM、NAFLD等疾病的共有特征。本實驗中，高脂飼喂8周后肥胖小鼠FGB、FINS水平及HOMA-IR均顯著升高，這與董明等[11]的研究一致。感染后，對照組小鼠FGB、FINS及HOMA-IR在1 d內顯著升高甚至達到肥胖小鼠水平，這可能與感染刺激下動物能量消耗急劇增加，升糖激素大量分泌，肝臟糖異生作用增強有關[12]。而肥胖組小鼠FGB及HOMA-IR在感染后1 d并無顯著性變化，這可能是由于肥胖小鼠本身具有高濃度的FGB，且脂肪組織的大量分解可以快速為受到損害的靶器官提供能量，從而在急性炎癥早期沒有大幅升高；此外，高脂飼喂使肥胖小鼠處于一種慢性炎癥狀態(tài)，由于對慢性炎癥的適應性，因此對急性炎癥可能表現(xiàn)出一定的耐受性。章瑤等[13]研究膳食誘發(fā)肥胖的非糖尿病(Wistar大鼠)對急性炎癥刺激的反應能力時發(fā)現(xiàn)，LPS注射后，Wistar大鼠血糖濃度無明顯變化，與我們的研究結果一致。在感染后2～4 d肥胖小鼠血液中FGB、FINS快速上升，HOMA-IR極顯著高于非肥胖小鼠，出現(xiàn)胰島素抵抗，與鄭世霞[5]對2型糖尿病合并肺炎患者入院后第2天的檢測結果相似。研究表明[8, 14-15]，抵抗素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、FFA及TG的代謝產物二酰甘油等不僅增加肝臟糖異生升高血糖水平，還阻礙胰島素信號通路，一方面使胰島素促進糖原合成的功能減弱，另一方面阻止胰島素介導的GLUT4移位到細胞表面，降低細胞對葡萄糖的攝取誘導胰島素抵抗。課題組的前期研究顯示，鼻內滴注40 μL含4×109CFUs大腸桿菌菌液可導致肥胖小鼠血清中TNF-α、IL-6和抵抗素等炎癥因子水平顯著升高[7]。因此，肥胖小鼠在感染后期出現(xiàn)胰島素抵抗可能與其炎癥應答反應更為強烈有關，但其具體相關性還需進一步研究。

營養(yǎng)性肥胖往往伴隨著脂代謝紊亂，經8周高脂飼喂，肥胖小鼠血液中FFA、TG、TC、LDL和VLDL水平顯著升高，HDL顯著降低，與邱烈峰[16]的研究一致。慢性感染如肺炎衣原體感染[17]、牙周炎等，由于與肥胖機體低度炎癥狀態(tài)類似，可誘導高脂血癥進而參與NAFLD、動脈粥樣硬化等疾病的慢性進程。但Mohammad[18]指出急性呼吸道感染也是心血管事件的主要促發(fā)因子，急性感染也可在幾天或一周左右通過引起突發(fā)性的嚴重炎癥應答，造成急性動脈綜合征。本實驗中，非肥胖及肥胖小鼠血清FFA、TG和VLDL水平在感染后均顯著升高，肝臟質量、指數(shù)及肝臟TG含量明顯增加，肝細胞脂質浸潤加劇，且肥胖小鼠的升高幅度明顯大于非肥胖小鼠，可見肺部感染進一步加劇了肥胖小鼠血脂紊亂及肝臟脂質沉積程度。陽琰等[19]在探討牙周病對T2DM患者糖脂代謝的影響時也得出相似的結論，即T2DM合并牙周患者血清中TG和TC均明顯高于單獨的牙周患者或T2DM患者。這可能與感染刺激下肥胖機體脂肪組織大量分解，血液中FFA及一些脂肪因子和炎癥因子分泌增加有關[20-21]。與之相反的是，2組小鼠血清TC、LDL-C及HDL-C水平在感染后均呈下降趨勢，其中HDL-C下降幅度最大。Tiirola等[22]通過滴鼻5.3×105IFU肺炎衣原體感染NIH/S鼠造成急性呼吸道感染，發(fā)現(xiàn)在感染后3 d小鼠血清TC水平降低，與我們的研究一致。HDL-C作為一種脂蛋白，不僅具有促進膽固醇逆轉運的作用，其在抗感染的過程中也十分重要。研究顯示在急性期HDL可以中和LPS及一些急性期反應蛋白如CRP、SAA等，減弱炎癥應答[23]。因此在感染刺激下小鼠血液中HDL水平下降也許是機體對炎癥刺激的保護性應答，另一方面，其水平的降低也許進一步加劇了肥胖小鼠血脂代謝紊亂的狀態(tài)。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of intranasal Escherichia coli on glucolipid metabolism in high-fat diet-induced obese mice

WANG Zheng-yi, GAN Lin-li, JIA Yi-ping, CUI Heng-min, DENG Jun-liang, ZUO Zhi-cai

(CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang611130,China.E-mail:zzcjl@126.com)

AIM: To study whether the pulmonary infection ofEscherichiacoli(E.coli) interferes the glucolipid metabolism in high-fat diet-induced obese mice. METHODS: High-fat diet-induced obese mice (n=48) and normal chow-fed control mice (n=48) were intranasally infused with 40 μL fluid containing 4×109CFUsE.coli. The serum, periepididymal adipose tissue and liver were obtained at 0 d, 1 d, 2 d, 3 d and 4 d after infection. The body mass, periepididymal adipose tissue and liver were weighed, and the levels of fasting blood glucose (FBG), fasting blood insulin (FINS), free fatty acid (FFA) and very-low-density lipoprotein (VLDL) were measured by ELISA. The serum total cholesterol (TC), triglycerides (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and hepatic TG contents were detected, and the hepatic steatosis was observed under microscope with oil red O staining. RESULTS: Compared with day 0, the body mass, fat mass and fat index were decreased significantly from day 1 to day 4 after infection (P<0.05). The levels of FBG, FINS and HOMA-IR were apparently raised from day 2 to day 4 after infection (P<0.05). The contents of serum FFA, TG and VLDL were increased markedly from day 1 to day 4 after infection (P<0.05). However, the concentrations of serum TC, LDL-C and HDL-C were decreased obviously from day 1 to day 3 (P<0.05). The liver mass, liver index and TG content were significantly increased from day 1 to day 4 (P<0.05). Consistently, the lipid droplet accumulation in the liver cells was increased obviously at day 2 and day 4 after infection. Compared with control group, except the levels of serum TC, LDL-C and HDL-C in obese group substantially decreased, the other indexes were increased by different degrees during the whole experiment period (P<0.05). CONCLUSION: Pulmonary infection ofEscherichiacoliexacerbates the disorder of glucose and lipid metabolism in high-fat diet-induced obese mice, which contributes the development of insulin resistance and hepatic steatosis.

Obesity; Infection; Glucolipid metabolism

1000- 4718(2017)01- 0060- 07

2016- 09- 07

2016- 11- 01

四川省科技廳支撐項目(No. 2013NZ0032)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.010

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