孟易禹， 王 雪， 黃棟棟， 金巧智， 陳武兵， 蔡志毅,△

(1溫州醫(yī)科大學第一臨床學院，浙江 溫州 325000； 2臺州市立醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 臺州 318000)

?

沉默TRIM27基因?qū)Ρ茄拾?-8F細胞增殖、侵襲與遷移的影響

孟易禹1， 王 雪1， 黃棟棟1， 金巧智2， 陳武兵2， 蔡志毅1,2△

(1溫州醫(yī)科大學第一臨床學院，浙江 溫州 325000；2臺州市立醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 臺州 318000)

目的： 檢測TRIM27蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽部正常組織中的表達水平，觀察沉默TRIM27對鼻咽癌5-8F細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。方法: 通過免疫組化技術(shù)檢測鼻咽癌組織和鼻咽部正常組織中TRIM27的表達水平，采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)和Western blot法分別檢測5-8F細胞和NP69細胞中TRIM27的mRNA和蛋白表達水平；利用脂質(zhì)體2000將TRIM27干擾序列轉(zhuǎn)入5-8F細胞中；采用real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中TRIM27 mRNA表達水平的變化，Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后細胞中TRIM27蛋白水平的變化；CCK-8法檢測細胞活力的變化；細胞平板集落形成實驗觀察轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力的變化；Transwell實驗檢測細胞侵襲能力的變化；劃痕實驗觀察細胞遷移能力的變化。結(jié)果: 免疫組化結(jié)果顯示TRIM27在鼻咽癌組織中的表達率高于鼻咽部正常組織；TRIM27基因沉默后5-8F細胞增殖、侵襲和遷移能力均明顯受到抑制(P<0.05)。結(jié)論:TRIM27在鼻咽癌5-8F細胞中可能充當癌基因的角色。沉默TRIM27基因可以明顯抑制鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。

TRIM27蛋白； 鼻咽癌； 細胞增殖； 細胞侵襲； 細胞遷移

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的腫瘤，常發(fā)生在鼻咽部咽隱窩和頂前壁，是我國南方各省及東南亞地區(qū)最常見的頭部惡性腫瘤之一，其分布具有明顯的地域性和種族性，個別城市的發(fā)病率高達20.32/100 000[1]。研究表明，鼻咽癌的發(fā)病與多種因素有關(guān)，包括EB病毒感染、遺傳易感性、環(huán)境因素等。目前的研究尚未鑒定出與NPC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的癌基因和抑癌基因，NPC的發(fā)病機制仍不十分清楚。放療仍是目前臨床上治療鼻咽癌的主要手段，但由于鼻咽癌浸潤生長快，惡性程度高，解剖位置深且隱蔽、周圍淋巴結(jié)豐富，早期病灶小，癥狀不典型，臨床上易忽略及誤診，而且發(fā)病早期就可能發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至遠處轉(zhuǎn)移，鼻咽癌放療后容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，影響其預(yù)后。因此尋找特異性早期診斷的分子標志以及靶向基因治療的新策略成為當前腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究的熱點。

三結(jié)構(gòu)域蛋白(tripartite motif protein，TRIM)家族是一個結(jié)構(gòu)保守、進化快速的蛋白家族，目前人類基因組已發(fā)現(xiàn)和鑒定了多種TRIM蛋白。近年來其家族成員的功能研究也越來越受到重視。研究報道，TRIM蛋白在許多細胞生物過程，如細胞凋亡、細胞周期的調(diào)控及病毒學應(yīng)答，均發(fā)揮著重要作用[2-5]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)[6-7]。三結(jié)構(gòu)域蛋白27(tripartite motif protein 27，TRIM27)屬于TRIM蛋白家族，基因定位于染色體6p22上。研究發(fā)現(xiàn)TRIM27在腫瘤發(fā)生或分化過程中可能扮演轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的角色，并參與細胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等過程，因此可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-11]。本實驗通過對比研究TRIM27 mRNA及蛋白在5-8F細胞和NP69細胞中的表達情況，探討TRIM27在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，旨在為進一步探討鼻咽癌的早期診斷的分子標志以及靶向基因治療提供新的依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 組織標本

標本來自2008～2015年間臺州市立醫(yī)院耳鼻咽喉科鼻咽癌手術(shù)切除的標本，其中實驗組鼻咽癌組織45例經(jīng)病理證實均為鼻咽部低分化鱗癌，收集同期15例正常鼻咽部組織作為對照組。所有鼻咽癌患者均為首次確診，且尚未接受任何治療。標本使用獲醫(yī)院倫理委員會批準。

2 材料

人低分化 5-8F 鼻咽癌細胞株及永生化NP69鼻咽上皮細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；二步法超敏免疫組化檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、Opti-MEMI無血清培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA 消化液均購自Gibco；PBS緩沖液購自 Thermo；CCK-8試劑盒購自Bryotime；TRIzol reagent、cDNA第一鏈合成試劑盒和 Real MasterMix (SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒購自Tiangen；兔來源多克隆TRIM27抗體購自Proteintech；兔抗人GAPDH抗體購自杭州賢至生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG Ⅱ抗購自北京索來寶生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 石蠟切片免疫組織化學 免疫組化檢測石蠟標本鼻咽癌及正常鼻咽部組織TRIM27蛋白的分布情況。10%甲醛浸泡, 脫水后常規(guī)石蠟包埋, 3 μm連續(xù)切片, 二甲苯脫蠟, 梯度乙醇去二甲苯，PBS洗滌, 滴加3% H2O2室溫靜置10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌，枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)中高壓加熱法修復(fù)抗原，5%山羊血清封閉20 min, 滴加TRIM27抗體(1∶100)4 ℃過夜，以PBS代替 Ⅰ 抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照，37 ℃復(fù)溫45 min，PBS洗滌，滴加Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體)37 ℃、1.5 h，PBS清洗后DAB顯色，顯微鏡下判斷染色情況，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，鏡檢，顯微圖像分析系統(tǒng)拍照。實驗結(jié)果判斷標準參照Carcangiu等[12]半定量評分方法, 根據(jù)陽性細胞著色強度和陽性細胞數(shù)量計分, 陽性著色強度按無色、淡棕色、棕黃色和棕褐色分別記為0、1、2和3分；再在高倍鏡(×400)下對每張切片隨機選取5個高倍鏡視野, 計數(shù)500個細胞/視野, 共計2 500個,陽性細胞數(shù)按<5%、5%～35%、36%～70%和>70%分別記為0、1、2和3分。取兩項評分的乘積進行綜合評分, ≤1分為陰性，2～3分為弱陽性,4～5分為中度陽性，≥6分為強陽性。合并陰性和弱陽性作為陰性表達標準, 中度陽性和強陽性作為陽性表達標準。

3.2 細胞培養(yǎng) 將5-8F細胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，1～2 d換液，傳代培養(yǎng)。

3.3 5-8F細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率的檢測 實驗分為 siRNA-TRIM27+Lipo2000組 (si-TRIM27組)、陰性對照(negative control, NC)+Lipo2000組(NC組)和正?？瞻讓φ?control)組。將5-8F細胞以每孔3×105個接種于6孔板，培養(yǎng) 24 h后換新鮮培養(yǎng)液，按操作說明以等量Opti-MEMI無血清培養(yǎng)基分別稀釋適當量的si-TRIM27和Lipo2000，混勻后各自室溫靜置5 min，后將兩者混勻室溫下共孵育15～20 min，加入培養(yǎng)板中，輕輕混勻，放入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，隔6～8 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染帶熒光的FAM-NC時，所有操作均需避光，并以錫箔紙包被培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后用PBS沖洗1次，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并拍照。

3.4 Real-time PCR檢測TRIM27的干擾效率 各組 5-8F 細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染 48 h后，按照TRIzol 說明書中步驟提取細胞總RNA，取RNA于紫外分光光度計下測A260/A280，比值處于1.8～2.1之間則符合純度要求。按miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制逆轉(zhuǎn)錄試劑，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按real-time PCR說明書配制反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min； 95 ℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)以GAPDH為內(nèi)參照。TRIM27的上游引物序列為5’-GGCAGUGUCUUUGUGGUAUTT-3’，下游引物序列為5’-AUACCACAAAGAACUGCCTT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。記錄各孔Ct值，取各孔平均值作為結(jié)果，并采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進行分析。

3.5 Western blot檢測TRIM27的干擾效率 分別收集對數(shù)期的5-8F及NP69細胞于1.5 mL離心管中，1 200 r/min離心3 min，棄上清液，加1 mL PBS吹打均勻，1 200 r/min離心3 min，棄上清液后PBS重復(fù)洗滌 1 次。各孔加入200 μL預(yù)冷的RIPA裂解液，置于冰上20 min使其充分裂解細胞。將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清，收集的上清液即為樣本蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。于樣品中加入5×SDS凝膠電泳上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。順序加樣，待電泳分離完全后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST充分洗膜后加特異性Ⅰ抗[GAPDH(1∶10 000)和TRIM27(1∶1 000)]，4 ℃ 過夜孵育，Ⅱ 抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，充分洗膜后加ECL發(fā)光液顯影，ImageQuant LAS 4000 Mini 凝膠成像儀自動曝光，并分析灰度值，計算各組與內(nèi)參照 GAPDH 灰度的相對比值。每個樣本重復(fù) 3 次實驗。

3.6 CCK-8 法檢測細胞活力 取96孔板按上述方法轉(zhuǎn)染各組5-8F細胞， 另于標準空白孔中加不含細胞的完全培養(yǎng)液(每組取 4 孔)，培養(yǎng)48 h后于每孔中加入10 μL CCK-8試劑，輕晃混勻，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，再測450 nm波長下每孔的A值，觀察各組的細胞活力變化情況。

3.7 平板集落形成實驗 于6孔板中轉(zhuǎn)染各組5-8F細胞24 h后，胰酶消化，1 000 r/min 離心 5 min 收集細胞，重懸細胞并計數(shù)，以每孔100個接種于新的 6 孔板中，并盡量使細胞均勻分布于板底，放入培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d，或至肉眼可見克隆斑時，棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌 1 次后加10%甲醛固定15 min，PBS 洗2次后用結(jié)晶紫染色30 min，PBS 洗凈后晾干，拍照。

3.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 將Matrigel從-20 ℃取出，4 ℃解凍后置于冰上，用無血清1640培養(yǎng)基將Matrigel稀釋至50 mg/L，按每孔50 μL加入Transwell小室的上室，超凈臺內(nèi)風干過夜。使用前每孔加入100 μL含1%牛血清白蛋白的無血清1640培養(yǎng)液，37 ℃靜置1 h后吸去小室內(nèi)液體備用。Transwell小室杯孔直徑為6.5 mm，杯底由聚碳酸脂微孔濾膜封閉(微孔孔徑為8 μm)。用無血清1640培養(yǎng)基制備轉(zhuǎn)染后的5-8F單細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度1×108/L。每孔加入 200 μL的細胞懸液至Transwell上腔小室,加入 500 μL含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基至 Transwell 下腔小室。放入37 ℃、5% CO2細胞培育箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，PBS輕輕洗滌2次，并用棉球擦去上室內(nèi)的細胞。4%多聚甲醛室溫下固定15 min，1%結(jié)晶紫染色5 min，倒置顯微鏡下觀察并隨機選擇3個視野進行細胞計數(shù)，拍照，重復(fù) 3 次。下室面的細胞代表遷移率(平均遷移細胞數(shù)/平均注入細胞數(shù))，每組預(yù)設(shè)3次實驗。

3.9 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 用標記筆在孔板背面均勻地畫根平行線，相鄰平行線間的平均間距為5 mm。取對數(shù)期細胞，用含10%小牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為3×105個，于6孔板每孔中加入細胞懸液2 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞匯合90%左右時，吸棄培養(yǎng)基，用200 μL的Tip頭沿垂直背面所畫平行線劃痕，PBS液洗3遍，加入無血清培養(yǎng)液，0 h、24 h和48 h后分別在倒置顯微鏡下觀察并拍照，用ImageJ 1.46軟件對縮窄距離進行分析，按照以下公式來計算細胞遷移率：遷移率(%)=(初始劃痕的寬度值-相應(yīng)點的劃痕寬度值)/初始劃痕的寬度值×100%。實驗重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用 Bonferroni校正的t檢驗，率的比較采用2檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 免疫組化實驗結(jié)果

免疫組化檢測鼻咽癌和正常鼻咽部組織的蛋白表達情況及定位。實驗結(jié)果顯示，TRIM27蛋白在鼻咽癌的胞漿胞核均有表達，以胞核為主，見圖1。TRIM27在鼻咽癌中的表達率顯著高于正常鼻咽部組織(P<0.01)，見表1。

Figure 1.The immunohistochemical analysis of nasopharyngeal carcinoma (A) and normal nasopharyngeal tissues (B) stained for TRIM27 expression (×200).

圖1 TRIM27在鼻咽癌及正常鼻咽部組織中免疫組化結(jié)果

表1 免疫組化檢測TRIM27在鼻咽癌和正常鼻咽部組織中的表達情況

Table 1.The expression of TRIM27 in nasopharyngeal carcinoma and normal nasopharyngeal tissues detected by immunohistochemical staining

GroupnPositiveNegativeNPC4540?? 5??Normal15312

**P<0.01vsnormal.

2 細胞轉(zhuǎn)染情況

用帶有FAM熒光蛋白的無關(guān)序列(FAM-NC)轉(zhuǎn)染人鼻咽癌5-8F細胞24 h 后，吸去6孔板內(nèi)培養(yǎng)基并用PBS沖洗3～4次，于熒光顯微鏡下觀察并拍照， 以熒光下細胞數(shù)/白光下細胞數(shù)表示轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率在90%左右，見圖2。

3 Real-time PCR和Western blot檢測si-TRIM27的干擾效率

人鼻咽癌5-8F細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染si-TRIM27或NC siRNA處理48 h，提取各組細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 經(jīng) real-time PCR 檢測結(jié)果。根據(jù)2-ΔΔCt法

Figure 2.The expression of FAM fluorescin in the human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells 24 h after transfection (×100).

圖2 轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下FAM熒光蛋白的表達

計算出TRIM27在si-TRIM27組、NC組及空白對照組的相對表達量分別為0.12±0.02、0.96±0.02和0.97±0.01，應(yīng)用單因素方差分析對計算結(jié)果進行統(tǒng)計顯示轉(zhuǎn)染后si-TRIM27組的TRIM27的相對表達量相對NC組及空白對照組明顯下調(diào)(P<0.01)，NC組和空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性。Western blot實驗結(jié)果表明，人鼻咽癌5-8F細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染si-TRIM27或NC處理48 h后，si-TRIM27組、NC組及空白對照組的TRIM27的蛋白相對表達量分別為0.18±0.02、0.42±0.03和0.44±0.02，si-TRIM27組相對NC組及空白對照組明顯下調(diào)(P<0.01)，NC組和空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

4 干擾TRIM27對5-8F細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結(jié)果表明，si-TRIM27組、NC組及空白對照組的A值分別為0.64±0.02、0.93±0.03和0.95±0.02，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，si-TRIM27組的A值與NC組和空白對照組的相比差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，然而NC組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性。結(jié)果表明，下調(diào)TRIM27的表達后5-8F細胞的活力明顯降低。集落形成實驗結(jié)果顯示，si-TRIM27組、NC組及空白對照組的菌落數(shù)分別為78±7、204±6和196±8，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，si-TRIM27組的菌落數(shù)與NC組和空白對照組相比差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，然而NC組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，進一步證實了下調(diào)TRIM27的表達后5-8F細胞的集落形成能力受到抑制，見圖4。

5 干擾TRIM27表達對5-8F細胞侵襲能力的影響

細胞體外侵襲實驗結(jié)果顯示，si-TRIM27組的小室其穿膜細胞數(shù)為每視野162±6，NC組的穿膜細胞數(shù)為每視野226±8，control組的穿膜細胞數(shù)為每視野236±7，與NC組和control組相比，si-TRIM27組的5-8F細胞侵襲能力明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，NC組和control組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖5。

Figure 3.The relative expression of TRIM27 at mRNA (A) and protein (B) levels in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells 24 h after tansfection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-TRIM27.

圖3 5-8F細胞轉(zhuǎn)染24 h后TRIM27的mRNA和蛋白相對表達量

6 干擾TRIM27表達對5-8F細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，si-TRIM27組、NC組及control組的細胞遷移率分別為0.33±0.03、0.71±0.01和0.73±0.02，與NC組和control組相比，si-TRIM27組的5-8F細胞侵襲能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，NC組和control組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖6。

討 論

TRIM27作為TRIM蛋白家族中的成員之一，曾被報道在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、細胞周期、細胞分化、腫瘤細胞遷移等多種生命過程中都有功能，并與腫瘤的分期及預(yù)后等密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生及演化過程中發(fā)揮重要作用。以往的研究報道表明，TRIM27在多種人類癌細胞系中高表達，比如子宮內(nèi)膜癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、精原細胞癌等，這表明它可能參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展[13-15]。但TRIM27在鼻咽癌中的研究國內(nèi)外報道甚少，本實驗通過real-time PCR、Western blot及免疫組化方法對比研究TRIM27 mRNA和蛋白在鼻咽癌5-8F細胞和NP69細胞中的表達情況及TRIM27在鼻咽癌組織和正常鼻咽部組織中的表達情況，免疫組化實驗結(jié)果表明，TRIM27在45例鼻咽癌中陽性率高達88.9%，明顯高于正常鼻咽部組織。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，TRIM27在5-8F細胞中無論是基因水平還是蛋白水平明顯高于NP69細胞。這些都提示TRIM27可能在鼻咽癌中扮演癌基因的角色，在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

Figure 4.The proliferation of human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells 24 h after tansfection detected by CCK-8 assay (A) and cell colony formation assay (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-TRIM27.

圖4 CCK-8法和平板集落形成實驗檢測轉(zhuǎn)染24 h后各組細胞的增殖情況

Figure 5.The effect of knockdown ofTRIM27 expressive on the invasive ability of human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells (co-lored by 0.1% crystal violet, ×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-TRIM27.

圖5 干擾TRIM27后對細胞侵襲能力的影響

Figure 6.The effect of knockdown ofTRIM27 expression on the migratory ability of human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells. Scale bars at 0 h were 50 μm, while those at 24 h were 200 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-TRIM27.

圖6 干擾TRIM27后對細胞遷移能力的影響

研究發(fā)現(xiàn)TRIM27是原癌基因RET的融合伴侶，而RET基因是一種編碼受體酪氨酸激酶的基因，具有與其它跨膜受體相似的特點，可以和其它基因結(jié)合重排而活化，從而調(diào)節(jié)細胞的生長分化。當神經(jīng)營養(yǎng)因子等配體與RET蛋白結(jié)合并形成二聚體后，RET蛋白胞內(nèi)酪氨酸激酶功能區(qū)域發(fā)生自體磷酸化，接著可以使底物分子磷酸化從而激活下游信號通路。RET蛋白可以通過激活Ras 激活MAPK通路，也可以通過生長因子受體連接蛋白和生長因子受體因子連接蛋白黏合因子激活PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)途徑，進一步活化AKT通路等[16-17]。這些下游信號的激活可以啟動一系列級聯(lián)放大反應(yīng)，促進細胞過度增殖和分化，和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。而TRIM27作為RET的伴侶基因，可能也通過MAPK通路或AKT通路來調(diào)控腫瘤細胞的增殖和分化。有研究表明，牛蒡子苷元及miRNA-7也可通過PIK3/AKT通路來調(diào)控鼻咽癌細胞的增殖和凋亡，因此TRIM27和牛蒡子苷元等可能有部分相似的調(diào)控機制[19-20]。TRIM27的過表達還能通過MDM2和AKT的蛋白酶體降解誘導(dǎo)細胞凋亡[18]。這提示 TRIM27 對于誘導(dǎo)細胞凋亡具有重要作用，可能作為一個靶點來控制腫瘤細胞的凋亡。在其它腫瘤中如卵巢癌，研究發(fā)現(xiàn)TRIM27充當癌基因的角色，其高表達與卵巢癌FIGO分期呈正相關(guān)，下調(diào)TRIM27的表達后，可通過P38/MAPK及AKT通路影響細胞周期，抑制細胞凋亡[21]。

本研究通過特異性siRNA干擾TRIM27在5-8F細胞中的表達，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示Lipo2000瞬時轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率在90%左右，real-time PCR和Western blot結(jié)果提示TRIM27表達量的確下降。轉(zhuǎn)染后經(jīng)CCK-8實驗檢測發(fā)現(xiàn)，si-TRIM27組的鼻咽癌5-8F細胞活力較NC組及control組明顯受抑制；而平板集落形成實驗則顯示轉(zhuǎn)染后腫瘤細胞克隆斑形成數(shù)量較NC組及control組顯著減少；Transwell及細胞劃痕實驗分結(jié)果顯示干擾TRIM27的表達可顯著抑制鼻咽癌5-8F細胞侵襲和遷移能力。

綜上所述，TRIM27在鼻咽癌中高表達可能扮演癌基因的角色，通過特異性siRNA干擾下調(diào)TRIM27的表達可以顯著抑制鼻咽癌5-8F細胞的增殖及侵襲遷移能力。然而，TRIM27在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控是否通過MAPK或AKT信號通路促進鼻咽癌5-8F細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移有待進一步研究。這也是本課題組下一步的研究方向，闡明這些機制將更有助于為鼻咽癌的診斷和治療提供新的候選分子，也為進一步研究TRIM27對鼻咽癌5-8F細胞生物學功能的影響奠定了基礎(chǔ)。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Knockdown of TRIM27 expression regulates cell proliferation, invasion and migration in human nasopharyngeal 5-8F carcinoma cells

MENG Yi-yu1, WANG Xue1, HUANG Dong-dong1, JIN Qiao-zhi2, CHEN Wu-bing2, CAI Zhi-yi1,2

(1TheFirstClinicalMedicalInstitute,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China;2DepartmentofOtolaryngology,TaizhouMunicipalHospital,Taizhou318000,China.E-mail:caizy008@tom.com)

AIM: To investigate the expression characteristics of TRIM27 in human nasopharyngeal carcinoma tissues, nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells and NP69 cells, and to observe the effect of TRIM27 on the proliferation, invasion and migration of 5-8F cells.METHODS: The levels of TRIM27 in the nasopharyngeal carcinoma tissues and normal nasopharyngeal epithelial tissues were observed by the method of immunohistochemistry. The mRNA and protein levels of TRIM27 in the 5-8F cells and NP69 cells were determined by real-time PCR and Western blot.TRIM27 siRNA was transfected into the 5-8F cells with Lipofectamine 2000. The relative mRNA expression of TRIM27 was detected by real-time PCR. The relative protein expression of TRIM27 was detected by Western blot. The cell proliferation was analyzed by CCK-8 assay and cell colony formation assay. The change of cell invasion was examined by Matrigel invasion assay. The change of cell migration were examined by wound healing assay. RESULTS: The results of immunohistochemistry showed that the protein expression of TRIM27 in the nasopharyngeal carcinoma tissues was obviously higher than that in the normal nasopharyngeal epithelial tissues. The results of real-time PCR and Western blot showed that the mRNA and protein levels of TRIM27 in the 5-8F cells were obviously higher than those in the NP69 cells. The abilities of proliferation, invasion and migration in the 5-8F cells were significantly suppressed afterTRIM27 gene silencing (P<0.05). CONCLUSION:TRIM27 acts as a oncogene in the 5-8F nasopharygeal carcinoma cells. The abilities of proliferation, invasion and migration are significantly suppressed afterTRIM27 gene silencing in the 5-8F cells.

TRIM27 protein; Nasopharyngeal carcinoma; Cell proliferation; Cell invasion; Cell migration

1000- 4718(2017)01- 0053- 07

2016- 05- 10

2016- 11- 14

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.009

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