衛(wèi) 冬， 張曉娟， 劉 潔， 宋秋穎△

(牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院 1眼科， 2放射科， 黑龍江 牡丹江 157011)

?

Survivin抑制劑YM155對視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞線粒體凋亡途徑的影響*

衛(wèi) 冬1， 張曉娟2， 劉 潔1， 宋秋穎1△

(牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院1眼科，2放射科， 黑龍江 牡丹江 157011)

目的： 探討人生存素(survivin)抑制劑YM155{4，9-二氫-1-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-4，9-二氧代-3-(2-吡嗪甲基)-1H-萘并[2，3-d]咪唑鎓溴化物}對視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞凋亡、線粒體膜電位(Δψm)和細胞色素C(Cyt C)的影響，探討其誘導Y79細胞凋亡的線粒體機制。方法: 體外培養(yǎng)Y79細胞，分別以0、0.5、1、2、4、8 nmol/L的YM155進行處理，采用CCK-8法和溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)摻入標記法檢測YM155對Y79細胞增殖的抑制作用。Y79細胞隨機分為4組：對照組、陽性對照組[加入10 nmol/L拓撲替康(topotecan)]和低劑量(1 nmol/L)、高劑量(2 nmol/L) YM155組。每組設3個復孔，處理24 h。分別采用TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測凋亡的情況；采用JC-1活細胞染色檢測Δψm的變化；采用免疫熒光分析檢測Cyt C的分布；采用Western blot法檢測survivin和線粒體內Cyt C的蛋白表達。結果: 與對照組比較，YM155對Y79細胞增殖具有明顯抑制作用，并誘導Y79細胞凋亡(P<0.05)；YM155顯著降低Y79細胞的Δψm，促進Cyt C由線粒體釋放至胞漿，降低線粒體內Cyt C的水平(P<0.05)。結論: YM155對Y79細胞增殖具有抑制作用，并誘導細胞凋亡，其機制可能是通過線粒體介導的細胞凋亡途徑實現(xiàn)的。

視網(wǎng)膜母細胞瘤； YM155； 細胞凋亡； 線粒體凋亡途徑

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種嚴重的致殘致死的小兒眼內惡性腫瘤，通常在出生后的第1年發(fā)病，往往好發(fā)于一側眼球，發(fā)病率約1/17 000，近年來發(fā)病率有上升趨勢[1]，危害著許多兒童的健康。有關于RB的確切發(fā)病機制，目前仍然不清楚，但是有研究表明，凋亡抑制蛋白人生存素(survivin)表達升高可能是RB的發(fā)病機制之一[2-3]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族成員中分子質量最小的蛋白質，在正常分化成熟組織中幾乎不表達，但是對腫瘤細胞的增殖、凋亡、細胞周期以及血管形成起重要的調節(jié)作用，尤其是其強大的抑制凋亡能力，作為近年來發(fā)現(xiàn)的抗凋亡作用最強的細胞調節(jié)因子之一，已經(jīng)成為腫瘤治療一個新的重要靶點[4-5]。YM155 是一種咪唑類化合物，也是survivin的第一個特異性抑制劑，可明顯抑制腫瘤細胞survivin的表達水平，在腫瘤治療研究中得到了廣泛的關注。研究表明，YM155對多種腫瘤細胞有抑制作用，如乳腺癌、腎癌、胃癌、白血病等[6-9]。但是，有關于YM155對RB的作用卻鮮見報道，因此本研究以YM155和Y79細胞為研究對象，旨在探討YM155對Y79細胞的抑制作用以及誘導凋亡是否與線粒體途徑有關。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞株 視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞由中國科學院上海細胞庫提供。復蘇Y79細胞，培養(yǎng)在含有10%熱滅活胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液(含碳酸氫鈉2.0 g/L、青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L)中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。待細胞生長到對數(shù)生長期的時候，1 200 r/min離心5 min，收集細胞，Hank 液洗滌細胞2次，然后用不含有BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細胞，制備成單細胞懸液，用于后續(xù)實驗。

1.2 藥物及配制 YM155(Selleckchem；純度>98%)，溶解于ddH2O，配制成10 nmol/L儲備液，-20 ℃冰箱保存，臨用時以RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.3 主要試劑 拓撲替康(貴州漢方制藥有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；BrdUIn-SituDetection Kit(BD)；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI試劑盒(南京凱基生物有限公司)；DAPI(上海碧云天公司)；線粒體抽提試劑盒和Hoechst 33258染料(Biowest)；JC-1線粒體膜電位(Δψm)檢測試劑盒(Genmed)；鼠抗人survivin和細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)單克隆抗體(Santa Cruz)；辣根過氧化物酶(HRP)標記抗鼠IgG II抗(Sigma)。

2 方法

2.2 Y79細胞凋亡的檢測 (1) 使用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒檢測YM155對Y79細胞凋亡的影響。取對數(shù)生長期Y79細胞，按照每孔1×106個細胞接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下過夜培養(yǎng)。對照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)液；陽性對照組加入10 nmol/L拓撲替康；低劑量YM155組加入1 nmol/L YM155；高劑量YM155組加入2 nmol/L YM155。各組細胞均在37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。PBS沖洗 3 min、2次，然后-20 ℃甲醇固定15 min。1 mL PBS沖洗 3 min、3次，加入50 μL TUNEL反應液，避光37 ℃孵育1 h。1 mL PBS沖洗3 min、2次，Hoechst 33258染料37 ℃避光染色10 min。Olympus BX43熒光顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)。每個圖片隨機選取6個高倍視野，計算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI; %)=TUNEL陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。(2) Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術分析：分組同上。1 200 r/min離心5 min，收集細胞，1 mL PBS沖洗2次，然后加入490 μL 1×上樣緩沖液混勻。最后加入50 mg/L Annexin V-FITC和PI液各5 μL，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)60 min，BD FACScan流式細胞儀檢測Y79細胞的凋亡情況。每組設6個平行孔。

2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測Δψm分組同2.2。1 200 r/min離心5 min，收集細胞，1 mL PBS沖洗2次，加入2 μL JC-1液，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)130 min。以LSM510 META激光共聚焦顯微鏡按照JC-1 Δψm檢測試劑盒說明書步驟測量熒光信號。按照JC-1不同形式所發(fā)射的熒光不同，以紅色/綠色熒光比值(FL2/FL1)表示Δψm的變化。ImageJ軟件計算FL2/FL1。每組測量6次。

2.4 免疫熒光分析 分組同2.2。待細胞爬滿爬片，取出，1 mL PBS沖洗2次，3.7%低聚甲醛固定30 min，1 mL PBS沖洗2次，5% BSA室溫封閉15 min，0.2% Triton X-100處理15 min，然后與抗Cyt C小鼠單克隆抗體(1∶50稀釋)一起于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)1 h。1 mL PBS沖洗2次，加入FITC 標記山羊抗小鼠IgG II 抗(1∶400稀釋)，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)30 min，DAPI處理10 min，LSM510 META激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。每組設6個平行孔。

2.5 Western blot法檢測survivin和Cyt C的蛋白水平 分組同2.2。1 200 r/min離心5 min，收集細胞，加入含有25 mmol/L HEPES、1% Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L PMSF和1 mg/L亮肽素的冰冷的裂解緩沖液(pH 7.4)，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄沉渣，收集上清液，BCA法測定總蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣后進行10% SDS-PAGE。當電泳完成后，電轉至0.45 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉PBST(含25 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl和0.1% Tween 20, pH 7.5)4 ℃封閉2 h。然后分別加入鼠抗人survivin和Cyt C單克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后，加入HRP標記的 II 抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h。PBST洗滌 5 min、3次，ECL化學發(fā)光試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對各組條帶進行計值及統(tǒng)計分析。Cyt C檢測的線粒體提取過程嚴格按照線粒體抽提試劑盒說明操作。β-actin抗體孵育方法與上述方法相同，蛋白的相對表達強度=目標蛋白表達強度/β-actin蛋白表達強度。每份樣品檢測6次。

3 統(tǒng)計學處理

計量數(shù)據(jù)采用Graphpad 5.0軟件進行描述性統(tǒng)計。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，首先對數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性進行檢驗，經(jīng)檢驗所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，繼之多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 YM155對Y79細胞細胞增殖的影響

庫存管理子系統(tǒng)可以多維度管理庫存物料，主要有貨位管理、批次管理、序列號管理和出入庫管理、預警管理、盤點管理?？梢詮念悇e、庫別、貨位、批次、項目等不同的角度來管理庫存物品的數(shù)量、庫存成本和資金占用情況?？梢园床煌男枰从硯齑娴姆植记闆r，同時，庫存管理還能滿足傳統(tǒng)的收發(fā)存匯總表，能夠定義分部門統(tǒng)計等功能。

CCK-8實驗檢測結果顯示，Y79細胞經(jīng)0、0.5、1、2、4、8 nmol/L YM155處理24 h、48 h和72 h后，YM155以濃度和時間依賴性抑制Y79細胞的活力，相對細胞活力顯著降低，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；YM155作用24 h、48 h和72 h的IC50分別為(2.59±0.31)nmol/L、(1.76±0.23)nmol/L和(1.44±0.20)nmol/L。BrdU摻入法檢測結果顯示，Y79細胞經(jīng)0、0.5、1、2、4、8 nmol/L YM155處理24 h后，BrdU陽性細胞數(shù)和標記指數(shù)顯著降低，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結果提示，YM155可以抑制Y79細胞增殖，見圖1。

2 YM155誘導Y79細胞凋亡

2.1 TUNEL染色結果 TUNEL染色檢測結果顯示，對照組Y79細胞核呈藍色，邊緣光滑完整，均勻淡染。低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽性對照組Y79細胞部分染色質出現(xiàn)濃縮狀態(tài)和邊緣化，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術分析結果 流式細胞術檢測結果顯示，低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽性對照組Y79細胞凋亡率顯著升高，且呈劑量依賴性，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

3 線粒體膜電位的變化

JC-1活細胞染色結果顯示，對照組Y79細胞紅綠熒光變化不明顯；低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽性對照組Y79細胞出現(xiàn)明顯紅綠熒光變化，F(xiàn)L2/FL1顯著減小，Δψm降低，且呈濃度依賴性，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

4 YM155對Y79細胞Cyt C分布的影響

對照組Y79細胞胞漿內僅見微弱的熒光信號；低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽性對照組Y79細胞，胞漿內出現(xiàn)明顯增強的熒光信號，見圖5。

5 Western blot檢測YM155對Y79細胞survivin和Cyt C蛋白水平的變化

Western blot分析結果顯示，低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽性對照組Y79細胞的survivin蛋白表達逐漸下調，而Cyt C的蛋白表達逐漸上調，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 1.The effect of YM155 at different concentrations on the proliferation of Y79 cells. A: the results of CCK-8 assay; B: the results of BrdU incorporation assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 nmol/L.

圖1 不同濃度YM155對Y79細胞增殖的影響

Figure 2. Induction of Y79 cell apoptosis by YM155 observed by TUNEL staining. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 YM155誘導Y79細胞凋亡的TUNEL染色結果

Figure 3. The results of flow cytometry analysis for determining the Y79 cells apoptosis induced by YM155. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 YM155誘導Y79細胞凋亡的流式細胞術結果

Figure 4. The JC-1 staining of the Y79 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4 Y79細胞JC-1活細胞染色結果

Figure 5.The immunofluorescence of Cyt C in the Y79 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 Y79細胞Cyt C免疫熒光染色的結果觀察

Figure 6. The Western blot results of survivin and Cyt C protein levels in the Y79 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6 Y79細胞Western blot結果

討 論

基于survivin表達升高，是RB的發(fā)病機制之一[2-3]，本研究以survivin抑制劑YM155和Y79細胞為研究對象，探討YM155潛在的對RB治療作用。雖然RB的細胞株比較多，如HXO-RB44細胞、SO-RB50細胞和Y79細胞等，但是研究凋亡的大多采用Y79細胞，而且Y79細胞的研究技術非常成熟，故此，本研究以Y79細胞作為RB的代表細胞。本研究結果證實，YM155可顯著抑制Y79細胞survivin的表達。本研究結果發(fā)現(xiàn)，YM155對Y79細胞增殖有一定抑制作用，提示YM155可作為RB的潛在藥物。同時流式細胞術和TUNEL染色分析證實，YM155可誘導Y79細胞凋亡。細胞凋亡是由一系列復雜的信號傳導通路和基因調控的一種生理性死亡過程，對保持自身平衡十分重要，腫瘤的生長速率很難控制，這與凋亡能力的減弱和增殖能力的提升密切相關[11]。涉及細胞凋亡的信號通路包括線粒體介導的凋亡通路和死亡受體介導的凋亡通路，其中線粒體途徑和死亡受體途徑為誘導細胞凋亡的主要途徑[12-13]。線粒體是凋亡信號轉導途徑中起關鍵調節(jié)作用的細胞器，在凋亡過程中具有重要的調控作用，其Δψm是反映線粒體內膜通透性的最佳指標之一[14]。Cyt C是一種水溶性小分子物質，位于線粒體中，是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，是最早被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡蛋白[15]。Δψm的破壞被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件之一[16]。當Δψm降低后，線粒體膜腫脹、通透性增高，Cyt C從內膜脫落出來并釋放到胞質中，與凋亡蛋白酶激活因子及caspase-3前體相互作用，形成復合物，激活下游的效應caspase，從而誘導凋亡[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在YM155誘導Y79細胞凋亡的過程中，也檢測到Δψm的平行下降，表明YM155誘導Y79細胞凋亡可能與Δψm有關。以上結果初步提示，YM155誘導Y79細胞凋亡可能是通過線粒體介導的細胞凋亡途徑實現(xiàn)的。

為了進一步證實在YM155誘導Y79細胞凋亡過程中是否有Cyt C由線粒體釋放至胞漿，本研究采用免疫熒光和Western blot分析相結合的方法檢測Cyt C的分布和表達。結果發(fā)現(xiàn)，Y79細胞胞漿Cyt C熒光強度顯著增強，線粒體內Cyt C表達顯著降低。以上結果提示，在YM155誘導Y79細胞凋亡過程中確實存在Cyt C由線粒體釋放至胞漿，參與誘導凋亡。

綜上所述，YM155具有明顯抑制Y79細胞增殖的作用，誘導其凋亡，其誘導Y79細胞凋亡機制可能是通過線粒體介導的細胞凋亡途徑實現(xiàn)的。至于caspase-3及其底物、多聚核糖ADP聚合酶是否參與此過程，本研究將做進一步探討。

[1] Houston SK, Murray TG, Wolfe SQ, et al. Current update on retinoblastoma[J]. Int Ophthalmol Clin, 2011, 51(1):77-91.

[2] 黃海東， 李莉洋， 郭 穎， 等. PTEN和survivin基因在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中的表達及臨床意義[J]. 武警醫(yī)學, 2014, 25(1):24-26.

[3] Shehata HH, Abou Ghalia AH, Elsayed EK, et al. Detection of survivin protein in aqueous humor and serum of re-tinoblastoma patients and its clinical significance[J]. Clin Biochem, 2010, 43(4-5):362-366.

[4] Carruthers KH, Metzger G, Choi E, et al. A therapeutic role for survivin in mitigating the harmful effects of ionizing radiation[J]. Sarcoma, 2016, 2016:1830849.

[5] 陳立波. 苦參堿對宮頸癌Hela 細胞增殖、凋亡及Survivin 基因表達的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(15):235-238.

[6] Véquaud E, Séveno C, Loussouarn D, et al. YM155 potently triggers cell death in breast cancer cells through an autophagy-NF-kB network[J]. Oncotarget, 2015, 6(15):13476-13486.

[7] Koike H, Nitta T, Sekine Y, et al. YM155 reverses rapamycin resistance in renal cancer by decreasing survivin[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2014, 140(10):1705-1713.

[8] 成小姣， 丁燕飛， 朱黎明， 等. YM155對人胃癌細胞株MKN28的作用及其機制研究[J]. 胃腸病學, 2013, 18(2):82-85.

[9] 丁亦含， 樊曉東， 吳晶晶， 等. Survivin 抑制劑YM155 對K562 細胞凋亡和自噬的影響[J]. 中國實驗血液學雜志, 2015, 23(2):375-380.

[10]Ferrario A, Luna M, Rucker N, et al. Targeting survivin enhances chemosensitivity in retinoblastoma cells and orthotopic tumors[J]. PLoS One, 2016, 11(4): e0153011.

[11]邵淑麗， 劉 銳， 隋文靜， 等. 大蒜素誘導結腸癌HT-29細胞凋亡[J]. 基因組學與應用生物學, 2015, 34(2):227-233.

[12]劉盛楠， 邵淑麗， 王維熠， 等. 川楝素誘導人肺癌A549細胞凋亡[J]. 中國細胞生物學學報, 2015, 37(8):1087-1094.

[13]范蕊芳， 劉玲玲， 張 玲， 等. 唑來膦酸抑制U937 細胞增殖及誘導凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(7):1021-1026.

[14]蔣時紅， 吳耀松， 劉 燕. 胃康舒寧促胃癌細胞凋亡機制與線粒體凋亡途徑[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(21):203-206.

[15]富 蘇， 范吉平， 王新志. 通絡化痰膠囊對H2O2所致的PC12細胞凋亡的保護作用及機制[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(2):188-192.

[16]齊一鳴， 黃俊琪. 2型登革病毒通過線粒體途徑誘導EA. hy926細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(3):385-389.

[17]王立宏， 武興斌， 王 利， 等. 銀杏葉提取物對非小細胞肺癌PC-9細胞增殖的影響[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2015, 22(5):65-68.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of survivin inhibitor YM155 on mitochondrial apoptotic pathway of retinoblastoma Y79 cells

WEI Dong1, ZHANG Xiao-juan2, LIU Jie1, SONG Qiu-ying1

(1DepartmentofOphthalmology,2DepartmentofRadiology,HongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniversity,Mudanjiang157011,China.E-mail:songqiuying1980@qq.com)

AIM: To investigate the effects of survivin inhibitor YM155 {4,9-dihydro-1-(2-methoxyethyl)-2-methyl-4,9-dioxo-3-(2-pyrazinylmethyl)-4,9-dihydro-1H-naphtho[2,3-d]imidazolium bromide} on the apoptosis, mitochondrial membrane potential (Δψm) and cytochrome C (Cyt C) of retinoblastoma Y79 cells, and to analyze the mitochondrial mechanisms of apoptosis.METHODS: Y79 cells were culturedinvitroand treated with YM155 at concentrations of 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8 nmol/L. The cells in control group were treated without YM155. The proliferation of Y79 cells were measured by CCK-8 assay and bromodeoxyuridine (BrdU) labeling assay. Y79 cells were randomly divided into 4 groups: control group (with equal volume of RPMI-1640 nutrient medium), positive control group (10 nmol/L topotecan), low-dose (1 nmol/L) YM155 group and high-dose (2 nmol/L) YM155 group. The effects of YM155 on the apoptosis, the changes of Δψm, the mitochondrial distribution and the protein level of Cyt C in the Y79 cells were evaluated by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining, JC-1 staining, immunofluorescence analysis and Western blot, respectively. RESULTS: Compared with control group, YM155 significantly inhibited the proliferation of Y79 cells and induced apoptosis (P<0.05). YM155 significantly reduced Δψmof the Y79 cells, promoted Cyt C which released from mitochondria to the cytosol and reduced the protein level of Cyt C in the mitochondria (P<0.05). CONCLUSION: YM155 inhibits Y79 cell proliferation and induces apoptosis, and the possible mechanisms may be involved in the mitochondrium-mediated apoptotic pathway.

Retinoblastoma; YM155; Apoptosis; Mitochondrial apoptotic pathway

1000- 4718(2017)01- 0026- 07

2016- 06- 27

2016- 10- 17

黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題(No. JS215H623)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.005

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0453-6586082； E-mail： songqiuying1980@qq.com