熊文秀 翟衛(wèi)爽 屯妮薩·麥提賽伊迪 吳 欣 楊開(kāi)倫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

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綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)蛋白質(zhì)分解代謝相關(guān)酶活力及谷氨酸脫氫酶體系的米氏常數(shù)值

熊文秀 翟衛(wèi)爽 屯妮薩·麥提賽伊迪 吳 欣 楊開(kāi)倫*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

本試驗(yàn)旨在研究綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)蛋白質(zhì)分解代謝相關(guān)酶活力及谷氨酸脫氫酶體系的米氏常數(shù)(Km)值，為解釋綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)蛋白質(zhì)分解代謝特征提供酶學(xué)依據(jù)。選用6只1歲左右安裝永久性瘤胃瘺管的中國(guó)美利奴(新疆型)綿羊[平均體重為(32.00±1.36) kg]，飼喂精粗比為30∶70的飼糧，依次采集飼喂前(0 h)和飼喂后1.5、3.0、6.0、9.0、12.0 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的瘤胃液，重復(fù)采集3次。分離和制備細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液，分別測(cè)定相關(guān)酶活力及谷氨酸脫氫酶體系的Km值。結(jié)果顯示：1)綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液中蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶的活力隨飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，總體在飼喂后1.5 h達(dá)到峰值；谷氨酸和氨含量也呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律。原蟲(chóng)破碎液中參與蛋白質(zhì)分解代謝的這4種酶的活力在各時(shí)間點(diǎn)均極顯著高于細(xì)菌(P<0.01)。2)原蟲(chóng)破碎液谷氨酸含量極顯著高于細(xì)菌(P<0.01)；原蟲(chóng)破碎液氨含量在1.5、6.0、9.0和12.0 h顯著或極顯著高于細(xì)菌(P<0.05或P<0.01)。3)綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶對(duì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的Km值分別為2.60×10-7、1.48×10-7mol/L；細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶對(duì)谷氨酸的Km值分別為8.41×10-6、4.91×10-6mol/L；細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶對(duì)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的Km值分別為3.80×10-8、2.70×10-8mol/L；細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶對(duì)α-酮戊二酸的Km值分別為1.16×10-6、2.07×10-6mol/L；細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶對(duì)氨的Km值分別為2.97×10-5、1.40×10-5mol/L。結(jié)果提示，總體上，綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)中蛋白酶、谷氨酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活力在飼喂后1.5 h達(dá)到峰值，之后逐漸降低；綿羊瘤胃原蟲(chóng)中蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶的活力均極顯著高于細(xì)菌，原蟲(chóng)中蛋白質(zhì)分解代謝更旺盛；瘤胃原蟲(chóng)中不僅存在谷氨酸轉(zhuǎn)氨機(jī)制，還可能存在利用氨重新合成氨基酸的機(jī)制。

瘤胃；細(xì)菌；原蟲(chóng)；蛋白質(zhì)分解代謝；酶活力；Km值

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)選用平均體重為(32.00±1.36) kg、1歲左右的中國(guó)美利奴(新疆型)細(xì)毛公羊6只，在試驗(yàn)前安裝永久性瘤胃瘺管。飼喂精粗比為30∶70的飼糧。每天09:00、21:00各飼喂1次，精料與粗料(玉米秸稈)分2次等量飼喂，將精料與粗料混合后飼喂。自由飲水。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有 One kg of premix contained the following：石粉 limestone 467.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 25.38 g，CuSO4·5H2O 13.45 g，MnSO4·H2O 12.56 g，VA 5×106 IU，CuSO4·5H2O 3.98 g，CoCl2·6H2O 0.083 g，KI 0.066 g，Na2SeO30.045 g。

2)營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)際測(cè)定值。Nutrient levels were measured values.

1.2 樣品采集與處理

每只羊每周采樣1次，共采3次。采樣時(shí)間點(diǎn)為飼喂前(0 h)和飼喂后1.5、3.0、6.0、9、12.0 h。抽取用20目尼龍網(wǎng)過(guò)濾的瘤胃液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每只羊抽取120 mL瘤胃液，從中量取100 mL瘤胃液，所有羊的瘤胃液混合在一起，再?gòu)闹辛咳?80 mL用于分離瘤胃液原蟲(chóng)、細(xì)菌，制備無(wú)細(xì)胞破碎提取物，以測(cè)定酶活力。

1.3 瘤胃液細(xì)菌、原蟲(chóng)分離和破碎

將混合瘤胃液480 mL，150×g離心10 min后棄沉淀，將上清液650×g離心20 min，將細(xì)菌和原蟲(chóng)分離，沉淀為原蟲(chóng)組分，上清液為細(xì)菌組分。

將沉淀(原蟲(chóng)組分)用4 ℃過(guò)夜預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(25 mL)溶解后，低溫高速離心機(jī)4 ℃ 650×g離心20 min(重復(fù)2次)。將上清液(細(xì)菌組分)10 000×g離心20 min，棄上清液，收集所有沉淀，用4 ℃過(guò)夜預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(50 mL)溶解后，低溫高速離心機(jī)4 ℃ 10 000×g離心20 min(重復(fù)2次)。之后，分別收集沉淀，加入預(yù)冷的生理鹽水溶解，定容至40 mL，混勻后破碎(用超聲波破碎機(jī)，超聲破碎15 min，功率400 W，超聲3 s，間隔5 s，工作60次，重復(fù)3次)。破碎液經(jīng)低溫高速離心機(jī)4 ℃ 10 000×g離心20 min，收集上清液，-20 ℃保存，測(cè)定酶活力、谷氨酸脫氫酶體系的米氏常數(shù)(Km)值、谷氨酸和氨和蛋白質(zhì)含量。

1.4 蛋白質(zhì)含量、酶活力的測(cè)定

瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液的蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考張龍翔等[11]的方法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白。

瘤胃液細(xì)菌和原蟲(chóng)蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶活力的測(cè)定參考Palmquist等[12]的方法進(jìn)行。分光光度計(jì)使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(754PC)，石英比色皿(光程1.0 cm)，水浴鍋為SSW型微電腦電熱恒溫水槽(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為Sigma公司產(chǎn)品，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.5 瘤胃液細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶Km值的測(cè)定

谷氨酸脫氫酶催化的脫氨反應(yīng)為：

谷氨酸+NADα-酮戊二酸+NADH+氨。

本試驗(yàn)分別測(cè)定催化反應(yīng)中谷氨酸脫氫酶對(duì)反應(yīng)式中5種物質(zhì)的Km值。

瘤胃液細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶Km值測(cè)定時(shí)底物谷氨酸濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L；NAD濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L；NADH濃度分別為0.157、0.313、0.625、0.250、0.500 mmol/L；α-酮戊二酸濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L；氨濃度分別為10、20、40、80、160 mmol/L。各濃度底物的測(cè)定步驟均與測(cè)定谷氨酸脫氫酶活力相同。測(cè)定出各底物濃度的反應(yīng)初速度，按Linewaver Burk法作圖，將米氏方程兩側(cè)取雙倒數(shù)，得方程式：

1/v=Km/vmax·1/[S]+1/vmax。

式中：v為反應(yīng)初速度(mol/min)；[S]為底物濃度(mol/L)；vmax為最大反應(yīng)速度[mol/min]；橫軸截距為-1/Km，縱軸截距為1/vmax，用圖解法求出vmax和Km值。

1.6 瘤胃液細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸、氨含量的測(cè)定

谷氨酸、氨含量采用酶法測(cè)定，參考吉爾鮑特[13]的方法進(jìn)行。測(cè)定谷氨酸含量時(shí)，谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的終濃度分別為0、10、25、50、100、200 mmol/L，NAD的終濃度為2 mmol/L，加入谷氨酸脫氫酶100 U，反應(yīng)總體積為3 mL；混勻后置于37 ℃水浴40 min，取出后于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(754PC)上測(cè)定340 nm處的吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，調(diào)整待測(cè)樣品的谷氨酸含量在標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)進(jìn)行同樣操作，測(cè)定。測(cè)定氨含量時(shí)，氨標(biāo)準(zhǔn)液的終濃度分別為0、1、2、4、7、10 mmol/L，NADH的終濃度為4 mmol/L，加入谷氨酸脫氫酶100 U，反應(yīng)總體積為3 mL；混勻后置于37 ℃水浴40 min，取出后于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(754PC)上測(cè)定340 nm處的吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，調(diào)整待測(cè)樣品的氨含量在標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)進(jìn)行同樣操作，測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，平均值的多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行，以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對(duì)細(xì)菌和原蟲(chóng)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)蛋白質(zhì)分解代謝主要相關(guān)酶活力的動(dòng)態(tài)變化

從表2可見(jiàn)，細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液中的蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶4種酶的活力隨飼喂后時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)“低-高-低”的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，且除了細(xì)菌谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力外均在飼喂后1.5 h達(dá)到最大值，在飼喂后12.0 h活力基本恢復(fù)到飼喂前0 h的水平。各時(shí)間點(diǎn)的原蟲(chóng)破碎液中蛋白酶活力比細(xì)菌高出近50%，兩者差異極顯著(P<0.01)，而原蟲(chóng)破碎液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶3種酶的活力幾乎是細(xì)菌的2倍，差異極顯著(P<0.01)。

2.2 瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液中谷氨酸、氨含量的動(dòng)態(tài)變化

從表3可見(jiàn)，細(xì)菌和原蟲(chóng)破碎液谷氨酸含量隨飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。飼喂后1.5 h，細(xì)菌和原蟲(chóng)破碎液谷氨酸含量均達(dá)到最大值。飼喂前、后各時(shí)間點(diǎn)原蟲(chóng)破碎液谷氨酸含量均極顯著高于細(xì)菌(P<0.01)。細(xì)菌和原蟲(chóng)破碎液氨含量隨飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。飼喂后1.5 h，細(xì)菌和原蟲(chóng)破碎液氨含量均達(dá)到最大值。在飼喂后1.5 h，原蟲(chóng)破碎液氨含量極顯著高于細(xì)菌(P<0.01)。在飼喂后6.0、9.0和12.0 h，原蟲(chóng)破碎液氨含量顯著高于細(xì)菌(P<0.05)。

表2 綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液中蛋白質(zhì)分解代謝幾種相關(guān)酶的活力

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液中谷氨酸、氨含量

項(xiàng)目Items組分Components0h1.5h3.0h6.0h9.0h12.0h谷氨酸細(xì)菌Bacteria85.94±5.76B139.28±3.60B103.29±3.64B90.13±3.06B70.91±3.25B63.81±2.00BGlutamate原蟲(chóng)Protozoa159.02±1.85A171.11±2.87A147.99±5.42A128.83±2.10A116.97±7.50A95.73±3.91A氨細(xì)菌Bacteria5.46±0.105.88±0.06B5.53±0.284.94±0.20b4.57±0.22b4.37±0.15bNH+4原蟲(chóng)Protozoa5.88±0.286.53±0.41A5.77±0.375.59±0.18a5.18±0.19a4.83±0.12a

2.3 綿羊瘤胃液細(xì)菌、原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶的Km值比較

按Linewaver Burk法作圖，得到的典型結(jié)果如圖1、圖2所示。圖解計(jì)算出的Km值和vmax結(jié)果見(jiàn)表4。從表可見(jiàn)，谷氨酸脫氫酶對(duì)NAD+：細(xì)菌Km值為2.60×10-7mol/L，vmax為2.17×10-4mol/(L·min)；原蟲(chóng)Km值為1.48×10-7mol/L，vmax為6.70×10-5mol/(L·min)，原蟲(chóng)Km值較小。谷氨酸脫氫酶對(duì)谷氨酸：細(xì)菌Km值為8.41×10-6mol/L，vmax為1.35×10-4mol/(L·min)；原蟲(chóng)Km值為4.91×10-6mol/L，vmax為1.79×10-4mol/(L·min)，原蟲(chóng)Km值較小。谷氨酸脫氫酶對(duì)NADH：細(xì)菌Km值為3.80×10-8mol/L，vmax為1.89×10-4mol/(L·min)；原蟲(chóng)Km值為2.70×10-8mol/L，vmax為2.73×10-4mol/(L·min)，原蟲(chóng)Km值較小。谷氨酸脫氫酶對(duì)α-酮戊二酸：細(xì)菌Km值為1.16×10-6mol/L，vmax為4.00×10-4mol/(L·min)；原蟲(chóng)Km值為2.07×10-6mol/L，vmax為6.67×10-4mol/(L·min)，細(xì)菌Km值較小。谷氨酸脫氫酶對(duì)氨：細(xì)菌Km值為2.97×10-5mol/L，vmax為3.57×10-4mol/(L·min)；原蟲(chóng)Km值為1.40×10-5mol/L，vmax為3.33×10-4mol/(L·min)，原蟲(chóng)Km值較小。

圖1 瘤胃細(xì)菌破碎液谷氨酸脫氫酶體系對(duì)NAD的Km值

圖2 瘤胃原蟲(chóng)破碎液谷氨酸脫氫酶體系對(duì)NAD的Km值

3 討 論

3.1 綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液蛋白質(zhì)分解代謝主要相關(guān)酶活力的動(dòng)態(tài)變化

本試驗(yàn)測(cè)定了在飼糧精粗比為30∶70時(shí)，綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液在飼喂前、后各時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)分解主要相關(guān)酶活力的變化。從酶活力的動(dòng)態(tài)變化來(lái)看，瘤胃細(xì)菌和原蟲(chóng)蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶的活力變化均呈現(xiàn)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，總體上在飼喂后1.5 h上升至最大值，之后緩慢降低。Chen等[14]的研究表明，綿羊瘤胃中的肽濃度隨飼喂后時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先升高后緩慢降低的變化規(guī)律，且在1.5 h達(dá)到最高。瘤胃蛋白質(zhì)的快速降解在采食后1.5 h左右達(dá)到最活躍的階段，這可能導(dǎo)致小肽和氨基酸的迅速積累[8]。王夢(mèng)芝[15]和翟衛(wèi)爽[16]的研究指出，綿羊瘤胃液氨態(tài)氮濃度在不同飼糧間均表現(xiàn)出有相似的變化趨勢(shì)，采食后1.5～3.0 h較高，之后逐漸降低。氨態(tài)氮濃度的變化規(guī)律表明，在采食后1.5 h，瘤胃中的脫氨反應(yīng)達(dá)到最活躍的階段。

表4 綿羊瘤胃液細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液谷氨酸脫氫酶的Km值比較

瘤胃液中氨態(tài)氮濃度受飼糧蛋白質(zhì)含量的直接影響，也與原蟲(chóng)數(shù)量和種類有關(guān)。飼糧蛋白質(zhì)含量高，瘤胃細(xì)菌可利用的蛋白質(zhì)底物含量也增加，蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶活力也隨之提高，在瘤胃液中氨態(tài)氮濃度也就升高。瘤胃原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的這4種酶活力都顯著高于瘤胃細(xì)菌，去原蟲(chóng)能顯著降低瘤胃液中氨態(tài)氮的濃度[9]。本試驗(yàn)從蛋白酶、谷氨酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶4種酶活力的變化規(guī)律為瘤胃液中肽、氨態(tài)氮濃度的變化規(guī)律提供了酶學(xué)理論依據(jù)。

3.2 綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液谷氨酸脫氫酶反應(yīng)體系Km值比較

有關(guān)瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)體系從Km值尚未見(jiàn)有報(bào)道。Shino等[17]研究顯示，黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)谷氨酸脫氫酶對(duì)氨的Km值為3.08 mmol/L，對(duì)谷氨酸的Km值為100.00 mmol/L，對(duì)α-酮戊二酸的Km值為5.72 mmol/L。Kujo等[18]研究顯示，厭氧超嗜熱菌(Anaerobichyperthermophiles)谷氨酸脫氫酶對(duì)NAD的Km值為0.025 mmol/L，對(duì)谷氨酸Km值為0.170 mmol/L，對(duì)NADH的Km值為0.005 mmol/L，對(duì)α-酮戊二酸的Km值為0.066 mmol/L，對(duì)氨的Km值為9.700 mmol/L。Newbold等[19]研究表明，大腸桿菌的谷氨酸脫氫酶對(duì)氨和α-酮戊二酸的親和力較強(qiáng)，Km值分別為2.33和0.71 mmol/L，對(duì)谷氨酸的親和力較弱，Km值為98.00 mmol/L。本試驗(yàn)中得到的瘤胃細(xì)菌破碎液中谷氨酸脫氫酶對(duì)反應(yīng)底物的Km值的規(guī)律與前人研究的幾種細(xì)菌的Km值規(guī)律相似。綜合谷氨酸脫氫酶的活力及Km值的比較來(lái)看：1)瘤胃原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶活力高于細(xì)菌，且對(duì)谷氨酸、NAD+的Km值比細(xì)菌低42%～43%，這表明原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸脫氫酶與谷氨酸、NAD+的親和力高出細(xì)菌的42%～43%，反應(yīng)催化速度更高，這也是為什么原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶的活力高于細(xì)菌，且產(chǎn)氨速度高于細(xì)菌的重要原因之一；細(xì)菌α-酮戊二酸的Km值低于原蟲(chóng)，表明細(xì)菌谷氨酸脫氫酶與α-酮戊二酸的親和力更高，更有利于逆反應(yīng)谷氨酸的合成，說(shuō)明在細(xì)菌中逆反應(yīng)的催化速度高于原蟲(chóng)，這也可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)氨效率低于原蟲(chóng)。2)從氨的利用角度看，在細(xì)菌細(xì)胞中底物ɑ-酮戊二酸的Km值為1.16×10-6mol/L，低于氨的2.97×10-5mol/L；原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的趨勢(shì)與細(xì)菌相似。因此，在細(xì)菌、原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)ɑ-酮戊二酸的供應(yīng)充足與否是細(xì)菌、原蟲(chóng)利用氨合成重新氨基酸的主要限制步驟，細(xì)菌、原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的ɑ-酮戊二酸的含量和如何影響氨基酸的重新合成等問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。

飼糧精粗比為30∶70是反芻家畜一般飼養(yǎng)中較為普遍的飼糧結(jié)構(gòu)。飼料精粗比例影響瘤胃內(nèi)細(xì)菌、原蟲(chóng)的增殖和數(shù)量。因此，隨著精粗比的增加，瘤胃內(nèi)細(xì)菌、原蟲(chóng)數(shù)量也會(huì)隨之發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)的酶活力也將發(fā)生變化。從谷氨酸脫氫酶反應(yīng)體系的Km值來(lái)說(shuō)，特定酶在特定反應(yīng)條件下是酶的屬性，因此，谷氨酸脫氫酶反應(yīng)體系的Km值并不隨底物濃度的變化(即飼糧精粗比例)而改變。

3.3 瘤胃原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)可能存在利用氨重新合成氨基酸的機(jī)制

原蟲(chóng)不能利用氨而以吞噬小飼料顆粒和細(xì)菌的形式獲得氮源，“瘤胃原蟲(chóng)是瘤胃內(nèi)的凈產(chǎn)氨者”，這是長(zhǎng)久以來(lái)對(duì)瘤胃原蟲(chóng)氨代謝的一個(gè)基本認(rèn)定。然而，Williams等[20]研究發(fā)現(xiàn)，纖毛蟲(chóng)可以從利用吞噬菌壁中的二氨基庚二酸合成賴氨酸，同時(shí)也認(rèn)為全毛蟲(chóng)可利用氨重新合成氨基酸。本試驗(yàn)測(cè)得細(xì)菌、原蟲(chóng)破碎液底物氨的Km值分別為2.97×10-5、1.40×10-5mol/L，這表明原蟲(chóng)的谷氨酸脫氫酶與氨的親和力更高，更有利于原蟲(chóng)利用氨進(jìn)行逆反應(yīng)合成氨基酸，并為后續(xù)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶提供更多的底物。這提示，瘤胃原蟲(chóng)中不僅存在谷氨酸轉(zhuǎn)氨機(jī)制，可能還存在利用氨重新合成氨基酸的機(jī)制。

4 結(jié) 論

① 總體上，綿羊瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)中蛋白酶、谷氨酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活力在飼喂后1.5 h達(dá)到峰值，之后逐漸降低。

② 綿羊瘤胃原蟲(chóng)中蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶的活力均極顯著高于細(xì)菌，原蟲(chóng)中蛋白質(zhì)分解代謝更旺盛。

③ 瘤胃原蟲(chóng)中不僅存在谷氨酸轉(zhuǎn)氨機(jī)制，可能還存在利用氨重新合成氨基酸的機(jī)制。

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*Corresponding author, professor, E-mail： yangkailun2002@aliyun.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Enzyme Activities Related to Protein Catabolism and KmValue of Glutamate Dehydrogenase System in Rumen Bacteria and Protozoa of Sheep

XIONG Wenxiu ZHAI Weishuang Tunnisa Maitisaiyidi WU Xin YANG Kailun*

(XinjiangKeyLaboratoryofHerbivoreNutritionforMeat&MilkProduction,XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052,China)

rumen; bacteria; protozoa; protein catabolism; enzyme activity;Kmvalue

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.01.037

2016-07-04

國(guó)家自然基金“瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)內(nèi)與NAD(P)H相關(guān)的幾個(gè)主要代謝途徑及其生理生化功能的研究”(31272473)

熊文秀(1990—)，女，四川達(dá)州人，碩士研究生，研究方向?yàn)椴菔硠?dòng)物動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝。E-mail： 1097043559@qq.com

*通信作者：楊開(kāi)倫，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yangkailun2002@aliyun.com

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