高瑞，李春林，童曉玲，曹明亞，石美寧，徐安英，魯成，代方銀

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分子連鎖分析探討家蠶高抗BmNPV品系的抗性遺傳基礎(chǔ)

高瑞1，李春林1，童曉玲1，曹明亞1，石美寧2，徐安英3，魯成1，代方銀1

（1西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院/家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部蠶桑功能基因組與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715；2廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，南寧530007；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018）

【目的】家蠶核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus,BmNPV）所引發(fā)的血液型膿病是一種傳染性強(qiáng)的蠶病，極大地影響蠶業(yè)生產(chǎn)。本研究旨在定位對(duì)BmNPV高抗的家蠶品系中控制其抗性的基因，進(jìn)而解析其抗性遺傳機(jī)制，為培育抗性素材和品系提供理論支持?！痉椒ā恳訠mNPV高抗家蠶品系99R和較感品系Dazao-N為親本，配制連鎖分析（BC1F）和定位分析（BC1M）回交群體。首先對(duì)兩個(gè)親本品系進(jìn)行濃度梯度添毒，統(tǒng)計(jì)感病死亡的家蠶頭數(shù)，運(yùn)用SPSS 17.0軟件，計(jì)算其半致死劑量（LD50），在此基礎(chǔ)上確定BC1分離群體的攻毒劑量，并通過(guò)單頭定量攻毒，選取感病個(gè)體作為連鎖定位分析材料；利用篩選得到的覆蓋家蠶全套常染色體的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行分型，并通過(guò)T檢驗(yàn)計(jì)算各標(biāo)記與抗性的連鎖顯著性水平（值），篩選出與抗性相連鎖的標(biāo)記。在這些標(biāo)記所在的染色體上加密標(biāo)記，檢測(cè)各標(biāo)記在定位分析群體中的基因型，定位抗性基因?！窘Y(jié)果】LD50(99R)=2.92×106個(gè)多角體/頭,LD50(Dazao-N)=9.78×105個(gè)多角體/頭，基于雙親的半致死劑量，選擇介于兩者之間且略高于其均值的劑量——2×106個(gè)多角體/頭作為BC1分離群體的攻毒劑量；先后于2014年秋季和2015年春季處理并檢測(cè)連鎖分析群體，前后兩次所進(jìn)行的連鎖分析結(jié)果有較大差異，其中第一次找到Chr22上的多態(tài)性標(biāo)記S2205與99R抗性連鎖，而第二次的連鎖分析顯示標(biāo)記S2205與抗性不連鎖，也沒(méi)有找到其他的連鎖關(guān)系。通過(guò)與前人對(duì)BmNPV抗性的連鎖定位分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)連鎖定位分析結(jié)果的不可重復(fù)性是一個(gè)普遍的問(wèn)題。AY380833是GenBank中已公布的在家蠶高抗品系NB和871C中與其抗性位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)其與99R和871C的抗性位點(diǎn)均不連鎖?！窘Y(jié)論】分子連鎖分析結(jié)果證明，家蠶對(duì)BmNPV的抗性在不同抗性品系中遺傳基礎(chǔ)有很大的差異性，同一品系可能具有多個(gè)抗性位點(diǎn)；家蠶對(duì)BmNPV的抗性是一種復(fù)雜性狀，在符合“質(zhì)量-數(shù)量性狀”結(jié)論的同時(shí)，其數(shù)量性狀特征突出。

家蠶；BmNPV；抗性；分子標(biāo)記；連鎖分析

0 引言

【研究意義】蠶絲業(yè)起源于中國(guó)，5 000多年來(lái)為中華民族文化、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)[1]。目前，在中國(guó)各大蠶區(qū)，蠶桑生產(chǎn)仍是千萬(wàn)農(nóng)戶重要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源。據(jù)最近統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)的蠶繭產(chǎn)值與絲綢工業(yè)產(chǎn)值分別約為200億元和2 000億元[2]。但是，每年因蠶病暴發(fā)造成的損失占蠶業(yè)生產(chǎn)總收入的20%左右，其中因感染家蠶核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，BmNPV）引發(fā)的家蠶核型多角體病，又稱(chēng)膿病或血液型膿病，造成的損失占其中的60%以上。因此，在經(jīng)典遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步解析家蠶對(duì)BmNPV抗性的遺傳基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)其緊密連鎖標(biāo)記，定位克隆抗性基因，可以為通過(guò)分子標(biāo)記輔助育種及轉(zhuǎn)基因等技術(shù)培育高抗家蠶品系提供理論依據(jù)[3]，并將為從根本上解決BmNPV對(duì)蠶業(yè)的損害打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在經(jīng)典遺傳學(xué)的指導(dǎo)下，育種專(zhuān)家們篩選并培育了一些較強(qiáng)抗性的家蠶品系，如NB（N11）[4-5]、CVDAR（CDR）[6]、華康1號(hào)（871C×872C）[7-8]、華康2號(hào)（秋豐N×白玉N）[8-9]等。基于對(duì)這些抗性材料不同組配方式后代的抗性鑒定和經(jīng)典遺傳分析，研究人員對(duì)抗性的遺傳規(guī)律做了大量研究，并得出抗性遺傳的基本規(guī)律：家蠶對(duì)BmNPV的抗性受常染色體上一對(duì)顯性主基因和性染色體上微效修飾基因控制，有雜種優(yōu)勢(shì)和偏父遺傳效應(yīng)，屬于質(zhì)量-數(shù)量性狀[4,10-13]。YAO等以高抗材料NB和高敏感材料306為雙親利用RAPD技術(shù)篩選并驗(yàn)證，分別得到了與抗性基因連鎖的分子標(biāo)記OPA-18700[14]和OPF-072023（AY380833）[15]；趙遠(yuǎn)[16]于2007年用同樣的雙親材料的回交群體在第3、第25號(hào)染色體上篩選到8個(gè)與抗NPV基因連鎖的分子標(biāo)記并進(jìn)行了定位。之后呂鵬[17]在2014年用同樣的材料，采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（SLAF-seq）和群體分離分析（BSA）相結(jié)合的方法發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與抗性性狀緊密連鎖的標(biāo)記，并將抗性基因初步定位在家蠶第23號(hào)染色體一段0.67 Mb的區(qū)域，對(duì)此區(qū)域的候選基因進(jìn)行表達(dá)與測(cè)序分析，最終推測(cè)兩個(gè)酯酶基因可能涉及家蠶對(duì)NPV的抗性。【本研究切入點(diǎn)】盡管這些結(jié)果極大地推動(dòng)了BmNPV抗性的連鎖定位研究，并豐富了對(duì)家蠶抗性的遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，但目前為止，研究人員仍然沒(méi)有能夠定位并克隆出控制家蠶BmNPV抗性的主基因。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以高抗BmNPV家蠶品系99R為抗性親本組配連鎖及定位分析群體材料，通過(guò)分子連鎖分析試驗(yàn)，并結(jié)合已有的研究報(bào)道分析探討，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)家蠶對(duì)BmNPV的抗性遺傳基礎(chǔ)，為最終定位抗性基因打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與組配方式

家蠶抗BmNPV品系：99R，以抗性基礎(chǔ)材料CVDAR通過(guò)雜交選育建立[18]，由廣西蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院提供；871C，經(jīng)抗病主基因載體品系湘M與受體親本871雜交培育而成[19-20]，來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所。感性品系：871B、Dazao-N和N4，其中871B為實(shí)用種親本，后二者為試驗(yàn)用基礎(chǔ)品系，均由西南大學(xué)家蠶基因庫(kù)提供。

根據(jù)家蠶雌完全連鎖特性，用99R與Dazao-N，871C與N4分別組配F1及BC1回交群體，所用的連鎖群體（BC1F）組配方式分別為：（Dazao-N×99R）F1♀×Dazao-N♂，（871C×N4）F1♀×N4♂，用以進(jìn)行99R和871C抗性的連鎖分析。

1.2 病原復(fù)蘇與純化

接種BmNPV病原于871B的5齡起蠶，待蠶發(fā)病后，割破尾足取膿汁，或收集病蠶尸體并將其裂解過(guò)濾取上清，室溫放置3—4 d后經(jīng)差速離心提純，血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后將原液保存于4℃冰箱備用。

1.3 攻毒方法與取材

首先對(duì)99R和Dazao-N進(jìn)行濃度梯度添毒，病毒濃度梯度為5×109、1×109、1×108、1×107、1×106個(gè)多角體/mL，其中每個(gè)品系各濃度梯度設(shè)定3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)區(qū)取30頭4齡起蠶，逐頭置于24孔的二重皿中，并于26℃、12 h光照12 h黑暗環(huán)境飼養(yǎng)。99R用5×109、1×109、1×108、1×107個(gè)多角體/mL 4種濃度添毒；Dazao-N用1×109、1×108、1×107、1×106個(gè)多角體/mL 4種濃度添毒。具體方法：用移液器取5×109個(gè)多角體/mL的病毒液800 μl，其余濃度各400 μl的病毒液均勻涂抹于直徑為9.5 cm的桑葉葉片上，待稍晾干后用打孔器打成直徑為1.5 cm的小葉片，單頭喂食家蠶，待其完全吃完（未吃完的蠶淘汰），盡量保證99R品系每頭蠶最終食入的病毒劑量分別約為1×108、1×107、1×106和1×105個(gè)多角體，Dazao-N品系每頭蠶最終食入的病毒劑量分別約為1×107、1×106、1×105和1×104個(gè)多角體。12 h后再喂食正常桑葉。4—8 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)因感染BmNPV死亡頭數(shù)，用SPSS 17.0 probit模塊（概率單位回歸）計(jì)算兩品系對(duì)BmNPV的半致死劑量（LD50）。

對(duì)99R和871C的BC1F個(gè)體均用同樣的方法按每頭蠶2×106個(gè)多角體（2×108個(gè)多角體/ml）攻毒，發(fā)病后逐頭收集病蠶，并置于-80℃冷凍保存。

1.4 SSR、PCR標(biāo)記的來(lái)源

根據(jù)Miao等[21]在2005年公布的家蠶SSR標(biāo)記圖譜信息（除1號(hào)即Z染色體外），在華大基因公司合成標(biāo)記引物；沒(méi)有找到多態(tài)標(biāo)記的連鎖群，利用本研究小組已經(jīng)設(shè)計(jì)的PCR標(biāo)記引物或用SSR Hunter在這些染色體的隨機(jī)區(qū)域搜索SSR位點(diǎn)，用Primer 5設(shè)計(jì)針對(duì)其側(cè)翼序列的引物并由華大基因公司合成。

1.5 DNA提取及多態(tài)性標(biāo)記的PCR檢測(cè)

99R和Dazao-N及其F1代的基因組DNA參照陳冬妹等[22]的方法進(jìn)行提取，之后用前述SSR、PCR標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序設(shè)置參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%聚丙烯酰胺PAGE凝膠電泳結(jié)合銀染方法進(jìn)行分型；普通PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液1.5 μL，25 mmol·L-1MgCl21.2 μL，2.5 mmol·μL-1dNTPs 1.2 μL，10 pmol·μL-1Fprimer 0.6 μL，10 pmol·μL-1Rprimer 0.6 μL，5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.12 μL，10 ng·μL-1DNA模板1 μL，加入ddH2O 至終體積15 μL。反應(yīng)條件為94℃ 4 min；94℃ 40 s，55—57℃（根據(jù)不同引物調(diào)整）40 s，72℃ 30—90 s（根據(jù)不同引物調(diào)整），32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。普通PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣4 μL，電泳，EB染色后，用Bio-Rad電泳凝膠成像系統(tǒng)分析條帶。篩選出在兩個(gè)親本間有明顯多態(tài)性的標(biāo)記引物。

1.6 99R品系對(duì)BmNPV抗性的連鎖分析

對(duì)（Dazao-N×99R）F1♀×Dazao-N♂，即BC1F群體，先后于2014年10月和2015年5月在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒方法及劑量見(jiàn)1.3，4—8 d后，通過(guò)表型觀察輔以顯微鏡檢，選擇發(fā)病表型典型并能檢測(cè)到多角體富集的個(gè)體作為連鎖分析材料。逐頭提取基因組DNA，利用所篩選出的多態(tài)性標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用3%聚丙烯酰胺PAGE凝膠電泳或2%瓊脂糖凝膠電泳顯色拍照，統(tǒng)計(jì)各個(gè)標(biāo)記引物在每一個(gè)體DNA中的擴(kuò)增帶型；雜合型（兩條帶，F(xiàn)1帶型）記為“1”，純合型（一條帶，Dazao-N帶型）記為“2”，未擴(kuò)增出帶記為“0”。統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)（**為＜0.01），并用值相對(duì)應(yīng)的負(fù)對(duì)數(shù)（-lg）表示各個(gè)連鎖群的連鎖情況，以各連鎖群號(hào)為橫坐標(biāo)，- lg為縱坐標(biāo)作圖，顯示抗性連鎖群。

1.7 標(biāo)記AY380833的連鎖驗(yàn)證

調(diào)出GenBank中已公開(kāi)的與BmNPV抗性基因連鎖的SCAR序列（AY380833），合成一對(duì)特異性引物：F（5′-ATTCTGAGGGCGGACAAG-3′），R（5′-AATTGACGGGAAGTTTAGTGAG-3′），逐個(gè)提取兩個(gè)BC1F群體即（Dazao-N×99R）F1♀×Dazao-N♂和（871C×N4）F1♀×N4♂中攻毒后發(fā)病個(gè)體的基因組DNA，分別進(jìn)行連鎖檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兩親本對(duì)BmNPV的抗性性能鑒定

為了確定對(duì)BC1分離群體的攻毒濃度，首先對(duì)抗性親本99R和感性親本Dazao-N的抗性性能進(jìn)行鑒定（表1、表2）。LD50（99R）=2.92×106個(gè)多角體/頭，LD50（Dazao-N）=9.78×105個(gè)多角體/頭?；诖薒D50數(shù)據(jù)，結(jié)合冢本1963年提出的家蠶對(duì)BmNPV抗性的坪區(qū)理論以及孟智啟[12]驗(yàn)證的家蠶對(duì)BmNPV抗性具有雜種優(yōu)勢(shì)的特點(diǎn)，選擇介于兩親本半致死劑量之間且略高于其均值的攻毒濃度——2×106個(gè)多角體/頭（2×108個(gè)多角體/ml）作為BC1分離群體的攻毒劑量，這樣盡可能使連鎖分析材料中所取的發(fā)病個(gè)體均為敏感性個(gè)體。

表1 兩個(gè)親本品系因感染BmNPV累計(jì)死亡頭數(shù)

*本批次飼養(yǎng)蠶較少，故只選取50頭供試蠶數(shù)作為對(duì)照The silkworm of this batch rearing is less, so only select 50 silkworms as a control

表2 兩個(gè)親本品系感染BmNPV毒力測(cè)定

2.2 多態(tài)性標(biāo)記篩選

對(duì)已公布的家蠶SSR標(biāo)記圖譜中的標(biāo)記引物[21]以及自行設(shè)計(jì)的PCR標(biāo)記引物，在抗性親本99R和感性親本Dazao-N的基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終得到覆蓋家蠶所有常染色體的多態(tài)性標(biāo)記，其引物信息如表3所示。

2.3 99R抗性的連鎖分析

用經(jīng)攻毒后確認(rèn)的連鎖分析群體中的發(fā)病感性個(gè)體，對(duì)表3所列27個(gè)連鎖群的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，圖1-a中實(shí)線表示2014年9月（共44個(gè)個(gè)體）連鎖檢測(cè)結(jié)果，其中第11號(hào)連鎖群（Chr11）上的多態(tài)性標(biāo)記S1125和第22號(hào)連鎖群（Chr22）上的多態(tài)性標(biāo)記S2205均與抗性存在顯著的連鎖關(guān)系（（S1125）=0.002772（＜0.01），（S2205）=7.74E-05（＜0.01）），但Chr11的帶型與理論相反，不予考慮，最終確定Chr22上的多態(tài)性標(biāo)記S2205與抗性連鎖。為了驗(yàn)證本次試驗(yàn)的連鎖結(jié)果，于2015年5月重新攻毒取材（共24個(gè)個(gè)體），并進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果如圖1-a的虛線，表現(xiàn)出不存在與抗性連鎖的標(biāo)記，標(biāo)記S2205的兩次連鎖分析帶型結(jié)果分別如圖1-b、1-c。這些結(jié)果表明99R的抗性連鎖分析結(jié)果并不能在驗(yàn)證性試驗(yàn)中得到重復(fù)，即連鎖分析的結(jié)果不具有重復(fù)性，因而不能進(jìn)行下一步的定位試驗(yàn)。

表3 各常染色體上用于連鎖分析的多態(tài)性標(biāo)記的引物序列信息

2.4 AY380833標(biāo)記的連鎖驗(yàn)證

AY380833是GenBank中已公布的與家蠶對(duì)BmNPV抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，其在基因組上的具體位置不明[15]。本研究中，篩選到了覆蓋家蠶所有常染色體的多態(tài)性標(biāo)記，如果能通過(guò)標(biāo)記分型找到與標(biāo)記AY380833連鎖的多態(tài)性標(biāo)記，那么此多態(tài)性標(biāo)記所在的染色體即為標(biāo)記AY380833所在的染色體，進(jìn)一步在該染色體上加密標(biāo)記可快速定位抗性區(qū)域。為此，首先調(diào)查了標(biāo)記AY380833與99R抗性的連鎖情況?；诖藰?biāo)記的序列信息，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，用2014年9月所取的99R連鎖分析材料中的31個(gè)個(gè)體對(duì)其進(jìn)行連鎖驗(yàn)證分析，圖2-a表示所選的代表性的21個(gè)個(gè)體的連鎖檢測(cè)帶型結(jié)果，顯示其與99R的抗性之間不連鎖。另外，有研究表明AY380833在871C中也與其抗性連鎖[20]。筆者利用保存在西南大學(xué)家蠶基因庫(kù)、來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所的BmNPV抗性品系871C，與另一個(gè)感性品系N4配制了連鎖群體，經(jīng)測(cè)定，LD50（871C）=2.52×107個(gè)多角體/頭，LD50（N4）=5.25×105個(gè)多角體/頭，通過(guò)分析確定了用2×106個(gè)多角體/頭的攻毒劑量對(duì)其進(jìn)行攻毒取材（共40個(gè)感病個(gè)體），分析AY380833與871C抗性的連鎖關(guān)系，代表性的21個(gè)個(gè)體的連鎖檢測(cè)帶型結(jié)果如圖2-b，表明其與871C的抗性不連鎖。

a：T檢驗(yàn)顯示每個(gè)染色體的抗性連鎖分析顯著性水平（**：P＜0.01），實(shí)線和虛線分別為第一次、第二次連鎖分析結(jié)果T test showed the significance level of resistance linkage analysis on each chromosome, (**:P＜0.01), twice linkage analysis results were shown as a solid line and dotted line, respectively；b：Chr22上S2205的第一次連鎖擴(kuò)增結(jié)果（M：Marker，1—3：多態(tài)帶型，其中1為99R帶型，2為Dazao-N帶型，3為F1帶型，4—47為44個(gè)連鎖個(gè)體的連鎖帶型First linkage analysis amplification result of S2205, a polymorphism marker on Chromosome 22. (M: Marker, 1-3: polymorphic bands, 1: 99R band, 2: Dazao-N band, 3: F1 band, 4-47: linkage analysis band of 44 linkage individuals)；c：S2205的第二次連鎖擴(kuò)增結(jié)果（4—27：24個(gè)連鎖個(gè)體的擴(kuò)增帶型Second linkage analysis amplification result of S2205 (4-27: linkage analysis band of 24 linkage individuals)

a：抗性親本99R的回交后代連鎖分析擴(kuò)增結(jié)果（M：Marker，1—3：多態(tài)帶型，其中1為99R帶型，2為Dazao-N帶型，3為F1（Dazao-N × 99R）帶型，4—24：BC1F（Dazao-N × 99R）×Dazao-N 21個(gè)連鎖個(gè)體的擴(kuò)增帶型）The linkage analysis amplification result of the backcross population of resistant parent 99R (M: Marker, 1-3: polymorphic bands, 1: 99R band, 2: Dazao-N band, 3: F1(Dazao-N × 99R) band, 4-24:linkage analysis band of 21 BC1F（Dazao-N × 99R）×Dazao-N linkage individuals)；b：抗性親本871C的回交后代連鎖分析擴(kuò)增結(jié)果（M：Marker，1—3：多態(tài)帶型，其中1為871C，2為N4，3為F1（871C × N4），4—24：BC1F(871C × N4) × N4 21個(gè)連鎖個(gè)體的擴(kuò)增帶型）The linkage analysis amplification result of the backcross population of resistant parent 871C (M: Marker, 1-3: polymorphic bands, 1: 871C band, 2: N4 band, 3: F1（871C × N4）band, 4-24: linkage analysis band of 21 BC1F(871C × N4) × N4 linkage individuals)

3 討論

本研究以家蠶抗性品系（99R和871C）和感性品系（Dazao-N和N4）為親本，組配了連鎖分析分離群體（回交群體BC1F）和定位分析分離群體（回交群體BC1M），對(duì)家蠶對(duì)BmNPV的抗性進(jìn)行了連鎖分析。在完成回交群體配制的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，選取感病個(gè)體用于后續(xù)對(duì)抗性性狀的遺傳學(xué)分析，規(guī)避了可能的“假陽(yáng)性”抗性個(gè)體的干擾。1963年，冢本提出了家蠶對(duì)BmNPV抗性受一對(duì)顯性基因控制的“坪區(qū)”理論，該理論表明，用處于雙親半致死濃度之間“坪區(qū)”內(nèi)的攻毒劑量處理分離群體時(shí)，可以有效區(qū)分群體中的抗性個(gè)體和感性個(gè)體[12]。趙遠(yuǎn)[16]在對(duì)其用于抗性遺傳連鎖分析的分離群體進(jìn)行攻毒試驗(yàn)時(shí)，選擇了1.86×108和1.86×106個(gè)多角體/ml這兩個(gè)病毒濃度，來(lái)選取分離群體中的抗性個(gè)體和感性個(gè)體。盡管其并未指明這兩個(gè)濃度與其雙親的半致死濃度之間的關(guān)系，但其調(diào)查結(jié)果表明這兩個(gè)濃度均介于雙親半致死濃度之間。故依據(jù)上述的坪區(qū)理論，加之抗性的雜種優(yōu)勢(shì)，筆者選擇了2×106個(gè)多角體/頭（即2×108NPV/ml）這一介于99R和Dazao-N雙親半致死劑量之間且略高于均值的濃度作為分離群體攻毒濃度，以確保取材的準(zhǔn)確性。通過(guò)這種方法，對(duì)99R和Dazao-N為親本所配制的連鎖分析群體材料進(jìn)行了兩次連鎖分析（圖1），結(jié)果差別較大，第一次的分析在Chr22上找到了一個(gè)與抗性連鎖的多態(tài)性標(biāo)記（S2205），但在第二次的分析中并沒(méi)有重復(fù)得到這一結(jié)果，也沒(méi)有找到其他的連鎖關(guān)系。

2007年，趙遠(yuǎn)[16]利用BmNPV抗性親本NB和感性親本306，組配了連鎖分析和定位分析的材料，對(duì)抗性進(jìn)行了連鎖定位分析，得到8個(gè)與抗性連鎖的標(biāo)記，位于家蠶第3和第25號(hào)染色體上；2014年，呂鵬[17]用同樣的親本和分離群體組配方式，也對(duì)抗性進(jìn)行了連鎖定位分析，但其最后定位得到與抗性連鎖的區(qū)段位于第23號(hào)染色體。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)，截止目前關(guān)于家蠶BmNPV抗性的連鎖定位分析，其結(jié)果不可重復(fù)性是一個(gè)普遍的問(wèn)題。那么這是否意味著現(xiàn)有的連鎖及定位分析結(jié)果是不準(zhǔn)確的呢？也不如此。呂鵬[17]對(duì)其在23號(hào)染色體定位區(qū)域內(nèi)的部分候選基因進(jìn)行了分析，尤其是其對(duì)定位區(qū)域內(nèi)的兩個(gè)羧酸脂酶基因進(jìn)行了克隆，發(fā)現(xiàn)了雙親之間的序列差異，作者推斷其功能可能與家蠶對(duì)BmNPV的抗性有關(guān)。這表明在現(xiàn)有連鎖及定位分析得到的染色體或區(qū)域中，的確可能包含與BmNPV抗性相關(guān)的基因?？偨Y(jié)發(fā)現(xiàn)，目前在NB與306這對(duì)親本為材料的研究中，共檢測(cè)到3條染色體或其區(qū)域存在對(duì)BmNPV抗性的連鎖關(guān)系。結(jié)合本文試驗(yàn)結(jié)果，在99R品系中，至少也應(yīng)有一條染色體存在與其抗性的連鎖關(guān)系。進(jìn)一步說(shuō)明，家蠶對(duì)BmNPV的抗性，不同品系其抗性遺傳基礎(chǔ)具有很大的差異性，而同一品系可能具有多個(gè)控制抗性的位點(diǎn)。因此，筆者推測(cè)造成家蠶對(duì)BmNPV抗性的連鎖定位分析結(jié)果不可重復(fù)或不一致的原因，可能與家蠶對(duì)BmNPV抗性的遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜有關(guān)。

劉曉勇等[15]利用RAPD技術(shù)在NB和306中篩選得到了一個(gè)與家蠶BmNPV抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記OPF-072023（AY380833），其在后續(xù)的研究及育種中都被證明與NB抗性緊密連鎖。本研究為了驗(yàn)證此標(biāo)記是否與99R的抗性性狀相連鎖，對(duì)其用99R與Dazao-N的BC1F連鎖個(gè)體進(jìn)行分析，結(jié)果表明該標(biāo)記與99R的抗性并不連鎖。曹錦如等[24]在2008年用標(biāo)記AY380833輔助抗性品系選育，發(fā)現(xiàn)在多品系檢測(cè)中該標(biāo)記并非與抗性完全相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。對(duì)這一結(jié)果較合理的解釋是不同抗性品系其控制抗性的遺傳基礎(chǔ)不同，所以NB中與抗性連鎖的位點(diǎn)（AY380833）在99R或其他抗性品系中并不與抗性連鎖。考慮到錢(qián)荷英等[20]在2013年檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AY380833在抗性品系871C中顯示為陽(yáng)性，與其抗性緊密相關(guān)，筆者同樣配制了871C與另一感性品系N4的連鎖分析群體，并檢測(cè)了該標(biāo)記與其抗性的連鎖情況，結(jié)果表明其在該連鎖分析群體中與抗性也不連鎖。這說(shuō)明即使是同一抗性品系，與不同的感性親本組配連鎖定位分析材料時(shí)，其能被檢測(cè)到的抗性連鎖位點(diǎn)也可能不同，暗示了871C可能也具有多個(gè)抗性位點(diǎn)，這也進(jìn)一步支撐了上述NB和99R的相關(guān)結(jié)論。另一方面，目前關(guān)于家蠶抗BmNPV的反向遺傳學(xué)研究，如通過(guò)蛋白組和轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)數(shù)據(jù)，篩選并鑒定到了抗、感品系中差異表達(dá)并有可能參與抗性的大量基因[25-30]，這些基因涉及了眾多的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞骨架構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、細(xì)胞周期、能量代謝、細(xì)胞壓力應(yīng)答等[30-32]。這些結(jié)果均反映了家蠶對(duì)BmNPV抗性或敏感性遺傳調(diào)控基礎(chǔ)的復(fù)雜性。

經(jīng)典遺傳學(xué)的研究結(jié)果表明家蠶對(duì)BmNPV的抗性是受一對(duì)顯性主基因及微效修飾基因的共同控制，且雜合個(gè)體具有雜種優(yōu)勢(shì)，是一種質(zhì)量-數(shù)量性狀[4,10-13]。家蠶的抗性性狀在分離世代中每一個(gè)體的表型值無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定，所以研究者為了簡(jiǎn)化定位過(guò)程，著重考慮了其質(zhì)量性狀遺傳特征，參考運(yùn)用質(zhì)量性狀研究的方法快速鑒定主效基因。綜合本研究及前人的結(jié)果，筆者認(rèn)為家蠶對(duì)BmNPV抗性是一種復(fù)雜性狀，在符合“質(zhì)量-數(shù)量性狀”結(jié)論的同時(shí)，其數(shù)量性狀特征突出，在后續(xù)抗性相關(guān)基因的篩查和克隆研究中應(yīng)給予足夠重視。

家蠶對(duì)BmNPV抗性受很多因素的影響，比如添毒時(shí)期和濃度、蠶的體質(zhì)等，同時(shí)，其數(shù)量性狀的特征也使得蠶體抗性水平受溫濕度、桑葉質(zhì)量等外界環(huán)境影響較大，而由于所取材料的樣本較小，加之不同批次攻毒取材相對(duì)來(lái)說(shuō)是獨(dú)立進(jìn)行的，所以每次所取得樣本之間可能存在差異，導(dǎo)致目前連鎖分析的結(jié)果不具有可重復(fù)性。這毫無(wú)疑問(wèn)會(huì)給后續(xù)的精細(xì)定位及候選基因篩查帶來(lái)困難，因此改進(jìn)現(xiàn)有的研究方法，提高結(jié)果分析的準(zhǔn)確性十分必要。基于上述對(duì)家蠶對(duì)BmNPV抗性的遺傳基礎(chǔ)分析，筆者認(rèn)為可從以下幾方面進(jìn)行改進(jìn)。第一，由于抗性具有數(shù)量性狀特征，所以可以考慮引入一些數(shù)量性狀定位的研究方法。但由于抗性這一性狀本身的特殊性，使得研究者不能精確測(cè)定分離群體中的每個(gè)個(gè)體的抗性，因此常規(guī)的QTL定位方法并不適合于家蠶對(duì)BmNPV抗性的研究，所以，選擇性基因分型（selective genotyping）或基于極端個(gè)體的QTL定位方法可以作為較適合的參考方法。其原理與現(xiàn)有定位方法類(lèi)似，只不過(guò)為了得到表型較準(zhǔn)確的個(gè)體，需要加大攻毒的群體規(guī)模，同時(shí)選擇更合適的攻毒濃度，例如更低的病毒濃度下攻毒選取感性個(gè)體，或更高的病毒濃度處理下選擇抗性個(gè)體；第二，利用現(xiàn)有保存的大量家蠶品系進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析是目前數(shù)量性狀定位中常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是基于品系的關(guān)聯(lián)分析不需要確定單個(gè)個(gè)體的表現(xiàn)值水平，而是評(píng)估每個(gè)品系的表現(xiàn)值水平[33]，這使得這種方法比較適合家蠶BmNPV抗性這一性狀的定位分析，且這種方法具有定位精度高，能綜合分析多個(gè)品系抗性位點(diǎn)的特性[34]；第三，將連鎖分析與關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法，即配制多親本重組近交系，利用其進(jìn)行連鎖及關(guān)聯(lián)分析。這種基于多親本的重組近交系群體進(jìn)行數(shù)量性狀定位的方法，既規(guī)避了連鎖分析與關(guān)聯(lián)分析的一些不足，又集合了兩者的諸多優(yōu)點(diǎn)，是一種越來(lái)越受到研究人員關(guān)注的定位策略[35-36]。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)家蠶BmNPV抗性品系99R的抗性性狀進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果不具重復(fù)性，同時(shí)對(duì)已公布的與抗性位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記AY380833，用抗性品系（99R和871C）與感性品系組配回交連鎖分析群體進(jìn)行連鎖驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其與兩者的抗性性狀均不連鎖。綜合本研究和前人的研究結(jié)果，對(duì)該性狀的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行了分析討論，進(jìn)一步說(shuō)明家蠶對(duì)BmNPV的抗性，不同品系其抗性遺傳基礎(chǔ)具有很大的差異性，同一品系可能具有多個(gè)控制抗性的位點(diǎn)。并且，筆者認(rèn)為家蠶對(duì)BmNPV抗性是一種復(fù)雜性狀，在符合“質(zhì)量-數(shù)量性狀”結(jié)論的同時(shí)，其數(shù)量性狀特征很突出，在后續(xù)抗性基因鑒定及品系和品種培育研究中應(yīng)給予足夠重視?；诖颂岢隽艘恍┛剐晕稽c(diǎn)定位方法的改進(jìn)意見(jiàn)，以期能為后續(xù)準(zhǔn)確地定位家蠶BmNPV抗性基因提供一定的參考及啟發(fā)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Insight into Genetic Basis ofResistant Strains with Resistance to BmNPV by Molecular Linkage Analysis

GAO Rui1, LI ChunLin1, TONG XiaoLing1, CAO MingYa1, SHI MeiNing2, XU AnYing3, LU Cheng1, DAI FangYin1

(1College of biotechnology, Southwestern University/State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology/Key Laboratory of sericulture functional genomics and Biotechnology, Ministry of agriculture, Chongqing 400715;2The Guangxi Zhuang Autonomous Region sericulture science and Technology Research Institute, Nanning 530007;3The Sericultural Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhenjiang 212018, Jiangsu)

【Objective】nucleopolyhedrovirus (BmNPV) can lead thenucleopolyhedrosis, which caused a huge loss in the sericulture industry. The objective of this study is to map the controlling genes and understand the genetic basis underlying the BmNPV resistance to serve the theory support for resistant variety breeding. 【Method】Backcross population BC1F (using for linkage analysis)andBC1M (using for mapping analysis) were derived from crosses between the highly resistantstrain 99R and thesensitive strain Dazao-N. Concentration gradient of virus was used to treat the parents, and the number of infected individuals was recorded. Then by using SPSS17.0, the LD50for each parent was calculated. Based on appraisal of resistance performance of twoparents, the virus adding concentration for BC1population was determined and then the virus was fed to larva quantitatively at the start of 4th instar one by one. The infected individuals in theBC1F were chosen as linkage analysis materials. By using the screened polymorphism markers covering allautosomes, linkage analysis was conducted and then the genotype data were analyzed by T test to get the linkage significance level of each polymorphism marker to show whether it linked with resistance.Thereafter, polymorphism markers will be enriched on the chromosomes which include the resistance linked polymorphism markers to map resistance locus on them. 【Result】Median lethal dose (LD50) of 99R and Dazao-N is 2.92×106and 9.78×105polyhedral bodies, respectively, and the dose 2.0×106was chosen as the infection dosage of BC1backcross population, which is slightly higher than the average of two parents’ LD50. Two independent linkage analyses were conducted successively in the autumn of 2014 and spring of 2015, which got a discrepant result that the linkage analysis result could not be repeated in the following confirmation; i.e., one marker, S2205, on Chr 22 was identified to link with resistance in the 1st experiment, while no linked marker was identified in the following one. Comparison with the previous reports on the linkage and mapping analysis of BmNPV resistance, it was found that the nonrepeatability was ubiquitous in the related researches in.Previously, a molecular marker (AY380833) was found to highly link with the resistant trait in NB and 871C, which are both the highly resistance strains to BmNPV. However, the linkage relationship was not detected in the linkage analysis population of 99R and 871C here.【Conclusion】the genetic complexity of resistance by molecular linkage analysis was further proved, including the variation among different resistant strains, as well the plausible multiple resistant loci in one single strain. At the same time, it was proposed that the BmNPV resistance may be a complex trait, as a prerequisite to be one type of qualitative-quantitative traits, the quantitative trait characteristic of BmNPV resistance is very obvious.

; BmNPV; resistance; molecular markers; linkage analysis

2016-04-28；接受日期：2016-08-27

國(guó)家“863”計(jì)劃（2013AA102507）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31372379）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-22）

高瑞，E-mail：1067531904@qq.com。通信作者代方銀，Tel：023-68250793；E-mail：fydai@swu.edu.cn