劉曉丹，潘 濤

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究

紅景天苷對心肌缺血-再灌注大鼠心肌梗死面積及細(xì)胞凋亡的影響

劉曉丹，潘 濤

目的 觀察紅景天苷對心肌缺血再灌注損傷(MIRI)大鼠心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討大株紅景天抗MIRI的作用。方法 將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組6只：假手術(shù)組(Sham)、心肌缺血-再灌注模型組(I/R)、紅景天苷預(yù)防組(紅景天苷+缺血再灌注，S+I/R)、紅景天苷治療組(缺血再灌注+紅景天苷，I/R+S)、紅景天苷預(yù)防組+磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特異性抑制劑LY294002組(S+I/R+LY組)、紅景天苷治療組+PI3K特異性抑制劑LY294002組(I/R+S+LY組)。紅景天苷預(yù)防組和預(yù)防組+LY組造模前連續(xù)給藥3 d；紅景天苷治療組和治療組+LY組再灌注即刻加予紅景天苷；Sham組和I/R組均給予等量生理鹽水腹腔注射；預(yù)防+LY組和治療+LY組于冠脈左前降支(LAD)結(jié)扎前30 min腹腔注射PI3K特異性抑制劑LY294002。心肌缺血30 min再灌注24 h后，迅速摘取大鼠心臟留取心室，運(yùn)用Evans’blue及TTC法雙重染色，確定心肌梗死區(qū)和缺血區(qū)面積；運(yùn)用末端標(biāo)記法(TUNEL)染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡并計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果 與I/R組比較，紅景天苷預(yù)防組和治療組均能顯著縮小MIRI大鼠的心肌梗死面積(P<0.05)，TUNEL法檢測陽性細(xì)胞核顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與預(yù)防組和治療組比較，預(yù)防+LY組及治療+LY組心肌梗死面積顯著擴(kuò)大，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 紅景天苷能有效減少M(fèi)IRI大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

心肌缺血-再灌注損傷；紅景天苷；心肌梗死面積；細(xì)胞凋亡；磷脂酰肌醇-3-激酶

冠心病是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一，血運(yùn)重建是目前治療冠心病重要的有效手段，成功地血運(yùn)重建可快速恢復(fù)缺血心肌供血及供氧。已有研究證實(shí)，再灌注是一把“雙刃劍”，它在恢復(fù)心肌供血及供氧同時(shí)，也使其超微結(jié)構(gòu)、代謝及心肌功能發(fā)生新的損傷，甚至出現(xiàn)不可逆的心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。因此，MIRI已成為冠心病治療過程的焦點(diǎn)問題，在保證再灌注治療的心肌保護(hù)作用不受影響，如何減少再灌注損傷，是當(dāng)前亟待解決的臨床問題。心肌缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡之間有密切關(guān)系，并且在心臟生理、病理發(fā)展過程中起重要作用，認(rèn)為是心臟由代償性變化向病理性變化發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[2]。中藥治療MIRI療效確切，許多從中藥中分離得到的化合物都具有抗缺血-再灌注損傷作用，其中大株紅景天的心肌保護(hù)作用受到關(guān)注。本研究應(yīng)用紅景天苷對MIRI大鼠進(jìn)行缺血預(yù)處理和治療，觀察紅景天苷在對大鼠MIRI心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性SD大鼠，體重220 g±20 g(由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。

1.2 主要藥物和試劑 紅景天苷(南京奧多福尼生物科技有限公司)、10%水合氯醛(中國上海白鶴化工廠生產(chǎn))、LY-294002 hydrochloride(SIGMA-ALORICH)。Tunel原位凋亡試劑盒：Roche公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)：美國Sigma公司；Evan’s blue：Sigma公司；

1.3 主要儀器 HX-100E小動物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)、DH4000A型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、PAC3 000電泳儀(Bio-Rad)。

1.4 方法

1.4.1 手術(shù)及用藥 將實(shí)驗(yàn)動物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組6只。假手術(shù)組(Sham)：開胸暴露心臟并分離冠脈左前降支(LAD)，只穿線不結(jié)扎，直接關(guān)胸。心肌缺血-再灌注模型組(I/R)、紅景天苷預(yù)防組(紅景天苷+缺血再灌注，S+I/R)、紅景天苷治療組(缺血再灌注+紅景天苷，I/R+S)、紅景天苷預(yù)防組+磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特異性抑制劑LY294002組(S+I/R+LY組)、紅景天苷治療組+PI3K特異性抑制劑LY294002組(I/R+S+LY組)均穿線并結(jié)扎LAD起始部，心肌缺血30 min后剪斷結(jié)扎線，再通閉塞的冠脈，恢復(fù)冠脈血流和心肌再灌注，制備I/R模型。心電圖穩(wěn)定10 min后關(guān)胸。紅景天苷預(yù)防組和預(yù)防組+LY組在造模前連續(xù)給藥3 d，每日1次，紅景天苷12 mg/kg腹腔注射；紅景天苷治療組和治療組+LY組再灌注即刻加予紅景天苷12 mg/kg腹腔注射；Sham組和I/R組均給予等量生理鹽水腹腔注射；預(yù)防+LY組和治療+LY組于LAD結(jié)扎前30 min腹腔注射0.3 mg/kg體重的PI3K特異性抑制劑LY294002。

1.4.2 指標(biāo)檢測 Evans’blue-TTC法測量心肌梗死范圍，通過計(jì)算機(jī)圖像分析軟件計(jì)算出梗死區(qū)面積(IR)占缺血區(qū)面積(ARR)的百分比。心肌梗死范圍(IR/AAR)(%)=蒼白色面積/(紅色面積+蒼白色面積)×100%。原位末端標(biāo)記(TUNEL)法測定細(xì)胞凋亡，每個(gè)標(biāo)本片取5個(gè)分布均勻的視野作為觀察區(qū)，正常細(xì)胞核呈深藍(lán)色，陽性凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，分別計(jì)數(shù)心肌凋亡細(xì)胞數(shù)，取平均值，凋亡細(xì)胞占所計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。

2 結(jié) 果

2.1 紅景天苷對大鼠心肌梗死范圍的影響 梗死范圍以梗死區(qū)面積(IR)比危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR)表示，詳見圖1。與I/R組比較，紅景天苷預(yù)防組和治療組能顯著縮小MIRI大鼠的梗死面積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，預(yù)防組與防治組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺血前給予 LY294002可以完全消除紅景天苷縮小心肌梗死面積的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖2。

I/R組 紅景天苷預(yù)防組 紅景天苷防治組 預(yù)防+LY組 治療+LY組

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較±s) %

注：與手術(shù)組比較，*P<0.05；與預(yù)防組+LY比較，#P<0.05；與治療組+LY比較，∧P<0.05。

圖2 大鼠心肌梗死范圍比較

2.2 紅景天苷對MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的影響 I/R組凋亡指數(shù)與Sham組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而給予紅景天苷兩組與I/R組比較，陽性細(xì)胞核顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示紅景天苷可減少缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡。紅景天苷預(yù)防組與治療組比較，陽性細(xì)胞核，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖3、圖4。

組別nAISham組62．70±0．72I/R組635．00±1．57預(yù)防組6 23．77±2．201)2)治療組6 29．27±1．331)3)預(yù)防+LY組633．63±2．48治療+LY組632．67±1．29 與I/R組比較，1)P<0．05；與預(yù)防+LY組比較，2)P<0．05；與治療+LY組比較，3)P<0．05。

Sham組 I/R組 預(yù)防組

治療組 預(yù)防+LY組 治療+LY組

注：與手術(shù)組比較，*P<0.05；與預(yù)防組+LY比較，#P<0.05；與治療組+LY比較，∧P<0.05。

圖4 缺血再灌注后不同組別心肌組織TUNEL染色凋亡指數(shù)測定

3 討 論

MIRI造成的心肌細(xì)胞凋亡是心功能不全、心力衰竭的關(guān)鍵因素，細(xì)胞凋亡可減少心肌功能細(xì)胞數(shù)量，心肌收縮能力下降。如何減少心肌細(xì)胞在缺血缺氧情況凋亡，成為現(xiàn)今研究熱點(diǎn)。MIRI兩個(gè)主要病理機(jī)制是氧化應(yīng)激和早期炎癥反應(yīng)，有研究表明聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶(PARP)在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷發(fā)展過程中起重要作用，在MIRI早期，PARP-1明顯表達(dá)并呈動態(tài)變化，給予PARP-1抑制劑，可減輕再灌注給心肌帶來損傷，減小心肌梗死面積，早期對心肌再灌注起保護(hù)作用；miR-24能抑制心肌細(xì)胞缺血缺氧條件下凋亡水平，進(jìn)而改善心梗后心功能[3-6]。有研究顯示，缺血預(yù)適應(yīng)與缺血后適應(yīng)通過多機(jī)制多途徑，包括刺激心臟釋放G蛋白耦聯(lián)受體激動劑，激活再灌注損傷救援激酶(RISK)通路(包括PI3K/Akt、PKC、MAPKs、ERK1/2和P38)，抑制促凋亡通路GSK3，并調(diào)節(jié)ATP敏感的K+通道及線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)功能，發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)[7]。有研究顯示，在細(xì)胞受到氧化損傷時(shí)，PI3K/AKT通路的激活對細(xì)胞存活、增殖、減少氧化應(yīng)激等有重要作用；PI3K/AKT通路激活，可通過對凋亡基因、抗凋亡基因和凋亡相關(guān)因子調(diào)節(jié)及抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放等機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡[8-9]。

本研究應(yīng)用紅景天苷對MIRI大鼠進(jìn)行預(yù)處理和后干預(yù)，同時(shí)運(yùn)用PI3K特異性抑制劑LY294002探討其作用機(jī)制，結(jié)果顯示，紅景天苷預(yù)防組和治療組大鼠心肌梗死面積較I/R組縮小和細(xì)胞凋亡指數(shù)均較I/R組顯著降低，證實(shí)大株紅景天對MIRI具有保護(hù)作用；加用PI3K特異性抑制劑LY294002后，紅景天苷作用被阻斷，初步證實(shí)紅景天苷對MIRI保護(hù)作用與PI3K/Akt通路有關(guān)。大株紅景天含有紅景天苷、酪醇(Tyrosol)、紅景天芬(Rosavin)、紅景天任(Rozarin)、紅景天素(Rosin)及多糖等有效成分，藥理學(xué)研究顯示其有提高心臟泵血功能，降低心肌耗氧量，改善心肌缺血、減輕MIRI、抑制血小板聚集等作用。紅景天苷可以擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠脈灌流量，并能通過調(diào)控線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放拮抗低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，減少再灌注損傷[10-11]。臨床研究證實(shí)，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用大株紅景天，可明顯降低急性冠脈綜合征(ACS)病人血漿腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平，提高心臟射血分?jǐn)?shù)，明顯改善病人心功能[12]。

本研究結(jié)果顯示，紅景天苷可抑制MIRI引起的心肌梗死面積進(jìn)一步擴(kuò)大及心肌細(xì)胞凋亡，并改善MIRI后心功能，其抗MIRI作用可被PI3K特異性抑制劑消除，但其作用是否有擬PARP-1抑制劑的作用，能否與miR-24協(xié)同作用，及其對MIRI相關(guān)心肌細(xì)胞線粒體的作用，有待進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯薛妮)

Influence of Salidroside on Myocardial Infarctional Size and Apoptosis Index in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Liu Xiaodan,Pan Tao

The First Clinical College,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu,China

Pan Tao

Objective To observe the effect of salidroside on myocardial size and apoptosis index in rats with myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI),to investigate the function of salidroside repel MIRI.Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into 6 groups ：sham operation group (S group),ischemia- reperfusion group (I/R group) ,salidroside preventive group(first treating with salidroside and then inducing ischemia -reperfusion) and salidroside treatment group (first inducing ischemia-reperfusion and then treating with salidroside),salidroside preventive + LY294002 group,salidroside treatment + LY294002 group ,6 rats in each group.Both of the salidroside preventive group and salidroside preventive +LY group administered continuously modeling three days before,salidroside treatment group and salidroside treatment +LY group in addition to the salidroside immediate reperfusion.Rats in sham operation group and ischemia- reperfusion group(I/R group) received a same volume of 0.9%NaCl.The salidroside preventive +LY group and treatment +LY group with an additional injection of PI3K inhibitor(LY294002) injection slowly 35 min before ligation.Myocardial ischemia sizes were measured by Evans blue and 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.Myocardium apoptosis rate was measured by TUNEL．Results Compared with I/R group,in both salidroside preventive and treatment groups,myocardial infact size reduced and the apoptosis index lower remarkable (P<0.05),Compared with salidroside treatment group and preventive group ,preventive+LY group and treatment+LY group myocardial infact size increased,apoptosis index increased(P<0.05).Conclusion Salidroside can reduce myocardial infarctional size and apoptosis index in rats with MIRI.

myocardial ischemia reperfusion injury；salidroside；myocardial infact size；apoptosis； phosphatidylinositol 3-kinases

江蘇省中醫(yī)藥局基金課題(No.LZ11177)

南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(南京 210029)

潘濤，E-mail：sunmoon6264@126.com

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.010

1672-1349(2016)23-2751-04

2016-07-06)

引用信息：劉曉丹，潘濤.紅景天苷對心肌缺血-再灌注大鼠心肌梗死面積及細(xì)胞凋亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(23)：2751-2754.