龔 鶯，何伯偉，王淑珍，毛碧增*

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì) 浙江 杭州 310020；3.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江 杭州 310058)

鐵皮石斛內(nèi)生菌研究進(jìn)展

龔 鶯1，何伯偉2，王淑珍3，毛碧增1*

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì) 浙江 杭州 310020；3.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江 杭州 310058)

鐵皮石斛作為蘭科石斛屬的一種珍貴藥材，其生長(zhǎng)與內(nèi)生菌密不可分。目前已從生長(zhǎng)在不同環(huán)境下的鐵皮石斛中分離得到多種真菌和細(xì)菌，部分菌株對(duì)植株具有顯著的促生作用。詳細(xì)總結(jié)鐵皮石斛內(nèi)生菌的多樣性、內(nèi)生菌對(duì)宿主作用的研究結(jié)果，展望了今后的研究方向。

鐵皮石斛； 內(nèi)生真菌； 內(nèi)生細(xì)菌； 促生作用

植物內(nèi)生菌是指在健康植物中度過(guò)近乎全部的生命周期，對(duì)寄主植物產(chǎn)生一定間接或直接作用的一類(lèi)微生物，主要包括真菌和細(xì)菌。一方面，寄主植物可為內(nèi)生菌提供生存所需的環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)和能量；另一方面，內(nèi)生菌依靠自身的生命代謝活動(dòng)對(duì)寄主植物產(chǎn)生影響[1]。已有研究表明，植物內(nèi)生菌有促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2]、增強(qiáng)宿主氮吸收[3]、提高植物抗逆性[4]、提高抗病性[5]等作用。

鐵皮石斛是蘭科石斛屬草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，為中華“九大仙草”之首，《中華人民共和國(guó)藥典》2010版特將鐵皮石斛單獨(dú)收載[6]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015版記載鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱的功效，主要用于治療熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨癱軟[7]。因其廣泛的藥用價(jià)值和顯著的藥用效果，鐵皮石斛已成為制藥的主要原料之一。以鐵皮石斛(楓斗)為原料的保健食品，全國(guó)生產(chǎn)企業(yè)55家，產(chǎn)品88個(gè)，其中浙江省生產(chǎn)企業(yè)15家，產(chǎn)品55個(gè)，主要?jiǎng)┬陀蓄w粒劑、膠囊片劑、口服液、浸膏、飲料等。鐵皮石斛在制藥中的應(yīng)用也使得其原料的需求量急劇上升。2015年全國(guó)種植面積達(dá)0.467萬(wàn)hm2，其中浙江省種植面積達(dá)2 333 hm2。鐵皮石斛被譽(yù)為我國(guó)民族健康產(chǎn)業(yè)和保健食品的典型代表，贏得與人參、靈芝、冬蟲(chóng)夏草同等的市場(chǎng)地位。

中藥講究道地性，即指在一定自然條件、生態(tài)環(huán)境的地域內(nèi)所產(chǎn)的藥材，因特有的水土、氣候、日照、生物分布等，保證了藥材的質(zhì)量[8]。道地藥材的形成有三大因素，即生物因素、環(huán)境因素和人為因素[9]。野生鐵皮石斛多附生于巖石或松木上，并與內(nèi)生菌共生生長(zhǎng)，是影響其藥性的因素之一。人工栽培脫離原有生態(tài)環(huán)境，藥材品質(zhì)與野生型存在一定差異。為探究生物條件的影響，學(xué)者們?cè)趦?nèi)生菌對(duì)提高鐵皮石斛自然成活率、提升組培苗質(zhì)量、穩(wěn)定藥理作用等方面進(jìn)行了大量研究，對(duì)促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有一定的意義。本文著重對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生菌的多樣性和對(duì)宿主的生理協(xié)同作用進(jìn)行全面系統(tǒng)總結(jié)，以期對(duì)內(nèi)生菌更深入的研究和鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)更好的發(fā)展提供一定理論依據(jù)。

1 鐵皮石斛內(nèi)生真菌的多樣性

鐵皮石斛內(nèi)生真菌資源豐富，目前從不同生境下(四川、云南、福建、河南、廣西、湖南、安徽、浙江等)的鐵皮石斛中均已發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)生真菌，包括擔(dān)子菌亞門(mén)、半知菌亞門(mén)和子囊菌亞門(mén)的57個(gè)屬[10-21]。郭順星等[11]從四川、云南、福建的野生鐵皮石斛根部分離得到內(nèi)生真菌14株，分屬于柱孢霉屬(Cylindrocarpon)、支頂孢霉屬(Acremonium)、瘤菌根菌(Epulorhiza)等11個(gè)屬；趙昕梅等[12]從河南野生鐵皮石斛根部分離得到4株鐮孢菌屬(Fusarium)和柱霉菌屬(Scytalidium)的內(nèi)生真菌；帥紅艷[13]從廣西環(huán)江產(chǎn)野生鐵皮石斛根中分離得到37株內(nèi)生真菌，分屬于鐮孢菌屬、頭孢霉屬(Cephalosporium)、擬小卵孢屬(Ovulariopsis)等，其中18株真菌具有一定的抗菌活性；毛益婷等[14]從廣西樂(lè)業(yè)雅長(zhǎng)蘭科植物自然保護(hù)區(qū)和湖南茛山世界自然遺產(chǎn)風(fēng)景名勝區(qū)的鐵皮石斛根中分離得到41株內(nèi)生真菌，分屬于毛殼菌屬(Chaetomium)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、間座殼屬(Diaporthe)等20個(gè)屬，34個(gè)種；吳慧鳳等[15]也從湖南茛山鐵皮石斛根部組織中分離得到37株內(nèi)生菌，其中26株為致病菌，11株為非致病菌，非致病菌中有9株為促生菌，這些促生菌分屬于小球殼屬(Mycosphaerella)、瘤菌根菌屬、球座菌屬(Guignardia)等。

對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生真菌的研究不僅僅局限于根部，對(duì)莖和葉中的內(nèi)生真菌也有一定研究。胡克興等[16]從云南野生鐵皮石斛的根、莖、葉中分離得到67株內(nèi)生真菌，其中根部?jī)?nèi)生真菌分布最多。通過(guò)對(duì)產(chǎn)孢真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，認(rèn)為其分屬于鐮孢菌屬、鏈格孢屬(Alternaria)、支頂孢屬等11個(gè)屬；對(duì)不產(chǎn)孢真菌進(jìn)行ITS分子鑒定，認(rèn)為其分屬于白粉寄生孢屬(Ampelomyces)、節(jié)菱孢屬(Arthrinium)等7個(gè)屬。嚴(yán)亮等[17]從云南野生鐵皮石斛根、莖、葉中共分離得到16株真菌，分屬于脈孢菌屬(Neurospora)、糞殼菌屬(Sordaria)、毛殼菌屬等9個(gè)屬。郁陽(yáng)等[18]從安徽地區(qū)野生鐵皮石斛根、莖、葉中分離得到11株內(nèi)生真菌，分屬炭疽菌屬(Colletotrichum)、赤殼屬(Cosmospora)、鐮孢菌屬等5個(gè)屬，其中莖部?jī)?nèi)生真菌分布最多。陳澤斌等[19]采用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)裸胞殼屬(Emericella)是云南普洱市野生鐵皮石斛葉片中內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種群。李俊峰等[20]從浙江溫州雁蕩山野生鐵皮石斛根、莖、葉中分離得到31株內(nèi)生菌，真菌22株，莖部?jī)?nèi)生菌分布最多。5株真菌對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)有抑制作用，其中TG2的抑菌效果最佳，同時(shí)經(jīng)乙酸乙酯萃取得到的發(fā)酵代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。陳玉棟等[21]從人工培育的三年生健康鐵皮石斛根、莖、葉中共分離得到30株內(nèi)生真菌，根部?jī)?nèi)生真菌分布最多，其中鐮孢菌屬和曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢(shì)菌種。

不同生長(zhǎng)環(huán)境和不同植物器官使得鐵皮石斛根部?jī)?nèi)生真菌種類(lèi)出現(xiàn)了較多差異，可能與環(huán)境濕度、溫度等因素有關(guān)。從廣西和湖南野生鐵皮石斛根部分離得到較多菌種，主要為半知菌亞門(mén)和子囊菌亞門(mén)真菌；云南和浙江溫州野生鐵皮石斛中也存在較多內(nèi)生真菌，且根部和莖部的內(nèi)生真菌相較于葉部更豐富。人工養(yǎng)殖培育的鐵皮石斛中同樣存在較多內(nèi)生真菌，說(shuō)明鐵皮石斛與內(nèi)生真菌密不可分。

2 鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的多樣性

對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生菌的研究始于真菌，近年來(lái)對(duì)內(nèi)生細(xì)菌也有較多研究，分離得到的細(xì)菌種類(lèi)較為豐富，涵蓋了厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和梭桿菌門(mén)的50個(gè)屬[16,22-26]。張萍[22]從湖南野生鐵皮石斛根部分離得到19株內(nèi)生細(xì)菌，其中6株為促生菌，分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、蒼白桿菌屬(Herbaspirillum)、腸桿菌屬(Enterobacter)等5個(gè)屬，其對(duì)種子的萌發(fā)、原球莖的生長(zhǎng)、鐵皮石斛組培苗有顯著的促進(jìn)效果，同時(shí)具有一定的固氮、解磷、產(chǎn)鐵載體和分泌IAA的功能。俞婕[23]從蕭山、奉化、慶元采集的鐵皮石斛根部和莖部分離出134株內(nèi)生細(xì)菌，并從中篩選出11株優(yōu)勢(shì)菌種，其中9株為芽孢桿菌屬細(xì)菌，具有一定淀粉酶、卵磷脂酶和固氮酶活性。章華偉等[24]從浙江天臺(tái)山采集的野生鐵皮石斛根、莖、葉中共分離得到23株內(nèi)生菌，經(jīng)過(guò)鑒定分屬于土壤桿菌屬(Agrobacterium)、芽孢桿菌屬、泛菌屬(Pantoea)等7個(gè)屬。周小風(fēng)等[25]采用傳統(tǒng)分離法和PCG-DGGE法首先研究了鐵皮石斛不同組織中內(nèi)生菌的分布，發(fā)現(xiàn)根部分離得到22株細(xì)菌，主要為芽孢桿菌屬細(xì)菌；莖部分離得到22株細(xì)菌，主要為伯克氏菌屬(Burkholderiaceae)細(xì)菌；葉部分離得到17株細(xì)菌，主要為假氨基桿菌屬(Pseudaminobacter)細(xì)菌。其次研究了不同種植基地對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)從溫州鐵皮石斛中分離鑒定44株細(xì)菌，分屬于短波單胞菌屬(Brevundimonas)、假氨基桿菌屬等19個(gè)屬。從麗水慶元鐵皮石斛中分離鑒定了42株細(xì)菌，分屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)等16個(gè)屬。從蕭山鐵皮石斛中分離鑒定了40株細(xì)菌，分屬類(lèi)芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、伯克氏菌屬等22個(gè)屬。從奉化鐵皮石斛中分離鑒定了50株細(xì)菌，分屬于細(xì)桿菌屬(Microbacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)等23個(gè)屬。從溫州野生鐵皮石斛中分離鑒定了17株細(xì)菌，分屬13個(gè)屬，從麗水慶元野生鐵皮石斛中分離鑒定了11株細(xì)菌，分屬4個(gè)屬。野生鐵皮石斛中分離得到了寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、草螺旋菌屬(Herbaspirillum)、泛菌屬等5個(gè)有別于人工鐵皮石斛內(nèi)生菌的菌屬，這些菌屬具有固氮、解磷脫硫、促生等功能。胡克興等[16]從云南野生鐵皮石斛中分離得到28株細(xì)菌，分屬于芽孢桿菌屬、類(lèi)芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)等10個(gè)屬。王明月等[26]從人工種植的二年生鐵皮石斛中分離得到49株內(nèi)生細(xì)菌，其中根中分離得到24株，莖中分離得到15株，葉中分離得到10株，熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)、環(huán)形芽孢桿菌(Bacillusaxarquiensis)為優(yōu)勢(shì)菌種。

鐵皮石斛不同組織中內(nèi)生菌多樣性的研究和不同生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬細(xì)菌為主要菌種，同時(shí)人工培育的鐵皮石斛中亦存在大量芽孢桿菌屬細(xì)菌，說(shuō)明該屬細(xì)菌在鐵皮石斛生活史中發(fā)揮了重要的作用。

3 鐵皮石斛內(nèi)生菌對(duì)宿主的作用

植物內(nèi)生菌在一定階段或全階段生存于植物體內(nèi)，與植物形成一種互利共生的關(guān)系。鐵皮石斛為蘭科植物，內(nèi)生菌在其生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。吳慧鳳等[15]將湖南野生鐵皮石斛中分離得到的非致病菌與鐵皮石斛共培養(yǎng)，菌種促生效果顯著，部分菌種使接菌苗鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率高出對(duì)照組30%，出芽數(shù)高出對(duì)照組80%～140%。俞婕等[27]從浙江桐廬鐵皮石斛中分離得到10株內(nèi)生細(xì)菌，其中ZJSH1菌株的102稀釋菌劑能均勻附著在培養(yǎng)基上并促進(jìn)組培苗生長(zhǎng)，同時(shí)該菌株接種共生后的鐵皮石斛組培苗平均干重比對(duì)照組高15.9%。俞婕等[28]也從浙江奉化鐵皮石斛中分離得到內(nèi)生細(xì)菌52株，其中部分菌株具有蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和一定的固氮活性。趙昕梅等[12]從河南野生鐵皮石斛中分離得到4株鐮孢菌屬和柱霉菌屬的內(nèi)生真菌，并通過(guò)發(fā)酵液噴施的方法篩選得到1株促生菌，該菌株對(duì)鐵皮石斛組培苗具有顯著的促生作用，其成活率提高30.43%，植株高度增加31.21%，鮮重增加40.61%。張萍等[29]從鐵皮石斛中分離得到19株內(nèi)生細(xì)菌，其中6株為促生菌，對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)、原球莖和組培苗生長(zhǎng)有較好促生效果。將這6株促生細(xì)菌與8株促生真菌進(jìn)行非拮抗篩選，在25組非拮抗組中篩選獲得6組處理，新根數(shù)、根分枝率、分蘗數(shù)和凈鮮重都顯著高于單一菌種處理組。董金海等[30]從安徽霍山鐵皮石斛中分離得到NL-215菌株，與鐵皮石斛組培苗共生培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)該菌株有明顯的促生長(zhǎng)作用，組培苗各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著增加，接菌苗凈增重量為對(duì)照的2.63倍，株高為對(duì)照的1.25倍，分株數(shù)為對(duì)照的1.14倍，根數(shù)為對(duì)照的1.27倍，新增葉數(shù)為對(duì)照的1.29倍，新芽數(shù)為對(duì)照的2.06倍，葉綠素a增加38.28%，葉綠素b增加43.93%，總?cè)~綠素含量為對(duì)照的1.41倍，多糖含量增加45.93%。侯曉強(qiáng)等[31]從石斛屬植物中分離得到36株內(nèi)生真菌，并篩選得到8株促生菌，其對(duì)鐵皮石斛組培苗的鮮重、莖粗、新根新芽數(shù)量等生理指標(biāo)都有一定程度的促進(jìn)作用，部分菌株表現(xiàn)顯著促生作用。朱波等[32]將從活樹(shù)附生的鐵皮石斛中分離得到的真菌接于組培苗中共培養(yǎng)，采用苯酚-硫酸法、熱浸法，并結(jié)合HPLC，綜合篩選發(fā)現(xiàn)4株菌種可提高根數(shù)、葉數(shù)、莖粗等農(nóng)藝性狀，促進(jìn)鐵皮石斛莖節(jié)變紫，總多糖含量分別提高113.7%、70.7%、196.0%、157.4%，極顯著高于對(duì)照組。這些研究說(shuō)明，內(nèi)生菌對(duì)鐵皮石斛的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且對(duì)品質(zhì)也有提高，同時(shí)真菌和細(xì)菌的共同作用較單一菌株有一定優(yōu)勢(shì)。

4 展望

鐵皮石斛具有很高的藥用價(jià)值，因其生長(zhǎng)速度慢、種子自然萌發(fā)率低等原因，近年來(lái)對(duì)其有較多的研究。內(nèi)生菌與植物的生長(zhǎng)密不可分，鐵皮石斛作為蘭科植物的一種，其生長(zhǎng)與菌根真菌存在聯(lián)系[33]，因此對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生菌的研究也越來(lái)越多。目前對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生菌的研究主要為內(nèi)生菌的分離鑒定、內(nèi)生菌的多樣性以及促生菌的篩選。在研究范圍和研究深度上還有欠缺。傳統(tǒng)內(nèi)生菌的分離鑒定為組織塊分離法、形態(tài)學(xué)鑒定和分子水平鑒定結(jié)合。陳澤斌等[19，25]突破傳統(tǒng)方法，利用高通量測(cè)序技術(shù)、PCG-DGGE法，鑒定獲得大量菌種，為提高菌種鑒定的準(zhǔn)確性提供了良好的借鑒。促生菌的篩選均選用組培苗進(jìn)行研究，缺乏盆栽試驗(yàn)以及田間試驗(yàn)應(yīng)用。同時(shí)，對(duì)促生作用研究大部分局限于菌體定殖共培養(yǎng)和菌液噴灑灌溉，對(duì)菌體代謝產(chǎn)物研究較少。鐵皮石斛具有抗腫瘤、提高免疫力等藥理作用，其內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物是否也具有這些作用值得更深入的研究。另外，內(nèi)生菌的作用研究?jī)H以促生為主，還可進(jìn)行其他方面的探索，比如病害防治、污染治理等。鐵皮石斛內(nèi)生菌的研究將為提高鐵皮石斛自然生長(zhǎng)率、提高有效物質(zhì)積累以及后續(xù)藥理研究提供重要參考價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-05-22

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究專(zhuān)項(xiàng)(2014C32099)；浙江省“三農(nóng)六方”科技協(xié)作計(jì)劃項(xiàng)目(ZJ-SN-201409)；浙江省農(nóng)業(yè)中藥材新品種選育重大科技專(zhuān)項(xiàng)(2016C02058-3)

龔 鶯(1993—)，女，浙江杭州人，在讀碩士，從事植物病害研究工作，E-mail: gyygrace904@126.com。

毛碧增，研究員，博士，從事植物生物技術(shù)、中藥材品種選育與品質(zhì)改良工作，E-mail: maobz@zju.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170825

S567

A

0528-9017(2017)08-1372-04

文獻(xiàn)著錄格式：龔鶯，何伯偉，王淑珍，等. 鐵皮石斛內(nèi)生菌研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(8)：1372-1375.